利用鋅指核酸酶敲除人乳頭瘤病毒e6e7基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，提供了一種利用鋅指核酸酶敲除高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)E6E7基因的方法，其是根據(jù)高危型HPV E6E7基因序列，設(shè)計靶向特異位點(diǎn)的ZFNs表達(dá)載體，靶向切割細(xì)胞中HPV E6E7基因序列，進(jìn)而敲除目的基因，在感染相應(yīng)亞型HPV的細(xì)胞中可以明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增殖抑制，而對其他亞型HPV陽性的細(xì)胞和HPV陰性的細(xì)胞都無作用。在HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的皮下瘤模型中轉(zhuǎn)染ZFNs表達(dá)載體，能明顯的抑制皮下瘤的生長速度，而且使得瘤重減輕。利用鋅指核酶靶向敲除高危型HPV E6E7基因的方法，能高效的在DNA水平上破壞病毒癌基因，使得HPV感染細(xì)胞發(fā)生凋亡和增殖抑制，對于HPV感染相關(guān)性疾病特別是宮頸上皮內(nèi)瘤變等癌前病變有巨大的治療價值。
【專利說明】利用鋅指核酸酶敲除人乳頭瘤病毒E6E7基因的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，該公開內(nèi)容包括針對高危型人乳頭瘤病毒E6E7癌基 因序列構(gòu)建靶向的鋅指核酸酶，并利用鋅指核酸酶靶向敲除高危型人乳頭瘤病毒E6E7癌 基因的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是全球女性中僅次于乳腺癌的最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性 惡性腫瘤第二位。在一些發(fā)展中國家其發(fā)病率居首位。據(jù)國際癌癥研究中心估計，每年大約 有3, 710, 200的宮頸癌新發(fā)病例，占所有腫瘤的9. 8%，占女性新發(fā)病例的15%，其中78% 的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國地域廣闊、人口眾多，根據(jù)衛(wèi)生部全國腫瘤防治研究辦公室 組織的大規(guī)模全國人口死亡原因調(diào)查顯示，每年有新發(fā)病例約10萬，占世界宮頸癌新發(fā)病 例總數(shù)的四分之一。
[0003] 人乳頭狀瘤病毒（Human papillomavirus,HPV)特別是16亞型、18亞型等高危型 HPV的感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展最重要的致病原因。HPV通過侵入上皮細(xì)胞的基底層細(xì)胞并 依賴細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制機(jī)制完成自身遺傳物質(zhì)的復(fù)制，這一過程主要依賴于兩個重要的病毒早 期癌蛋白-E6和E7。E6蛋白通過與p53蛋白形成復(fù)合物誘導(dǎo)p53的泛素化降解；E6蛋 白也可以通過直接與P53蛋白結(jié)合干擾其DNA結(jié)合活性而阻礙p53基因的轉(zhuǎn)錄；E7則靶向 滅活RBl家族蛋白并因此激活E2F轉(zhuǎn)錄R子。在E6蛋白和E7蛋白的共同作用下，最終使 得宿主細(xì)胞逃逸細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞增殖。R此，E6與E7已成為HPV相關(guān)腫瘤的預(yù)防和基 因治療的理想靶點(diǎn)。
[0004] 既往發(fā)展的利用革巴向于E6和E7的反義RNA技術(shù)（Hamada，K等，1996,Gynecologic oncology. 63 :219-227)、Ribozymes (核酶）技術(shù)（He，Y 等，1993, FEBS letters. 322 : 21-24)或小干擾 RNA(siRNA)技術(shù)（司馬妮等，2008, Apoptosis. 13 :273-281 ;王薇等， 2010, Cancer letter. 291 :67-75)等基因治療的途徑都已被證明能在一定程度上抑制E6 和E7蛋白的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)宿主細(xì)胞的惡性表型。但是，此類技術(shù)只能靶向于已轉(zhuǎn)錄的RNA， 縱然能在一定程度上抑制相關(guān)基因表達(dá)為蛋白質(zhì)，然而DNA水平上的癌基因依然存在，并 沒有從根本上去除；此外，穩(wěn)定性差，給藥方式的缺陷等進(jìn)一步限制了其在體內(nèi)應(yīng)用的潛力 (Shillitoe, E. J,2006,Cancer gene therapy. 13 :445-450)〇
