本發(fā)明屬于藥物制備用途領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及化合物6b(即本發(fā)明的查爾酮衍生物)在制備治療糖尿病并發(fā)癥藥物中的用途。

背景技術(shù)：

糖尿病作為世界性的流行性疾病導(dǎo)致了嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題，中國(guó)的糖尿病患者占全部人口的9.7％。糖尿病的并發(fā)癥可遍及全身各重要器官，大多數(shù)糖尿病患者死于心、腦血管或腎臟并發(fā)癥。糖尿病的器官并發(fā)癥是多因素綜合作用引起的，涉及炎癥反應(yīng)、ras激活、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及終末糖基化產(chǎn)物(ages)等多種因素，但是近年來(lái)的證據(jù)顯示炎癥反應(yīng)與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)。高血糖誘導(dǎo)的各器官組織炎癥信號(hào)激活、炎癥因子釋放、趨化粘附因子水平上升以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和聚集，隨后導(dǎo)致組織發(fā)生一系列的損傷性病理改變?？梢?jiàn)，炎癥反應(yīng)在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子nf-κb是tlrs介導(dǎo)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，是信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵靶分子。研究表明tlr1，2，6，4及5的信號(hào)傳導(dǎo)均可作用于轉(zhuǎn)錄因子nf-κb途徑完成信號(hào)傳導(dǎo)：tlrs激活后,其tir結(jié)構(gòu)域與myd88的羧基末端相互作用，從而激活myd88依賴性信號(hào)通路，隨后irak1/4激活，nf-κb信號(hào)通路也被激活，共同開(kāi)啟下游的炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)13。nrf2(nf-e2-relatedfactor2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受keap1的調(diào)控，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件are(antioxidantresponseelement)相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和ii相解毒酶的表達(dá)?？梢?jiàn)，nf-κb和nrf2在lps誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

化合物6b是由白藜蘆醇(resveratrol)和查爾酮(chalcone)兩種優(yōu)秀天然產(chǎn)物合成而來(lái)的衍生物。白藜蘆醇和查爾酮都具有抗炎、抗氧化、護(hù)肝、保護(hù)心血管等功效，而化合物6b繼承了兩者抗炎活性的同時(shí)，減小細(xì)胞毒性。針對(duì)6b在緩解代謝性疾病中作用的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，6b除了通過(guò)抗炎來(lái)治療疾病，還可以通過(guò)抗氧化的效果來(lái)達(dá)到治療疾病的目的。

目前，關(guān)于6b的直接抗炎抗氧化靶點(diǎn)尚不清楚，另外，其在糖尿病并發(fā)癥中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)艱苦努力，發(fā)現(xiàn)化合物6b可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子nf-κb來(lái)發(fā)揮抗炎作用，同時(shí)激活nrf2信號(hào)通路來(lái)起到抗氧化的效果，從而用于治療糖尿病并發(fā)癥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種aza白藜蘆醇-查爾酮衍生物6b在治療或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥(尤其是糖尿病心肌病)方面的新用途。

一種aza白藜蘆醇-查爾酮衍生物在藥物制備中的應(yīng)用，所述的aza白藜蘆醇-查爾酮衍生物的結(jié)構(gòu)如下：

所制備的藥物用于預(yù)防或/和治療糖尿病并發(fā)癥。

在本發(fā)明中，我們首先發(fā)現(xiàn)了6b對(duì)糖尿病心肌病(dcm)的治療效果。我們利用stz造成1型糖尿病小鼠模型并給予小鼠灌胃6b(5及20mg/kg/day)16周。結(jié)果表明6b顯著緩解stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心臟纖維化及細(xì)胞凋亡以及心功能不全(詳情見(jiàn)實(shí)施例1)。同時(shí)，口服6b并不影響1型糖尿病小鼠的高血糖水平，說(shuō)明其作用不是通過(guò)降血糖而引起的。

在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)6b可以抑制高糖(hg33mm葡萄糖)誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞中的炎癥信號(hào)通路(nf-κb)激活及炎癥因子(tnf-α和il-6)釋放(詳情見(jiàn)實(shí)施例2)，以及激活nrf2信號(hào)通路，增加抗氧化蛋白ho-1和nqo-1的表達(dá)。

本發(fā)明還提供了所述的6b或其藥物組合物，其藥物組合物是將6b和藥學(xué)上可接受的輔劑組合在一起而配制成的各種制劑，其中優(yōu)選于用于口服的散劑、片劑、丸劑、膠囊及口服液。本發(fā)明的藥物組合物可以是將6b和藥學(xué)上可接受的輔劑組合在一起而配制成的各種制劑，優(yōu)選為固體制劑和液體制劑。本發(fā)明的制劑可以為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑、等劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥方式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過(guò)皮膚等的給藥形式(其中優(yōu)選于用于口服的散劑、片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋放形式)及口服液)。

