專利名稱：可代謝己烯雌酚的假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物進行環(huán)境治理領(lǐng)域，具體地說是可代謝己烯雌酚的假單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
己烯雌酌·(DES, Diethylstilbestrol),化學名為 4,4 (I, 2_ 二乙基-I, 2_ 亞乙烯基)雙苯酚，是一種人工合成的非留體雌激素類藥物，能促使女性器官及副性征正常發(fā)育，促使子宮內(nèi)膜增生，增強子宮收縮，提高子宮催產(chǎn)素的敏感性；小劑量刺激而大劑量抑制垂體前葉促性腺激素及催乳素的分泌。20世紀70年代后期，由于發(fā)現(xiàn)DES具有生殖和遺傳毒性(包括致癌和致畸作用)，美國自1959年就開始限制DES應(yīng)用于畜禽飼養(yǎng)，并于1979年正式禁止作為添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，在動物源性食品中不得檢出。1998年，歐盟也禁止使用DES作為牲畜促生長劑，并且在進口動物食品中嚴格監(jiān)控其殘留。我國也于2002年禁·止己烯雌酚及其酯類在動物源性食品中的應(yīng)用。但是，目前DES仍然被大量的用于動物飼料添加劑。DES通過藥物代謝等途徑排出體外，進入到環(huán)境中嚴重污染水源和土壤環(huán)境。環(huán)境中的DES能通過食物鏈形式又重新危害人體和污染環(huán)境，形成惡性循環(huán)。己烯雌酚在環(huán)境中的殘留易致兒童性早熟、生長發(fā)育遲緩、男子女性化，而女性易發(fā)生乳腺癌、卵巢癌等?，F(xiàn)在關(guān)于處理和降解環(huán)境中己烯雌酚的研究相對較少，已經(jīng)發(fā)展的關(guān)于己烯雌酚的降解有利用鐵草酸鹽體系對DES進行光氧化、紫外殺菌燈對水中DES進行直接光降解等方法。有關(guān)利用環(huán)境中的微生物降解己烯雌酚的研究尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用細菌自身的代謝，降低環(huán)境中己烯雌酚的濃度的假單胞菌及其應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種可代謝己烯雌酚的假單胞菌可代謝己烯雌酚的假單胞菌(Pseudomonassp. )J61，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)登記保藏；保藏日期為 2011 年 04 月 28 日；編號為 CGMCC No. 4705?？纱x己烯雌酚的假單胞菌的應(yīng)用可代謝己烯雌酚的假單胞能夠降解己烯雌酚。所述假單胞降解己烯雌酚的降解步驟為(I) J61種子培養(yǎng)將假單胞菌培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200rpm/min，培養(yǎng)時間為10_16h ；(2) J61降解己烯雌酚將步驟⑴中的J61菌體按起始濃度I. OX 108CFU/ml接種于含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，而后將培養(yǎng)物的上清液通過高效液相色譜(HPLC)檢測剩余己烯雌酚的量，即可得到假單胞菌降解己烯雌酚的效率。所述HPLC的檢測方法為液相色譜儀skyray LC-310液相色譜系統(tǒng)；色譜柱Waters C18反向柱4· 6X 250mm，粒度5 μ m ;檢測條件為流動相，V(甲醇)V(水)=85 15 ;進樣量為20 μ L ;溫度為25°C ;紫外檢測器檢測參數(shù)為檢測波長280nm。所述LB培養(yǎng)基為每升水中加入IOg胰蛋白胨，5g酵母浸膏和IOg氯化鈉。所述最小培養(yǎng)基的配方為每升水中加入1360mg磷酸二氫鉀，1780mg磷酸氫二鈉，500. 08mg硫酸鎂，500mg氯化銨,0. Img氫氧化招,O. 05mg 二氧化錫,O. 05mg碘化鉀，
O.05mg氯化鋰,O. 05mg硼酸,O. Img硫酸鋅,O. Olmg氯化鈷,O. Olmg硫酸鎳,O. 05mg氯化鋇和 O. 05mg 鑰酸銨，ρΗ，7·2±0· I。在含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的假單胞菌，取其上清液，加入等體積的乙醇，室溫靜止IOmin,在13，OOOrpm轉(zhuǎn)速下離心5min,上清用O. 22 μ m的濾膜過濾待用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是·
目前，通過細菌代謝過程降解環(huán)境污染物在重金屬富集、有機污染的降解和石油降解中均有應(yīng)用。該假單胞菌降解環(huán)境中的己烯雌酚，具有降解速度快、費用低、操作步驟簡單等優(yōu)點，為徹底清除環(huán)境中的己烯雌酚殘留提供了較好的思路。