[0005] 鋅指蛋白核酸酶（zinc finger nucleases, ZFNs)技術(shù)是一種可以在活體細(xì)胞 或組織里對感興趣的基因的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)基因修飾的技術(shù)，已經(jīng)成為一種新興的靶 向基因編輯技術(shù)，能從DNA水平上影響基因的表達(dá)。ZFNs是由一個可定制的靶序列特異 性的DNA結(jié)合域和DNA切割域（主要是非特異性核酸內(nèi)切酶FokI)構(gòu)成的人工合成的融 合蛋白質(zhì)（Kim，Y G等，1996,美國國立科學(xué)院院報.93:1156-1160)。應(yīng)用這種靶向核酸 酶可在預(yù)定的DNA位點(diǎn)上通過FokI的二聚體化發(fā)揮核酶的切割作用，形成雙鏈DNA的 斷裂（double-strand breaks, DSB)。DSB的產(chǎn)生立即啟動細(xì)胞的自我修復(fù)機(jī)制以修復(fù) DSB。主要的修復(fù)機(jī)制有兩種：同源重組（homologous recombination, HR)和非同源末端 連接（non-homologous end joining，NHEJ) (Chapman，J R 等，2012，Molecular cell. 47 ： 497-510)。同源重組一般是以另一條姐妹染色單體為模板進(jìn)行精確的修復(fù)，是一種高保真 的修復(fù)方式；非同源末端連接是真核生物細(xì)胞在不依賴DNA同源序列的條件下，為避免DNA 斷裂造成的DNA降解對細(xì)胞生存的影響，強(qiáng)行將兩個DNA斷端直接連接在一起的特殊的DNA 修復(fù)機(jī)制，這種修復(fù)方式極易在修復(fù)位點(diǎn)處引入小片段基因的插入或缺失，造成框移突變。 而在哺乳動物細(xì)胞中，后一種修復(fù)方式又占據(jù)著主導(dǎo)作用。因此，應(yīng)用ZFNs，即可通過在特 異的DNA位點(diǎn)上誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB，再借助細(xì)胞通過非同源末端連接方式修復(fù)，在特異的DNA位 點(diǎn)上小片段基因的插入或缺失，造成框移突變，最終達(dá)到基因敲除的目的（圖1)。
[0006] ZFNs已在細(xì)胞系和廣泛的生物組織中實現(xiàn)基因修飾。靶向于HBV的ZFNs能有效 切割 HBV 病毒序列（Cradick，T J 等，2010, Molecular Therapy. 189:947-954)，在成人 T 細(xì)胞白血病模型中應(yīng)用革巴向于人T細(xì)胞白血病病毒1型（human T cell leukemia virus type I，HTLV-1)的 ZFNs 能有效殺滅HTLV-I 感染的細(xì)胞（Tanaka，A 等，2013, Leukemia. 27 : 1621-1627)。此外，體內(nèi)外實驗已經(jīng)證實靶向于HIV受體CCR5的ZFNs能有效的預(yù)防HIV-I 的感染（Perez，E E 等，2008，Nature Biotechnology. 26 :808-816)，目前已被FDA批準(zhǔn)進(jìn)行 臨床II期試驗，且臨床試驗結(jié)果證實體內(nèi)應(yīng)用ZFNs是有效并且安全無毒的（Tebas，P等， 2014, The New England Journal of Medicine. 370 :901-910)〇
[0007] 針對高危型HPV病毒E6E7癌基因的ZFNs是由本實驗室構(gòu)建合成的，并經(jīng)過大量 的實驗對構(gòu)建的ZFNs進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，前期的研究結(jié)果顯示，靶向于高危型HPV16和 HPV18的癌基因 E6E7基因的ZFNs能有效的切割E6E7DNA序列，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)亞型HPV感染 陽性的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實靶向E6E7的ZFNs能在體內(nèi)有效的 切割E6E7基因序列，并阻止實體瘤的進(jìn)展。
[0008] 本發(fā)明旨在利用人工構(gòu)建的靶向于高危型的HPV E6E7基因的ZFNs，誘導(dǎo)相應(yīng)亞 型HPV陽性細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞凋亡，阻斷或逆轉(zhuǎn)高危型HPV感染患者宮頸上皮內(nèi)瘤變 Cervical intraepithelial neoplasia, CIN)的病情進(jìn)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種利用鋅指核酸酶技術(shù)敲除高危型人乳頭瘤病毒E6E7基 因的方法。