本發(fā)明還提供了所述的藥物組合物或應(yīng)用，其中糖尿病并發(fā)癥包括但不局限于：糖尿病心肌病、糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和糖尿病足病，其中優(yōu)選于糖尿病心肌病。

本發(fā)明取得的有益效果在于：本發(fā)明的化合物6b具有優(yōu)異的抑制炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子nf-κb的轉(zhuǎn)錄活性，以及激活nrf信號(hào)通路起到抗氧化應(yīng)激的作用，來(lái)緩解高血糖誘導(dǎo)的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)效果，從而可以高效地治療糖尿病并發(fā)癥。

為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中重復(fù)敘述過(guò)一樣。

附圖說(shuō)明

圖1為化合物6b對(duì)stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟并發(fā)癥的影響。

圖2為化合物6b對(duì)stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的緩解作用。

圖3為化合物6b對(duì)hg誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的緩解作用。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)理解為限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1化合物6b對(duì)stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠臟器并發(fā)癥的影響

雄性c57bl/6小鼠從溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心獲得。小鼠用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物食物和水飼養(yǎng)在恒溫晝夜12-12h節(jié)律的動(dòng)物房?jī)?nèi)。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前至少花一周時(shí)間進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性生長(zhǎng)。涉及到動(dòng)物使用的協(xié)議都獲得溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物政策與福利委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文件:2009/apwc/0031)。在實(shí)驗(yàn)中所用的6b為制成的可溶于dmso的劑型。8-10周齡雄性c57bl/6小鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、糖尿病組(dm)、糖尿病組合并化合物6b(5、20mg/kg/d兩個(gè)劑量)處理組，每組8只。低劑量50mg/kg/d鏈脲佐菌素(stz,sigma)腹腔注射，連續(xù)注射5天造模1型糖尿病模型，72小時(shí)后，血糖儀測(cè)定空腹血糖(禁食4-6小時(shí))，血糖值≥12mmol/l時(shí)認(rèn)為1型糖尿病小鼠模型已建立。每周監(jiān)測(cè)血糖和體重，連續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月。各組小鼠處死前，利用多普勒超聲檢測(cè)儀記錄心功能指標(biāo)。石蠟包埋心臟組織，通過(guò)馬松、天狼星紅和he染色檢測(cè)心臟形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)tunel技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡改變；通過(guò)免疫組化檢測(cè)心臟組織的炎癥因子(vcam和tnf-α)以及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(cd68)，通過(guò)dhe熒光染料檢測(cè)心臟中活性氧(ros)的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1和圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6b顯著緩解stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心臟組織中炎癥和氧化應(yīng)激，以及由此導(dǎo)致的纖維化、細(xì)胞凋亡以及心功能不全。

圖1a為通過(guò)tunel技術(shù)檢測(cè)到心肌細(xì)胞凋亡圖，下圖為上圖的放大圖，圖1b為圖1a的細(xì)胞圖得到的統(tǒng)計(jì)圖，其中，橫坐標(biāo)為各個(gè)測(cè)試組，縱坐標(biāo)為凋亡細(xì)胞數(shù)，由圖1a和1b可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟細(xì)胞凋亡數(shù)，并且隨著劑量加大，效果更明顯。

圖1c為通過(guò)masson染色得到的效果圖，圖1d為圖1c的統(tǒng)計(jì)圖，縱坐標(biāo)為結(jié)締組織的比例，由圖1c和1d可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟結(jié)締組織的比例。

圖1e為通過(guò)天狼星紅染色得到的效果圖，圖1f為圖1e的統(tǒng)計(jì)圖，由圖1e和1f可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟結(jié)締組織的比例。

圖1g為實(shí)驗(yàn)小鼠各組對(duì)應(yīng)的心超數(shù)據(jù)，從影像學(xué)方面反應(yīng)藥物對(duì)于stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟的保護(hù)作用，表格上方為分組，下方為各項(xiàng)指標(biāo)，指標(biāo)后面為對(duì)應(yīng)的單位。hr表示心率，bpm為單位；hw/bw為心臟重量與體重之比，單位為mg/kg，反映心肌肥大的指標(biāo)之一；ivsd為室間隔厚度，單位為mm，反映心肌肥厚的指標(biāo)之一；lvidd為舒張期室間隔厚度，單位為mm，反映心肌的舒張功能；irt為等容舒張時(shí)間，單位為ms，反映心肌的舒張功能；teiindex為心肌做功指數(shù)，沒(méi)有單位，反應(yīng)左室心肌的功能；ef％為射血分?jǐn)?shù)，指每搏輸出量占心室舒張末期容積量的百分比，反映心肌的收縮功能；fs％為左心室短軸縮短率，反映心肌的收縮功能。該結(jié)果表明化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟的功能損傷。

