本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種空心mno2復(fù)合納米材料、其制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是威脅人類健康的重大惡性疾病之一。雖然從上世紀(jì)50年代起，數(shù)十年中大量的人力、物力、財力被投入到癌癥的預(yù)防和治療中，但在這方面人類所取得的進(jìn)展十分有限。

在最近幾年，二氧化錳(mno2)納米結(jié)構(gòu)作為腫瘤微環(huán)境(tme)-響應(yīng)的治療診斷試劑的一種引起了大量的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)mno2納米結(jié)構(gòu)在tme中存在的h⁺或谷胱甘肽(gsh)條件下可以分解，產(chǎn)生的mn²⁺離子顯著的增強(qiáng)t1的磁共振成像，可以用于腫瘤特異性的成像與檢測。與此同時，mno2納米結(jié)構(gòu)在tme中過氧化氫(h2o2)的存在下分解成水和氧氣，產(chǎn)生的氧氣可以改善腫瘤的乏氧。這種作用通過研究發(fā)現(xiàn)可以提高多種癌癥治療的效果，例如放射治療和光動力治療，因為在這些治療過程中氧氣具有重要的作用。mno2納米顆粒能夠降解成水溶性的mn²⁺離子并通過腎臟迅速的排泄出體外。與許多不可降解的無機(jī)納米材料相比，這種材料在活體應(yīng)用時不會有長期的毒性。之前報道的mno2納米結(jié)構(gòu)大多是納米顆粒、納米片或與納米材料結(jié)合的納米復(fù)合物，不能實現(xiàn)有效的藥物裝載和精確控制藥物的釋放。

當(dāng)前，已經(jīng)有文獻(xiàn)報道基于mno2的納米復(fù)合物用于癌癥的治療，但是具有以下幾方面的缺點(diǎn)：(1)合成的步驟較為復(fù)雜，很難進(jìn)行大批量的合成。(2)合成的mno2材料的形貌不可控，不利于實驗的重復(fù)。(3)合成的mno2材料大部分是與其他無機(jī)材料相復(fù)合，不利于材料代謝出體外。然而，制備一種合成方法簡單、可大批量生產(chǎn)、重復(fù)性好、容易代謝并將該顆粒同時用于制備癌癥的成像診斷和治療制劑未曾見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種空心mno2復(fù)合納米材料、其制備方法及其應(yīng)用，該制備方法簡單，重復(fù)性較好且制備的空心mno2復(fù)合納米材料容易代謝。

本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料的制備方法，包括以下步驟：

a)將正硅酸乙酯溶解在乙醇和堿性水溶液的混合溶液中，水解，得到實心二氧化硅納米顆粒；

b)將所述實心二氧化硅納米顆粒的水溶液和高錳酸鉀溶液混合，還原反應(yīng)后再刻蝕，得到空心mno2納米顆粒；

c)將所述空心mno2納米顆粒表面依次修飾聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層，得到空心mno2復(fù)合納米材料。

優(yōu)選地，所述步驟a)中水解的溫度為40～50℃，水解的時間為1.5～2.5h。

優(yōu)選地，所述步驟b)中刻蝕的溫度為55～65℃；刻蝕的時間為11～13h。

本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料，包括空心mno2納米顆粒；

及在所述空心mno2納米顆粒表面逐層修飾的聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層；

所述空心mno2納米顆粒的比表面積為350～400m²·g^-1；粒徑為150～200nm。

優(yōu)選地，所述空心mno2納米顆粒、聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層的質(zhì)量比為1:4～6:4～6:4～6。