圖I為本發(fā)明實施例提供的利用本發(fā)明的假單胞菌CGMCC No. 4705處理前后己烯雌酚濃度的HPLC譜圖。圖2為本發(fā)明實施例提供的假單胞菌J61的16S rDNA的序列。圖3為本發(fā)明實施例提供的假單胞菌J61降解己烯雌粉后，培養(yǎng)液上清中己烯雌酚的相對殘留量隨時間的變化。圖中，橫坐標為天數(shù)，縱坐標為己烯雌酚的相對殘留量。(■，未接種細菌的溶液中己烯雌酚的相對殘留；口，接種假單胞菌J61后培養(yǎng)液中己烯雌酚的相對殘留量)。圖4為本發(fā)明實施例提供的假單胞菌J61降解不同濃度的己烯雌酚的降解效率。圖中，橫坐標為天數(shù)，縱坐標為己烯雌酚的相對降解效率。圖5為本發(fā)明實施例提供的假單胞菌J61在不同pH環(huán)境下降解己烯雌酚的效率。圖中，橫坐標為pH，縱坐標為己烯雌酚的相對降解效率。圖6為本發(fā)明實施例提供的己烯雌酚及假單胞菌J61降解后產(chǎn)物的細胞毒性。細胞培養(yǎng)孔中加入PBS(a);未接種細菌的含有己烯雌酚的培養(yǎng)基上清液(b);接種假單胞菌J61后的含有己烯雌酚或/和其代謝產(chǎn)物的上清液(c)。
具體實施例方式實施例I :假單胞菌J61的篩選及16S rDNA的獲取將采集的海水樣品涂布到含有IOppm己烯雌酚固體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)2天。將單克隆細菌接種至無機鹽蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24小時，然后將細菌分別接種至含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。利用HPLC測定分析細菌降解前后溶液中己烯雌酚含量的變化。J61能夠在以乙醇為唯一碳源的情況下降解環(huán)境中的己烯雌酚。在平板上生長的假單胞菌J61邊緣不劑齊，扁平濕潤，不出現(xiàn)單菌落。收集處于穩(wěn)定期的假單胞菌J61，提取該菌的基因組DNA。具體步驟為(1)30°C過夜培養(yǎng)的J61菌株按I %的體積比接種到含有IOml LB培養(yǎng)基(每升水中加入IOg胰蛋白胨，5g酵母浸膏和IOg氯化鈉)的試管中，待細菌的OD_ I. O左右時,取ImL菌液于I. 5mL離心管中10，OOOg離心Imin收集菌體。。(2)向菌體中加ImL O. 9% NaCl洗漆沉淀，10, OOOg離心3min。(3)棄上清，向沉淀中加 450 μ L TE 緩沖液(12mM Tris-HCl, 12mMEDTA,pH 8. O)重新懸浮沉淀，再加入50 μ L 20%的SDS’輕輕的上下顛倒離心管使之混勻，75°C水浴中放置5min，至菌液裂解變澄清。(4)加500 μ L的苯酚-氯仿(體積比3 : I)抽提，輕輕顛倒使之混勻，室溫靜置5min 后 10, OOOg 離心 5min。(5)將上清轉(zhuǎn)移至一新的1.5mL離心管并用TE緩沖液補足體積到500 μ L，加
500μ L的苯酚-氯仿(體積比3:1)，混勻室溫靜置5min后10，OOOg離心5min。再將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，如此反復，直至看不到中間的蛋白質(zhì)層為止?！?6)上清轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管并用TE緩沖液補足到500yL，加500μ L氯仿，輕輕混勻后10，OOOg離心5min。(7)上清轉(zhuǎn)移至一新的I. 5mL離心管，加入上清液1/10體積的3M NaAc混勻，然后加入與上清液等體積的異丙醇，上下顛倒幾次，此時應(yīng)看到有絮狀沉淀產(chǎn)生，10, OOOg離心5min。(8)棄上清，加入ImL 70%的乙醇洗滌沉淀，10，OOOg離心5min，盡量吸干液體，室溫干燥約IOmin。(9)加入50 μ L含有終濃度為10_20mg/mL RNaseA的TE緩沖液溶解DNA。利用8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(GGTTACCTTGTTACG ACTT)為引物，提取的J61基因組DNA為模板，PCR擴增其16S rDNA并進行鑒定。PCR的條件為94°C變性4min，94°C變性30s，57°C退火lmin，72°C延伸lmin，從第二步開始，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因進行測序。DNA測序片段見圖2。實施例2 :細菌培養(yǎng)液上清中己烯雌酚的含量隨時間變化過程將起始濃度為I. OX 108CFU/mL的假單胞菌J61接種至含有終濃度為IOppm己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中。搖瓶裝液量30%，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200rpm/min。