[0010] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用鋅指核酸酶敲除人乳頭瘤病毒E6E7基 因的方法，包括如下步驟：
[0011] 1)根據(jù)高危型人乳頭瘤病毒E6E7基因序列，設(shè)計ZFN對，其作用的DNA序列分別 為：HPV16 和 HPV18E6E7 堿基序列（NCBI 數(shù)據(jù)庫 RefSeq :NC_001526. 2 和 NC_001357. 1)
[0012] 2)構(gòu)建ZFNs的真核表達(dá)載體。由于ZFNs是以二聚體的形式發(fā)揮作用（圖1)，因 此每個作用位點(diǎn)都需要兩個鋅指核酶表達(dá)元件，以靶向HPV16E7基因603為例，ZFN16-603L 和ZFN16-603R兩個鋅指核酶需要同時表達(dá)才能發(fā)揮敲除HPV16E7基因的功能，在構(gòu)建表達(dá) 載體的時候可分別構(gòu)建ZFN16-603L和ZFN16-603R兩個真核表達(dá)載體，將兩個真核表達(dá)載 體同時轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中即可同時表達(dá)兩個鋅指核酶，在HPV16E7基因603位點(diǎn)處發(fā)揮切割作 用，進(jìn)而達(dá)到敲除HPV16E7基因的目的。
[0013] 選定位點(diǎn)后，即可將成對ZFNs構(gòu)建到表達(dá)載體pcDNA3. 1+上，通過測序確保堿基 序列正確。
[0014] 3)本發(fā)明提供利用鋅指核酶特異性的敲除高危型HPV16和HPV18的E6E7基因的 方法。所述特異性指HPV亞型的特異性，以HPV16E6E7基因為例，靶向HPV16E6E7基因的 ZFNs僅能特異性的敲除HPV16E6E7基因，對HPV18以及其他HPV亞型的E6E7基因無敲除作 用。
[0015] 4)本發(fā)明提供利用鋅指核酶特異性誘導(dǎo)相應(yīng)HPV亞型陽性細(xì)胞的凋亡增加和促 進(jìn)增殖抑制。所述特異性指HPV亞型陽性細(xì)胞的特異性，以靶向HPV16E6E7基因的ZFNs為 例，僅能特異性的誘導(dǎo)HPV16陽性的細(xì)胞（如SiHa等）的凋亡增加和增殖抑制，對HPV18 陽性的細(xì)胞（如HeLa等）和HPV陰性的細(xì)胞（如HEK293等）無促進(jìn)凋亡和抑制增殖的作 用。
[0016] 5)本發(fā)明提供利用鋅指核酸酶特異性的抑制動物模型中相應(yīng)HPV亞型陽性細(xì)胞 系所構(gòu)建的皮下瘤的生長的方法。以靶向HPV16E6E7基岡的ZFNs為例，僅能特異性的抑制 SiHa細(xì)胞（HPV16陽性）皮下瘤的生長，對HeLa細(xì)胞（HPV18陽性）皮下瘤無抑制作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為鋅指核酸酶結(jié)合并敲除高危型HPV16或HPV18E6E7基因作用示意圖。
[0018] 圖2為實施例中應(yīng)用靶向HPV16E6E7基因的ZFN16-603誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡增加。 圖中Blank代表未處理的SiHa細(xì)胞凋亡率，Vector代表空載體（僅含有FokI切割域，不含 有DNA識別結(jié)構(gòu)域）轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞凋亡率，ZFN16-603代表ZFN16-603轉(zhuǎn)染后的SiHa 細(xì)胞凋亡率。
[0019] 圖3為實施例中應(yīng)用靶向HPV16E6E7基因的ZFN16-603未能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡 增加。圖中Blank代表未處理的HeLa細(xì)胞凋亡率，Vector代表空載體（僅含有FokI切割 域，不含有DNA識別結(jié)構(gòu)域）轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞凋亡率，ZFN16-603代表ZFN16-603轉(zhuǎn)染 后的HeLa細(xì)胞凋亡率。
[0020] 圖4為實施例中應(yīng)用靶向HPV16E6E7基因的ZFN16-603未能誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋 亡增加。圖中Blank代表未處理的HEK293細(xì)胞凋亡率，Vector代表空載體（僅含有FokI 切割域，不含有DNA識別結(jié)構(gòu)域）轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞凋亡率，ZFN16-603代表ZFN16-603 轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞凋亡率。