優(yōu)選地，所述空心mno2復(fù)合納米材料的平均孔徑為3.5～4.5nm。

本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料在制備用于治療癌癥的治療劑中的應(yīng)用；

所述空心mno2納米材料為上述技術(shù)方案所述制備方法制備的空心mno2復(fù)合納米材料或上述技術(shù)方案所述空心mno2復(fù)合納米材料。

優(yōu)選地，所述治療劑中包括二氫卟酚e6和/或鹽酸阿霉素。

優(yōu)選地，所述二氫卟酚e6和鹽酸阿霉素的裝載量分別為17～89％和13～87％。

本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料的制備方法，包括以下步驟：a)將正硅酸乙酯溶解在乙醇和堿性水溶液的混合溶液中，水解，得到實心二氧化硅納米顆粒；b)將所述實心二氧化硅納米顆粒的水溶液和高錳酸鉀溶液混合，還原反應(yīng)后再刻蝕，得到空心mno2納米顆粒；c)將所述空心mno2納米顆粒表面依次修飾聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層，得到空心mno2復(fù)合納米材料。該方法以實心二氧化硅球為模板，一次實驗可以得到大量形貌可控的空心結(jié)構(gòu)的mno2復(fù)合納米材料，重復(fù)性好；在酸性條件下可以完全的分解，通過熒光成像和磁共振成像，證明該納米顆粒在小鼠體內(nèi)會分解產(chǎn)生mn²⁺離子并通過腎臟排出體外。另外，該制備方法制備的空心mno2復(fù)合納米材料具有非常好的水溶性和生物相容性，在水和生理環(huán)境下都具有很好的分散性，可以高效的裝載藥物試劑并在腫瘤部位特定的釋放；能夠?qū)崿F(xiàn)可見光區(qū)的較強(qiáng)的熒光成像以及腫瘤部位特異性的t1磁共振成像；與anti-pd-l1聯(lián)合使用之后，不僅可以對原始腫瘤進(jìn)行有效的殺傷，還能明顯的抑制遠(yuǎn)端腫瘤的生長。實驗結(jié)果表明：該制備方法可以一次合成至少6g空心mno2復(fù)合納米材料；tem表明其可重復(fù)實驗；mno2納米顆粒在中性或堿性條件下是穩(wěn)定的，在弱酸性的環(huán)境中會分解成mn²⁺離子；二氫卟酚e6和鹽酸阿霉素的裝載量分別為17～89％和13～87％；注射納米顆粒24h之后，腫瘤位置的t1磁共振信號有2倍的增強(qiáng)；h-mno2-peg/c&d加激光的聯(lián)合治療組在治療結(jié)束的時候腫瘤的生長速度最慢并且體積最小，腫瘤的體積僅僅增加了2倍。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中合成空心mno2納米材料流程示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料的透射電鏡(tem)圖；

圖3為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料的高緯度環(huán)形暗場掃描的tem元素映射(hhaadf-stem)圖；

圖4為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料在不同溶液中的穩(wěn)定性測試圖；

圖5為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料的孔徑分布曲線與氮?dú)馕脚c脫附的等溫線圖；

圖6為本發(fā)明實施例2中大規(guī)模合成的h-mno2-peg材料的透射電鏡圖；

圖7為本發(fā)明實施例3制備的h-mno2-peg納米在不同ph值下的穩(wěn)定性測試圖；

圖8為本發(fā)明實施例4中藥物在h-mno2-peg材料中的裝載曲線以及在不同ph值下的釋放情況；

圖9為本發(fā)明實施例5中氮?dú)饣蜓鯕猸h(huán)境下激光照射后，單純的ce6或h-mno2-peg/c在4t1細(xì)胞中的光動力治療效果圖；

圖10為本發(fā)明實施例6中h-mno2-peg/c&d在細(xì)胞水平聯(lián)合治療的效果圖；

圖11為本發(fā)明實施例7中h-mno2-peg/c&d在活體水平的熒光和t1磁共振成像；

圖12為本發(fā)明實施例8中h-mno2-peg/c&d在活體水平聯(lián)合治療的效果圖；

圖13為本發(fā)明實施例9中h-mno2-peg/c&d與anti-pd-l1聯(lián)合治療后，對小鼠原始腫瘤以及遠(yuǎn)端腫瘤的治療結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料的制備方法，包括以下步驟：

a)將正硅酸乙酯溶解在乙醇和堿性水溶液的混合溶液中，水解，得到實心二氧化硅納米顆粒；

b)將所述實心二氧化硅納米顆粒的水溶液和高錳酸鉀溶液混合，還原反應(yīng)后再刻蝕，得到空心mno2納米顆粒；

c)將所述空心mno2納米顆粒表面依次修飾聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層，得到空心mno2復(fù)合納米材料。

本發(fā)明提供的制備方法簡單，是以實心二氧化硅球為模板，一次實驗可以得到大量形貌可控的空心結(jié)構(gòu)的材料，具有簡單的合成步驟、較好的可重復(fù)性以及較高的產(chǎn)率。

本發(fā)明將正硅酸乙酯溶解在乙醇和堿性水溶液的混合溶液中，水解，得到實心二氧化硅納米顆粒。本發(fā)明優(yōu)選將正硅酸乙酯滴加到所述乙醇和堿性水溶液的混合溶液中。在本發(fā)明中，所述堿性水溶液優(yōu)選選自質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氨水。所述水解的溫度優(yōu)選為40～50℃，更優(yōu)選為45℃；水解的時間優(yōu)選為1.5～2.5h，更優(yōu)選為2h。本發(fā)明優(yōu)選采用水浴加熱的形式滿足水解所需的溫度。本發(fā)明優(yōu)選將水解產(chǎn)物用水洗滌3次，得到實心二氧化硅納米顆粒(ssio2)。