每隔24小時取出500 μ L的細菌培養(yǎng)液，并加入500 μ L的乙醇，室溫靜置10分鐘。10，OOOrpm離心棄沉淀,上清液過濾除菌后，利用HPLC分析培養(yǎng)液上清中剩余的己烯雌酹的含量。以未接種J61的含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基作為對照，以己烯雌酚的初始加入量為100%，接種假單胞菌J61后細菌培養(yǎng)液上清中己烯雌酚的相對含量隨時間變化的過程見圖3。在接種假單胞菌J61，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，溶液中己烯雌酚的含量降低了 85%，但是隨著時間的增加，上清中剩余己烯雌酚的含量變化不是很大。可見，接種假單胞菌J61能夠快速降低環(huán)境中己烯雌粉的含量。所述HPLC的檢測方法為液相色譜儀skyray LC-310液相色譜系統(tǒng)；色譜柱Waters C18反向柱4. 6X250mm，粒度5 μ m ;檢測條件為流動相，V(甲醇)V(水)=85 15 ;進樣量為20 μ L ;溫度為25 V ;紫外檢測器檢測參數(shù)為檢測波長280nm。所述最小培養(yǎng)基的配方為每升水中加入1360mg磷酸二氫鉀，1780mg磷酸氫二鈉,500. 08mg硫酸鎂，500mg氯化銨,0. Img氫氧化招,O. 05mg 二氧化錫,0. 05mg碘化鉀,0. 05mg氯化鋰,0. 05mg硼酸，O. Img硫酸鋅，O. Olmg氯化鈷,0. Olmg硫酸鎳，O. 05mg氯化鋇和O. 05mg鑰酸銨，pH,7.2±0· I。實施例3 :利用假單胞菌J61處理含有不同濃度己烯雌酚的溶液將起始濃度為I. OX 108CFU/mL的假單胞菌J61分別接種至含有終濃度為5，10，20，40和80ppm己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中。搖瓶裝液量30%，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200rpm/min。24小時后取出500 μ L的細菌培養(yǎng)液，并加入500 μ L的乙醇，室溫靜置10分鐘。10，OOOrpm離心棄沉淀，上清液過濾除菌后，利用HPLC分析培養(yǎng)液上清中剩余的己烯雌酚的含量。所述HPLC的檢測方法如實施例2。以未接種J61的含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基作為對照。以各種不同的濃度條件下己烯雌酚的初始加入量為100%，接種假單胞菌J61后細菌降解己烯雌酚的效率隨不同的己烯雌酚起始濃度變化過程見圖4?？梢?，己烯雌酚的濃度小于40ppm時，隨著己烯雌酚濃度的增加，細菌降解效率隨著環(huán)境中己烯雌粉濃度的增加而增加；而當培養(yǎng)液中己烯雌酹的濃度從40ppm增加到80ppm時，降解效 率并無發(fā)生明顯變化。實施例4 :不同pH值影響下假單胞菌J61降解己烯雌酚效率的變化將起始濃度為I. OX 108CFU/mL的假單胞菌J61分別接種至含有終濃度為IOppm己烯雌酚的不同pH的最小培養(yǎng)基中。搖瓶裝液量30%，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200rpm/min。24小時后取出500 μ L的細菌培養(yǎng)液，并加入500 μ L的乙醇，室溫靜置10分鐘。10，OOOrpm離心棄沉淀，上清液過濾除菌后，利用HPLC分析培養(yǎng)液上清中剩余的己烯雌酚的含量。所述HPLC的檢測方法如實施例2。以未接種J61的含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基作為對照。以各種不同的PH條件下己烯雌酚的初始加入量為100%，接種假單胞菌J61后細菌降解己烯雌酚的效率隨不同的pH變化過程見圖5?？梢?，pH 7.0是假單胞菌J61降解己烯雌酚的最佳pH，偏離此pH會引起假單胞菌J61降解己烯雌酚的效率急劇下降。實施例5 己烯雌酚經(jīng)細菌降解后的產(chǎn)物的細胞毒性將起始濃度為1.0X 108CFU/mL的假單胞菌J61分別接種至含有終濃度為IOppm己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中。搖瓶裝液量30%，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200rpm/min,以未接種細菌的含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基上清液作為對照。24小時后取出500 μ L的培養(yǎng)液，加入500 μ L的乙醇，室溫靜置10分鐘。10，OOOrpm離心棄沉淀，上清液過濾除菌后，利用HPLC分析接種細菌和未接種細菌兩種條件下己烯雌酚的含量，所述HPLC的檢測方法如實施例2。并將過濾除菌的上清分別加入到已經(jīng)在96孔板上貼壁的Hela細胞中，8小時后在倒置顯微鏡下觀察細菌形態(tài)的變化，觀察結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，己烯雌酚能夠使Hela細胞生長明顯受到抑制，導致其在生長過程中細胞形態(tài)發(fā)生嚴重的變形；而經(jīng)過細菌降解后的己烯雌酚，即含有少量殘留的己烯雌酚或/和其降解產(chǎn)物的細菌培養(yǎng)液上清，對Hela細胞的生長無明顯作用，其處理后的Hela細胞生長狀態(tài)和對照，即PBS，基本一致。