[0021] 圖5為實施例中裸鼠皮下瘤內(nèi)應(yīng)用ZFN16-603能抑制SiHa細(xì)胞皮下瘤的生長。圖 中橫坐標(biāo)標(biāo)示時間為開始瘤內(nèi)注射ZFN16-603后的時間。0代表第一次瘤內(nèi)注射ZFN16-603 的時間，以后每3天瘤內(nèi)注射一次，同時測量瘤體的長短徑并計算瘤體體積。
[0022] 圖6為實施例中裸鼠皮下瘤內(nèi)應(yīng)用ZFN16-603共計18天后的皮下瘤圖片。

【具體實施方式】
[0023] 以下實施例僅用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 本實施例中使用的引物設(shè)計均使用Primer3Plus在線引物設(shè)計工具完成，合成由 武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司；構(gòu)建所使用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR純 化回收試劑盒、膠回收試劑盒均購自美國Fermentas公司。
[0025] 例I. ZFN16-603表達(dá)載體的構(gòu)建
[0026] HPV16的E6E7癌基因序列信息從NCBI網(wǎng)站中獲得，將序列導(dǎo)入到在線設(shè)計工具 ZiFiTQittp ://zifit. partners. org/ZiFiT/)中，完成設(shè)計。挑選出革巴向于第603堿基的 ZFNs對，命名為ZFN16-603。其靶向的DNA序列為：
[0027] ZFN16-603 ：CAG AGG AGG AGG ATGAAA TAG ATG GTC CAG
[0028] 下劃線部分為鋅指蛋白結(jié)合序列，中間部分為FokI內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)。對應(yīng)的 ZFNs表達(dá)載體分別命名為ZFN16-603F和ZFN16-603R。
[0029] 鋅指核酶的表達(dá)載體構(gòu)建方法參考Wright, D A等，Nature Protocol雜志， (2006) 1 :1637-1652,構(gòu)建使用載體為 pcDNA3. 1+(美國 Invitrogen 公司，貨號：V790-20)。
[0030] 構(gòu)建完成后，通過常規(guī)測序比對確定構(gòu)建載體序列正確無突變，挑選出完全正確 的克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。
[0031] 例2. ZFN16-603誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
[0032] 靶向于HPV16E6E7的ZFN16-603轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后表達(dá)出來的鋅指核酶，可以迅速的 識別并與靶序列結(jié)合，再發(fā)揮切割作用，使其在靶點(diǎn)處產(chǎn)生DSB，DSB啟動細(xì)胞利用易錯的 NHEJ修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)；由于修復(fù)時引起的堿基插入或缺失導(dǎo)致密碼子的框移突變，最終 使得HPV16E6E7蛋白的表達(dá)受到抑制。而E6E7蛋白可通過一系列的機(jī)制使得宮頸癌細(xì)胞增 殖能力增強(qiáng)并逃逸凋亡，E6E7蛋白的表達(dá)受到抑制后，細(xì)胞的增殖能力下降，凋亡增加。另 一方面，ZFN16-603僅能特異性的識別并結(jié)合HPV16E6E7序列，不能識別其他亞型如HPV18 的E6E7序列。因此，ZFN16-603僅能引起HPV16陽性細(xì)胞的凋亡（如SiHa細(xì)胞），而對 HPV18陽性的細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞）和HPV陰性的細(xì)胞（如HEK293細(xì)胞）等無此作用。 [0033] 具體操作方法是：
[0034] (1)細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0035] HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞系SiHa、HPV18陽性宮頸癌細(xì)胞系HeLa和人胚腎細(xì)胞系 冊1(293用含有10%血清的01^1完全培養(yǎng)基在371：、5%〇)2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度 達(dá)到80 %時用0. 25 %的胰酶消化后，用DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，接種到12孔板中，繼續(xù) 培養(yǎng)24小時。