本發(fā)明以得到的實心二氧化硅球為模板，一次實驗可以得到大量形貌可控的空心結(jié)構(gòu)的材料，具有簡單的合成步驟、較好的可重復(fù)性以及較高的產(chǎn)率。

得到實心二氧化硅納米顆粒后，本發(fā)明將所述實心二氧化硅納米顆粒的水溶液和高錳酸鉀溶液混合，還原反應(yīng)后再刻蝕，得到空心mno2納米顆粒(h-mno2材料)。

本發(fā)明將實心二氧化硅納米顆粒分散在水中，得到實心二氧化硅納米顆粒的水溶液。本發(fā)明優(yōu)選在超聲的條件下將高錳酸鉀溶液滴加到實心二氧化硅納米顆粒的水溶液中。還原反應(yīng)的時間優(yōu)選為11～13h，更優(yōu)選為12h。

本發(fā)明優(yōu)選將還原產(chǎn)物離心，得到的沉淀重新分散在水中，再在強(qiáng)堿性溶液中刻蝕，得到空心mno2納米顆粒。在本發(fā)明中，所述強(qiáng)堿性溶液優(yōu)選采用2mol/l的na2co3水溶液。所述刻蝕的溫度優(yōu)選為55～65℃，更優(yōu)選為60℃；刻蝕的時間優(yōu)選為11～13h，更優(yōu)選為12h。本發(fā)明優(yōu)選將空心mno2納米顆粒用水洗滌3次。

得到空心mno2納米顆粒后，本發(fā)明將所述空心mno2納米顆粒表面依次修飾聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層，得到空心mno2復(fù)合納米材料。

本發(fā)明優(yōu)選將聚丙烯胺鹽酸鹽溶液分散在血清瓶中，所述聚丙烯胺鹽酸鹽溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為4.5～5.5mg/ml，更優(yōu)選為5mg/ml；所述聚丙烯胺鹽酸鹽的重均分子量優(yōu)選為15000g/mol。

本發(fā)明優(yōu)選在超聲條件下在聚丙烯胺鹽酸鹽溶液中緩慢加入到空心mno2納米顆粒的水溶液中；所述聚丙烯胺鹽酸鹽(pah)和空心mno2納米顆粒的質(zhì)量比優(yōu)選為4.5～5.5:1，更優(yōu)選為5:1。滴加完聚丙烯胺鹽酸鹽溶液后繼續(xù)優(yōu)選超聲0.4～0.6h，然后在室溫下優(yōu)選攪拌5～7h。本發(fā)明優(yōu)選將溶液在14800rpm下離心得到沉淀并用水洗滌三次，得到pah修飾的h-mno2材料(h-mno2-pah)，即所述聚丙烯胺鹽酸鹽以聚丙烯胺鹽酸鹽層的形式修飾在空心mno2納米顆粒表面。

本發(fā)明將聚丙烯酸(paa)溶液分散在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的血清瓶中；所述聚丙烯酸(paa)溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為4.5～5.5mg/ml，更優(yōu)選為5mg/ml；所述聚丙烯酸的重均分子量優(yōu)選為1800g/mol。

本發(fā)明優(yōu)選在超聲條件下在聚丙烯酸(paa)溶液中緩慢滴加h-mno2-pah溶液；所述聚丙烯酸和h-mno2-pah的質(zhì)量比優(yōu)選為4.5～5.5:1，更優(yōu)選為5:1。滴加完h-mno2-pah溶液后繼續(xù)優(yōu)選超聲0.4～0.6h，然后在室溫下優(yōu)選攪拌5～7h。本發(fā)明優(yōu)選將溶液在14800rpm下離心得到沉淀并用水洗滌三次，得到paa修飾的h-mno2-pah材料(h-mno2-paa)，即所述聚丙烯酸以聚丙烯酸層的形式復(fù)修飾在所述聚丙烯胺鹽酸鹽層表面。

本發(fā)明將h-mno2-pah溶液分散在血清瓶中，在超聲的條件下滴加氨基化的聚乙二醇(mpeg-nh2)；所述氨基化的聚乙二醇為氨基化的支鏈狀聚乙二醇；其重均分子量優(yōu)選為5000g/mol。所述氨基化的聚乙二醇和h-mno2-pah的質(zhì)量比優(yōu)選為4.5～5.5:1，更優(yōu)選為5:1。本發(fā)明優(yōu)選將h-mno2-pah溶液與氨基化的聚乙二醇混合后的溶液采用2mol/l的na2co3溶液調(diào)節(jié)至ph值為8.0；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)反應(yīng)；所述反應(yīng)優(yōu)選在攪拌的條件下進(jìn)行，所述反應(yīng)的時間優(yōu)選為11～13h，更優(yōu)選為12h。反應(yīng)結(jié)束后，本發(fā)明優(yōu)選通過14800rpm離心分離得到h-mno2-peg并用水洗滌三次。