權(quán)利要求
1.一種可代謝己烯雌酚的假單胞菌，其特征在于可代謝己烯雌酚的假單胞菌(Pseudomonas sp.) J61,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)登記保藏；保藏日期為2011年04月28日；編號為CGMCC No. 4705。
2.—種權(quán)利要求I所述的可代謝己烯雌酚的假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于可代謝己烯雌酚的假單胞能夠降解己烯雌酚。
3.按權(quán)利要求2所述的可代謝己烯雌酚的假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于所述假單胞降解己烯雌酚的降解步驟為 (DJ61種子培養(yǎng)將假單胞菌培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200rpm/min，培養(yǎng)時間為 10_16h ； (2)J61降解己烯雌酚將步驟⑴中的J61菌體按起始濃度I. 0X108CFU/ml接種于含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，而后將培養(yǎng)物的上清液通過高效液相色譜(HPLC)檢測剩余己烯雌酚的量，即可得到假單胞菌降解己烯雌酚的效率。
4.按權(quán)利要求3所述的可代謝己烯雌酚的假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于所述HPLC的檢測方法為液相色譜儀skyray LC-310液相色譜系統(tǒng)；色譜柱=Waters C18反向柱4.6X250mm，粒度5μπι;檢測條件為流動相，V(甲醇)V(水)=85 15 ;進樣量為20 μ L ;溫度為25°C ;紫外檢測器檢測參數(shù)為檢測波長280nm。
5.按權(quán)利要求3所述的可代謝己烯雌酚的假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于所述LB培養(yǎng)基為每升水中加入IOg胰蛋白胨，5g酵母浸膏和IOg氯化鈉。
6.按權(quán)利要求3所述的可代謝己烯雌酚的假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于所述最小培養(yǎng)基的配方為每升水中加入1360mg磷酸二氫鉀，1780mg磷酸氫二鈉,500. 08mg硫酸鎂，500mg氯化銨,0. Img氫氧化招，O. 05mg 二氧化錫，O. 05mg碘化鉀,0. 05mg氯化鋰,0. 05mg硼酸，O. Img硫酸鋅，O. Olmg氯化鈷,0. Olmg硫酸鎳，O. 05mg氯化鋇和O. 05mg鑰酸銨，pH,7. 2±0· I。
7.按權(quán)利要求3所述的可代謝己烯雌酚的假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于在含有己烯雌酚的最小培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的假單胞菌，取其上清液，加入等體積的乙醇，室溫靜止IOmin,在13，OOOrpm轉(zhuǎn)速下離心5min,上清用O. 22 μ m的濾膜過濾待用。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用微生物進行環(huán)境治理領(lǐng)域，具體地說是可代謝己烯雌酚的假單胞菌及其應(yīng)用?？纱x己烯雌酚的假單胞菌名為J61，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)登記保藏；保藏日期為2011年04月28日；編號為CGMCC No.4705?？纱x己烯雌酚的假單胞菌能夠降解環(huán)境中的己烯雌酚。本發(fā)明提供的菌株能夠高效降解80ppm的己烯雌酚，借此可開發(fā)出相應(yīng)的環(huán)保生物制劑，顯示出良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A62D3/02GK102911890SQ20111022893
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者張衛(wèi)衛(wèi), 陳令新, 牛宗亮, 殷堃, 劉萍, 徐冬雪, 潘婷 申請人:煙臺海上傳奇生物科技有限公司, 中國科學院煙臺海岸帶研究所