[0036] (2)表達(dá)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染
[0037] 24小時后，確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞融合度達(dá)到70%，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔 轉(zhuǎn)染 500ng ZFN16-603F 和 500ng ZFN16-603R (共計 1 μ g)，使用 Invitrogen 公司的 Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑按照說明書要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以等量的空載體（共計1 μ g)作 為陰性對照。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0038] (3)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞凋亡的檢測
[0039] 轉(zhuǎn)染48小時后，相差顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入ZFN16-603F+ZFN16-603R的SiHa 細(xì)胞有大量的變圓漂起（提示細(xì)胞凋亡），而同樣轉(zhuǎn)入ZFN16-603F+ZFN16-603R的HeLa和 HEK293細(xì)胞無此現(xiàn)象。使用0. 25%的胰酶消化后，收集細(xì)胞，常溫條件下300g離心5分鐘， PBS洗滌一次，再常溫條件下300g離心5分鐘。使用南京凱基生物的Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號：KGA-107)BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。
[0040] 試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入ZFN16-603處理的SiHa細(xì)胞凋亡率達(dá)到50 %，而轉(zhuǎn)入等 量空載體的SiHa細(xì)胞凋亡與未處理的SiHa細(xì)胞相比無明顯差別，均在5 %左右。轉(zhuǎn)入 ZFN16-603的HeLa細(xì)胞凋亡率未見明顯增加，與轉(zhuǎn)入等量空載體的和未處理的HeLa細(xì)胞的 凋亡率基本持平，均在10%以下。同樣，轉(zhuǎn)入ZFN16-603或等量空載體的HEK293細(xì)胞也未 見明顯的凋亡增加。
[0041] 例3. ZFN16-603的切割效率驗證
[0042] 鋅指核酶在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用后切割形成DSBs，誘導(dǎo)細(xì)胞利用易錯的NHEJ修復(fù)方 式進(jìn)行修復(fù)。修復(fù)后在靶向位點(diǎn)處造成堿基的插入或缺失，進(jìn)而引起框移突變，達(dá)到基因敲 除的目的。此時，這種錯誤修復(fù)的堿基序列若與正常的（野生型的）堿基序列進(jìn)行退火延 伸，即可形成雜交雙鏈，這種雜交雙鏈在原位點(diǎn)處就會發(fā)生堿基的錯配（與修復(fù)后的堿基 插入或缺失相對應(yīng)），再利用能識別并切割序列中這種錯配堿基的T7Endonuclease I (New England Biolabs公司，貨號：M0302S)進(jìn)行處理，即可間接的反映 ZFN的切割效率。由于轉(zhuǎn) 染效率的限制，成功轉(zhuǎn)入后的細(xì)胞被ZFN16-603有效的切割，而未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組 中HPV E6E7序列未受影響。因此，提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總基因組DNA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物中 即可同時獲得含有錯誤修復(fù)的序列片段和未受影響的野生型的序列片段，與野生型序列片 段相比，切割后修復(fù)的片段在靶點(diǎn)處存在數(shù)個堿基或者小片段的插入或缺失突變，將此種 混合產(chǎn)物進(jìn)行退火再延伸，即可產(chǎn)生特殊的雜交雙鏈，這種雙鏈在切割位點(diǎn)處存在堿基錯 配，可以通過T7 Endonuclease I內(nèi)切酶識別這種錯配并將其切斷而形成兩個小片段產(chǎn)物。