本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料，包括空心mno2納米顆粒；

及在所述空心mno2納米顆粒表面逐層修飾的聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層；

所述空心mno2納米顆粒的比表面積為350～400m²·g^-1；粒徑為150～200nm。

本發(fā)明提供的空心mno2復(fù)合納米材料包括空心mno2納米顆粒。在本發(fā)明中，所述空心mno2納米顆粒的比表面積為350～400m²·g^-1；粒徑為150～200nm，優(yōu)選為170～190nm，更優(yōu)選為180nm。

本發(fā)明提供的空心mno2復(fù)合納米材料包括修飾在所述空心mno2納米顆粒表面的聚丙烯胺鹽酸鹽層。所述聚丙烯胺鹽酸鹽的重均分子量為15000g/mol。

本發(fā)明提供的空心mno2復(fù)合納米材料包括修飾在所述聚丙烯胺鹽酸鹽層表面的聚丙烯酸層。所述聚丙烯酸的重均分子量為1800g/mol。

本發(fā)明提供的空心mno2復(fù)合納米材料包括復(fù)修飾在所述聚丙烯酸層表面的氨基化的聚乙二醇層。所述聚乙二醇的重均分子量為5000g/mol。

在本發(fā)明中，所述空心mno2納米顆粒、聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層的質(zhì)量比優(yōu)選為1:4～6:4～6:4～6，更優(yōu)選為1:5:5:5。

本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料在制備用于治療癌癥的治療劑中的應(yīng)用；

所述空心mno2納米材料為上述技術(shù)方案所述制備方法制備的空心mno2復(fù)合納米材料或上述技術(shù)方案所述空心mno2復(fù)合納米材料。

在本發(fā)明中，所述治療劑優(yōu)選包括二氫卟酚e6和/或鹽酸阿霉素。

在本發(fā)明中，所述二氫卟酚e6和鹽酸阿霉素的裝載量優(yōu)選分別為17～89％和13～87％。

本發(fā)明提供的空心mno2復(fù)合納米材料具有非常好的水溶性和生物相容性，在水和生理環(huán)境下都具有很好的分散性，可以高效的裝載藥物試劑并在腫瘤部位特定的釋放；能夠?qū)崿F(xiàn)可見光區(qū)的較強(qiáng)的熒光成像以及腫瘤部位特異性的t1磁共振成像；對小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，通過熒光和磁共振成像發(fā)現(xiàn)納米顆粒能夠在腫瘤部位有效的富集，可以催化腫瘤部位的過氧化氫，改善腫瘤的乏氧，提高光動力治療的效果并最終實現(xiàn)高效的聯(lián)合治療。研究還發(fā)現(xiàn)該納米顆?？梢砸鹦∈笠幌盗械拿庖叻磻?yīng)，在與anti-pd-l1聯(lián)合使用之后，不僅可以對原始腫瘤進(jìn)行有效的殺傷，還能明顯的抑制遠(yuǎn)端腫瘤的生長；在酸性條件下可以完全的分解，通過熒光成像和磁共振成像，證明了該納米顆粒在小鼠體內(nèi)會分解產(chǎn)生mn²⁺離子并通過腎臟排出體外，證明該納米顆粒在活體水平是完全可代謝的。

為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種空心mno2復(fù)合納米材料、其制備方法及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)地描述，但不能將它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實施例1:制備空心mno2材料(h-mno2-peg)：

(1)將14ml乙醇，2ml水和500μl氨水(30％)混合攪拌并在45℃水浴條件下緩慢滴加100μl正硅酸乙酯反應(yīng)2h，之后用水洗滌三次，得到實心的二氧化硅納米顆粒(ssio2)。

(2)將40mg的ssio2分散在10ml的水中，在超聲條件下將高錳酸鉀(300mg)的水溶液逐滴滴加到溶液中，在攪拌12h之后，通過14800rpm離心獲得沉淀，將沉淀用水洗滌三次并重新分散在水中。

(3)將(2)中得到的材料溶解在2mol/lna2co3的水溶液中，在60℃下反應(yīng)12h，得到空心介孔的二氧化硅顆粒(h-mno2)并用水洗滌三次。

(4)將10ml聚丙烯胺鹽酸鹽(pah，mw＝15000)高分子溶液(5mg/ml)分散在血清瓶中，在超聲條件下緩慢加入5mlh-mno2(2mg/ml)水溶液。滴加完后繼續(xù)超聲0.5h，然后在室溫下攪拌6h。將溶液在14800rpm下離心得到沉淀并用水洗滌三次，獲得pah修飾的h-mno2材料(h-mno2-pah)。

(5)將10ml聚丙烯酸(paa,mw＝1800)高分子溶液(5mg/ml)分散在血清瓶中，在超聲條件下緩慢滴加5mlh-mno2-pah溶液(2mg/ml)。滴加完后繼續(xù)超聲0.5h，然后在室溫下攪拌6h。將溶液在14800rpm下離心得到沉淀并用水洗滌三次，獲得paa修飾的h-mno2-pah材料(h-mno2-paa)。

(6)將10mlh-mno2-paa溶液(5mg/ml)分散在血清瓶中，在超聲條件下緩慢滴加250mg氨基化的支鏈狀聚乙二醇(mpeg-5k-nh2，mw＝5000)，用2mol/l的na2co3將反應(yīng)溶液ph值調(diào)節(jié)到8.0，加入50mg的edc并攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束后，通過14800rpm離心分離得到h-mno2-peg并用水洗滌三次。

圖1為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg復(fù)合納米材料負(fù)載二氫卟酚e6(ce6)和鹽酸阿霉素(dox)的合成示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料的透射電鏡(tem)圖；圖2說明了合成的納米顆粒形貌是球狀并且是空心的結(jié)構(gòu)，h-mno2-peg的尺寸為150nm，該納米層的厚度約為15nm。

圖3為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料的高緯度環(huán)形暗場掃描的tem元素映射(hhaadf-stem)圖；圖3進(jìn)一步確認(rèn)了h-mno2-peg納米層的空心結(jié)構(gòu)以及多種元素的組成。

圖4為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料在不同溶液中的穩(wěn)定性測試圖；不同的溶液包括水、鹽酸緩沖液以及細(xì)胞培養(yǎng)基，由圖4可以看出：h-mno2-peg納米材料在不同溶液中都能夠很好的分散并且材料的粒徑?jīng)]有隨著時間的推移而產(chǎn)生變化，其水合半徑約為180nm。

圖5為本發(fā)明實施例1制備的h-mno2-peg納米材料的孔徑分布曲線與氮?dú)馕脚c脫附的等溫線圖；在圖5中，根據(jù)比表面積測定儀測量得到h-mno2-peg的比表面積和平均的孔徑分別為360m²·g^-1和3.94nm，如此高的比表面積說明h-mno2-peg納米顆粒是空心結(jié)構(gòu)，另一方面由于材料的孔徑較大，可以作為一個藥物載體高效的裝載藥物。

實施例2：h-mno2-peg納米顆粒大規(guī)模合成實驗

為了進(jìn)一步研究材料的合成產(chǎn)率與可重復(fù)性，設(shè)計了以下實驗：

根據(jù)實施案例1中的合成步驟(1)，得到2gssio2并將其分散在300ml水中，在超聲條件下將高錳酸鉀(15g)的水溶液逐滴滴加到水中。攪拌12h之后，通過14800rpm離心獲得沉淀，將沉淀用水洗滌三次并將其溶解在2mol/lna2co3的水溶液中，在60℃下反應(yīng)12h，得到空心介孔的mno2顆粒(h-mno2)并用水洗滌三次。

圖6為本發(fā)明實施例2中大規(guī)模合成的h-mno2-peg材料的透射電鏡圖；在圖6中，根據(jù)實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)一次合成的實驗可以得到6g的材料，證明該材料可以進(jìn)行大規(guī)模的合成。對該合成的材料進(jìn)行tem的表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大規(guī)模合成材料的形貌和尺寸沒有發(fā)生明顯的變化，表明該納米材料可以進(jìn)行大規(guī)模的合成并且具有形貌可控、高產(chǎn)率以及可重復(fù)性等優(yōu)勢。

實施例3：h-mno2-peg納米顆粒在不同ph值下的穩(wěn)定性

h-mno2-peg納米顆粒在不同時間點(diǎn)與多種ph值的pbs(5.5，6.5和7.4)孵育。在特定的時間里，溶液通過紫外-可見光譜儀測量和tem表征，檢驗材料的降解情況。

mno2納米顆粒在中性或堿性條件下是穩(wěn)定的，但是在弱酸性的環(huán)境中會分解成mn²⁺離子。因此，本申請記錄了在不同的時間里，h-mno2-peg納米顆粒與不同ph值(7.4，5.5)的磷酸緩沖液孵育之后的tem圖，見圖7，圖7為本發(fā)明實施例2制備的h-mno2-peg納米在不同ph值下的穩(wěn)定性測試圖。圖7中7a表明h-mno2-peg納米層在ph值7.4的pbs中培養(yǎng)8h之后形貌沒有明顯的變化，證明h-mno2-peg在中性的環(huán)境中是穩(wěn)定的。然而h-mno2-peg在酸性的溶液中顯示隨時間變化而分解，這主要是由于mno2分解成mn²⁺離子。mno2特征吸收峰在ph值為7.4下變化不大，但是在ph值為6.5和ph值為5.5條件下迅速的降低，這一結(jié)果進(jìn)一步說明了h-mno2-peg超靈敏的ph響應(yīng)的降解行為。