[0043] 本試驗具體實施方法如下：
[0044] (1)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞基因組DNA的提取
[0045] 將設(shè)計的針對HPV16 E6E7的ZFN16-603表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到SiHa中（轉(zhuǎn)染體系：十二 孔板，每孔轉(zhuǎn)入500ng+500ng，總量1 μ g，轉(zhuǎn)染方法同實施例2)，轉(zhuǎn)染48小時后，0. 25%的胰 酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，常溫300g離心5分鐘，棄除培養(yǎng)基，PBS洗滌一次， 300g離心5分鐘，再用細(xì)胞基因組提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司，貨號：DP304) 提取細(xì)胞基因組DNA。
[0046] ⑵引物的設(shè)計
[0047] 根據(jù)HPV16 E6E7基因序列設(shè)計引物，引物兩端跨靶點(diǎn)（產(chǎn)物長度控制在400? 500bp效果最好，并且靶點(diǎn)距離兩段的距離應(yīng)當(dāng)差別50bp以上以便在凝膠電泳時能有效的 區(qū)分切開的兩個小片段）。本實施例中與ZFN16-603相對應(yīng)的引物序列為：
[0048] 603F ：caaaagccactgtgtcctga
[0049] 603R :ggggcacacaattcctagtg
[0050] 設(shè)計PCR產(chǎn)物長度約400bp，引物兩端距離ZFN16-603切割位點(diǎn)的長度分別約 150bp 和 250bp。
[0051] (3) PCR反應(yīng)及PCR產(chǎn)物的純化。以上述提取的ZFN16-603轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞基 因組DNA為模板進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物純化回收后定量備用。
[0052] (4)T7Endonuclease I酶切反應(yīng)及聚丙烯凝膠電泳
[0053] 取200ng純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行如下反應(yīng)：
[0054] 反應(yīng)體系：
[0055]
[0056] 反應(yīng)條件：

【權(quán)利要求】
1. 一種利用鋅指核酸酶敲除高危型人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18亞型的E6E7癌基因 的方法，是根據(jù)高危型人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18的E6E7癌基因序列，設(shè)計針對特異位 點(diǎn)ZFNs的表達(dá)載體，其特征在于，設(shè)計特異的鋅指核酸酶ZFNs表達(dá)序列，其表達(dá)的融合蛋 白質(zhì)靶向的DNA序列為NCBI數(shù)據(jù)庫中RefSeq為NC_001526. 2和NC_001357. 1中針對E6 和E7⑶S區(qū)序列的任何一個靶點(diǎn)。
2. 如權(quán)利要求1所述的鋅指核酸酶，其針對的靶點(diǎn)為野生型以及突變型高危型人乳頭 瘤病毒HPV16和HPV18的E6E7癌基因序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的鋅指核酸酶，其中所述核酶為天然的或人工改造的IIS型限制 性內(nèi)切核酶。
4. 一種多核苷酸，其編碼的蛋白質(zhì)是權(quán)利要求1?3中任一項所述的鋅指核酸酶。
5. -種表達(dá)序列，其編碼的蛋白質(zhì)能識別并結(jié)合在高危型人乳頭瘤病毒HPV16和 HPV18的E6E7癌基因序列上，并由所述的鋅指核酸酶切割高危型人乳頭瘤病毒HPV16和 HPV18的E6E7癌基因序列上的特定位點(diǎn)。
6. 利用權(quán)利要求1中所述的方法實現(xiàn)靶向切割高危型人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18的 E6E7癌基因序列在基因治療中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/55GK104404076SQ201410648225
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】馬丁, 汪輝, 胡爭, 丁文成, 于蘭 申請人:珠海雅馬生物工程有限公司