實施例4：h-mno2-peg納米顆粒的藥物裝載與釋放

將10ml的h-mno2-peg(0.2mg/ml)溶液與不同濃度的二氫卟酚e6(ce6)和鹽酸阿霉素(dox)混合反應(yīng)12h。之后14800rpm離心分離得到h-mno2-peg/c&d納米顆粒并用水洗滌三次。

為了將h-mno2-peg應(yīng)用于光動力治療，不同濃度的光敏分子ce6可以在超聲條件下與材料孵育，混合溶液在室溫下攪拌12h后除去未裝載上的ce6之后，通過紫外-可見光譜可以計算出ce6的裝載效率。圖8為實施例4中藥物在h-mno2-peg材料中的裝載曲線以及在不同ph值下的釋放情況，在圖8中(a)看出，當(dāng)ce6:mno2的孵育質(zhì)量比為3:1時，ce6可以達(dá)到88.9％的高裝載量。另一方面，dox作為一種常見的抗癌藥物也可以裝載到h-mno2-peg納米層的空心結(jié)構(gòu)中。h-mno2-peg與不同濃度的dox在黑暗中混合反應(yīng)12h之后，通過紫外-可見光譜可以計算出藥物的裝載效率。結(jié)果表明dox的裝載是隨著加入到反應(yīng)溶液中dox的量逐漸增加，最大有效裝載效率可以達(dá)到86.1％。

圖8中(b)表明ce6和dox可以同時裝載到h-mno2-peg納米層的空心結(jié)構(gòu)中，得到兩種藥物共同裝載的h-mno2-peg/c&d納米顆粒。h-mno2-peg/c&d在不同ph值的溶液中藥物的釋放也進(jìn)行了研究。如圖8中(c)，在ph值為7.4的溶液中，ce6和dox這兩種藥物的釋放都十分的緩慢，分別為23％和21％。然而在弱酸性的ph值下(ph值為6.5和ph值為5.5)，ce6(49％和73％)和dox(62％和95％)都會快速的釋放，這主要是由于h-mno2-peg納米顆粒在酸性條件下會分解成mn²⁺離子，因此可以促進(jìn)藥物的釋放。

實施例5：h-mno2-peg/c納米顆粒的光動力治療效果

在光動力治療中，4t1小鼠乳腺癌細(xì)胞在96孔板中與不同濃度的h-mno2-peg/c或單純的ce6培育2h之后，96孔板移動到一個透明的盒子中分別通30min的氧氣和氮?dú)?。之后?xì)胞分別在氧氣和氮?dú)獾沫h(huán)境下，在660nm激光下照射30min。細(xì)胞之后用新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后用mtt檢測細(xì)胞的相對活性。

圖9為實施例5中氮?dú)饣蜓鯕猸h(huán)境下激光照射后，單純的ce6或h-mno2-peg/c在4t1細(xì)胞中的光動力治療效果圖；圖9表明在氧氣的條件下，單純的ce6和h-mno2-peg/c對細(xì)胞都有明顯的殺傷作用，存活率分別為14％和4％。作為對照，在氮?dú)猸h(huán)境下，單純ce6的光動力治療對細(xì)胞的殺傷效果非常有限。但是h-mno2-peg/c組在氮?dú)獾姆ρ鯒l件下，也能有效的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這主要是由于mno2可以催化h2o2并在腫瘤細(xì)胞中原位產(chǎn)生額外的氧氣。因此不同于傳統(tǒng)的光動力治療需要在正常含氧量的條件下才能發(fā)揮作用，裝載了ce6的h-mno2-peg納米顆粒甚至可以在乏氧的環(huán)境下作為有效的光動力治療試劑。

實施例6：h-mno2-peg/c&d納米顆粒在細(xì)胞水平的聯(lián)合治療

在細(xì)胞的聯(lián)合治療中，4t1細(xì)胞與不同濃度的h-mno2-peg/c或h-mno2-peg/c&d在96孔板中培養(yǎng)2h，之后不需要激光照射或在660nm的激光照射下照射30min(5mw·cm^-2)。在繼續(xù)培養(yǎng)1h之后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中并在mtt測試之前繼續(xù)培養(yǎng)24h。

圖10為實施例6中h-mno2-peg/c&d在細(xì)胞水平聯(lián)合治療的效果圖，圖10表明，和單純的光動力(h-mno2-peg/c加光照)或化療(h-mno2-peg/c&d)治療組相比，在不同的藥物濃度下聯(lián)合治療組(h-mno2-peg/c&d加光照)可以更加有效的殺傷細(xì)胞，存活率為5％，表明了這兩種治療方式協(xié)同治療的效果。

實施例7：h-mno2-peg/c&d納米顆粒在活體的成像

活體熒光成像是通過maestro活體熒光成像系統(tǒng)獲得。磁共振成像是通過3.0t的臨床磁共振成像掃描儀收集的，它含有小動物成像的線圈。我們通過靜脈注射h-mno2-peg/c&d之后(mno2＝10mg·kg^-1，ce6＝4.7mg·kg^-1和dox＝4.5mg·kg^-1)，在4t1荷瘤的balb/c小鼠模型上，通過活體熒光成像和t1磁共振成像追蹤納米顆粒在小鼠體內(nèi)的分布。

圖11為實施例7中h-mno2-peg/c&d在活體水平的熒光和t1磁共振成像；圖11中(a)所示，ce6的熒光在腫瘤部位逐漸的增強(qiáng)并在8h達(dá)到最高峰，表明h-mno2-peg/c&d在腫瘤部位有效的富集。在注射24h之后，通過小鼠體外的主要器官和腫瘤成像也進(jìn)一步證實了材料在腫瘤部位的有效富集(圖11中(b)所示)。除此之外，在小鼠的腎臟也發(fā)現(xiàn)很強(qiáng)的ce6熒光信號，證明載體在降解之后可以通過腎臟迅速的代謝。

在靜脈注射h-mno2-peg/c&d之后，4t1荷瘤小鼠的磁共振圖像進(jìn)行了處理。圖11中(c)表明：在注射納米顆粒24h之后，腫瘤位置的t1磁共振信號有2倍的增強(qiáng)。表明h-mno2-peg/c&d在腫瘤位置的有效富集，這與熒光成像的結(jié)果一致。而且成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些小鼠的腎臟有很強(qiáng)的t1信號(圖11中(d)和(e)所示)，相對于對照組小鼠，t1的信號值增強(qiáng)了6倍，表明h-mno2-peg/c&d在分解成mn²⁺離子之后會快速的通過腎臟代謝。因此熒光與磁共振成像都說明h-mno2-peg/c&d納米載體一方面通過腫瘤增強(qiáng)的滲透性和高滯留性(epr)作用可以在腫瘤位置有效的被動富集，另一方面載體會逐漸的分解成離子并能快速的腎臟代謝。

實施例8：h-mno2-peg/c&d納米顆粒在活體水平的聯(lián)合治療

4t1荷瘤小鼠分別靜脈注射200μl的pbs，單純的ce6+dox，h-mno2-peg/c，h-sio2-peg/c&d以及h-mno2-peg/c&d(mno2＝10mg·kg^-1，sio2＝25mg·kg^-1，ce6＝4.7mg·kg^-1和dox＝4.5mg·kg^-1)。激光照射組是在660nm激光照射下進(jìn)行(5mw·cm^-2，1h)。每組實驗是五只小鼠，腫瘤的尺寸在兩個星期中隔天測量。腫瘤的體積通過下面的公式計算：寬度²×長度/2。組織和腫瘤的切片是通過標(biāo)準(zhǔn)的h&e染色并在顯微鏡下觀察。

腫瘤的尺寸在兩個星期內(nèi)檢測，在第十四天收集每組小鼠的腫瘤并稱重。圖12為實施例8中h-mno2-peg/c&d在活體水平聯(lián)合治療的效果圖，圖12中(a)所示，單純藥物加激光組(第二組)沒有明顯的抑制腫瘤的生長，相對于原始腫瘤的體積生長了11倍，說明較低劑量的單純藥物在腫瘤部位不能有效的滯留。h-mno2-peg不加激光組對腫瘤的生長也沒有明顯的作用(第三組)，腫瘤體積增加了10倍。h-mno2-peg/c加激光組(第四組)，或是h-mno2-peg/c&d不加激光組(第五組)，它們都只能部分的延緩腫瘤的生長，其腫瘤的體積分別增加了7倍和8倍。h-sio2-peg/c&d加激光的聯(lián)合治療組可以比較顯著的抑制腫瘤生長，腫瘤體積只生長了5倍。但是h-mno2-peg/c&d加激光的聯(lián)合治療組在治療結(jié)束的時候腫瘤的生長速度最慢并且體積最小，腫瘤的體積僅僅增加了2倍。最重要的是本申請的聯(lián)合治療組的治療效率要比預(yù)計的疊加作用更加的好(圖12中(b)所示)。

實施例9：h-mno2-peg/c&d納米顆粒與anti-pd-l1抗體聯(lián)合治療

為了研究雙邊的腫瘤模型，4t1細(xì)胞皮下注射在小鼠的左側(cè)(原始腫瘤)和右側(cè)(遠(yuǎn)端腫瘤)。一個星期之后，將小鼠分別靜脈注射200μl的pbs，或h-mno2-peg/c&d(mno2＝10mg·kg^-1，ce6＝4.7mg·kg^-1和dox＝4.5mg·kg^-1)或h-mno2-peg/c&d+anti-pd-l1。注射12h之后，原始的腫瘤在660nm激光下照射(5mw·cm^-2，1h)，之后在激光照射完的1，3，5，7天分別注射750μg·kg^-1的anti-pd-l1抗體。原始和遠(yuǎn)端的腫瘤尺寸與小鼠的體重每兩天檢測一次。

如圖13所示，圖13是實施例9中h-mno2-peg/c&d與anti-pd-l1聯(lián)合治療后，對小鼠原始腫瘤以及遠(yuǎn)端腫瘤的治療結(jié)果，和期待的一樣，基于h-mno2-peg/c&d的化療-光動力治療與anti-pd-l1抗體聯(lián)用之后，與h-mno2-peg/c&d的聯(lián)合治療組相比，可以進(jìn)一步提高左側(cè)腫瘤的治療效果。h-mno2-peg/c&d在小鼠左側(cè)腫瘤引導(dǎo)的化療-光動力治療與anti-pd-l1抗體聯(lián)用之后可以延緩遠(yuǎn)程腫瘤的生長，但是右側(cè)其他組的小鼠腫瘤沒有明顯的抑制。聯(lián)合治療組小鼠左側(cè)和右側(cè)腫瘤的體積分別增加了2.5倍和2.3倍。因此h-mno2-peg/c&d組誘導(dǎo)的化療-光動力治療與anti-pd-l1抗體的聯(lián)合治療不僅對直接光照的原始腫瘤進(jìn)行有效地殺傷，而且可以抑制遠(yuǎn)端腫瘤的生長(例如活體深層次的腫瘤或治療之前很難檢測的腫瘤)。

由以上實施例可知，本發(fā)明提供了一種空心mno2復(fù)合納米材料的制備方法，包括以下步驟：a)將正硅酸乙酯溶解在乙醇和堿性水溶液的混合溶液中，水解，得到實心二氧化硅納米顆粒；b)將所述實心二氧化硅納米顆粒的水溶液和高錳酸鉀溶液混合，還原反應(yīng)后再刻蝕，得到空心mno2納米顆粒；c)將所述空心mno2納米顆粒表面依次修飾聚丙烯胺鹽酸鹽層、聚丙烯酸層和氨基化的聚乙二醇層，得到空心mno2復(fù)合納米材料。該方法以實心二氧化硅球為模板，一次實驗可以得到大量形貌可控的空心結(jié)構(gòu)的mno2復(fù)合納米材料，重復(fù)性好；在酸性條件下可以完全的分解，通過熒光成像和磁共振成像，證明該納米顆粒在小鼠體內(nèi)會分解產(chǎn)生mn²⁺離子并通過腎臟排出體外。另外，該制備方法制備的空心mno2復(fù)合納米材料具有非常好的水溶性和生物相容性，在水和生理環(huán)境下都具有很好的分散性，可以高效的裝載藥物試劑并在腫瘤部位特定的釋放；能夠?qū)崿F(xiàn)可見光區(qū)的較強(qiáng)的熒光成像以及腫瘤部位特異性的t1磁共振成像；與anti-pd-l1聯(lián)合使用之后，不僅可以對原始腫瘤進(jìn)行有效的殺傷，還能明顯的抑制遠(yuǎn)端腫瘤的生長。實驗結(jié)果表明：該制備方法可以一次合成至少6g空心mno2復(fù)合納米材料；tem表明其可重復(fù)實驗；mno2納米顆粒在中性或堿性條件下是穩(wěn)定的，在弱酸性的環(huán)境中會分解成mn²⁺離子；二氫卟酚e6和鹽酸阿霉素的裝載量分別為17～89％和13～87％；注射納米顆粒24h之后，腫瘤位置的t1磁共振信號有2倍的增強(qiáng)；h-mno2-peg/c&d加激光的聯(lián)合治療組在治療結(jié)束的時候腫瘤的生長速度最慢并且體積最小，腫瘤的體積僅僅增加了2倍。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。