圖2a是通過(guò)免疫組化檢測(cè)心臟組織的炎癥因子vcam的效果圖，圖2d為圖2a的統(tǒng)計(jì)圖，由圖2a和圖2d可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟組織的炎癥因子vcam含量。

圖2b是通過(guò)免疫組化檢測(cè)心臟組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(cd68)的效果圖，圖2e為圖2b的統(tǒng)計(jì)圖，由圖2b和圖2e可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(cd68)的含量。

圖2c是通過(guò)免疫組化檢測(cè)心臟組織的炎癥因子tnf-α的效果圖，圖2f為圖2c的統(tǒng)計(jì)圖，由圖2c和圖2f可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟組織的炎癥因子tnf-α含量。

圖2g是通過(guò)免疫組化檢測(cè)心臟中活性氧(ros)效果圖，圖2i為圖2g的統(tǒng)計(jì)圖，由圖2i和圖2g可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟中活性氧(ros)含量。

圖2h是通過(guò)免疫組化檢測(cè)心臟組織的氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物3-nt的效果圖，圖2j為圖2h的統(tǒng)計(jì)圖，由圖2h和圖2j可知，化合物6b可以顯著降低stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟組織的氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物3-nt含量。

實(shí)施例2化合物6b可以緩解hg誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)

采用6b對(duì)hg刺激h9c2心肌細(xì)胞中釋放炎癥因子(tnf-α)抑制的方法測(cè)試了6b的體外抗炎活性，具體方法如下：1.2×10^{^6}個(gè)h9c2用dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，24小時(shí)后更新培養(yǎng)液，并加入受測(cè)6b(終濃度為2.5、5及10μm)預(yù)處理1小時(shí)，再用高糖(hg33mm葡萄糖)繼續(xù)處理24小時(shí)，收集培養(yǎng)液用elisa法檢測(cè)tnf-α含量；收集細(xì)胞檢測(cè)總蛋白濃度，elisa結(jié)果用相應(yīng)的總蛋白濃度相除較準(zhǔn)，以hg對(duì)照組的tnf-α含量定標(biāo)為100；每個(gè)化合物重復(fù)測(cè)試3次，計(jì)算平均值和誤差值。同時(shí)，采用6b對(duì)hg刺激h9c2心肌細(xì)胞中炎癥信號(hào)通路(nf-κb)激活抑制以及nrf2信號(hào)通路激活的方法測(cè)試了6b的體外抗炎抗氧化活性，具體方法如下：分別用1.2×10^{^6}個(gè)h9c2心肌細(xì)胞用dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，24小時(shí)后更新培養(yǎng)液，并加入受測(cè)6b(終濃度為2.5、5及10μm)預(yù)處理1小時(shí)，再用高糖(hg33mm葡萄糖)繼續(xù)處理1小時(shí)，收集培養(yǎng)液用westernblot法檢測(cè)nf-κb的核轉(zhuǎn)移活性，每個(gè)化合物重復(fù)測(cè)試3次，計(jì)算平均值和誤差值；分別用5×10^{^5}個(gè)h9c2心肌細(xì)胞用dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，24小時(shí)后更新培養(yǎng)液，并加入受測(cè)6b(終濃度為2.5、5及10μm)預(yù)處理1小時(shí)，再用高糖(hg33mm葡萄糖)繼續(xù)處理6小時(shí)，收集培養(yǎng)液用rt-qpcr法檢測(cè)炎癥因子tnf-α和il-6的mrna表達(dá)量，每個(gè)化合物重復(fù)測(cè)試3次，計(jì)算平均值和誤差值；分別用1.2×10^{^6}和5×10^{^5}個(gè)h9c2心肌細(xì)胞用dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，24小時(shí)后更新培養(yǎng)液，并加入受測(cè)6b(終濃度為2.5、5及10μm)預(yù)處理1小時(shí)，再用高糖(hg33mm葡萄糖)繼續(xù)處理12小時(shí)，收集培養(yǎng)液用westernblot法和rt-qpcr法檢測(cè)nrf2蛋白及其下游抗氧化蛋白ho-1和nqo-1蛋白和mrna水平的表達(dá)量，每個(gè)化合物重復(fù)測(cè)試3次，計(jì)算平均值和誤差值。6b對(duì)nrf2信號(hào)通路的激活活性見(jiàn)圖3。本發(fā)明顯示6b可以有效緩解hg誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖3a～3d為檢測(cè)結(jié)果，其中，圖3a為nf-κbp65的westernblot結(jié)果，圖3b為elisa結(jié)果，表示細(xì)胞培養(yǎng)基上清中炎癥因子tnf-α的相對(duì)值，圖3c和3d為炎癥因子tnf-α和il-6在mrna水平的表達(dá)量，圖3a～圖3d可見(jiàn)，化合物6b可以有效抑制hg誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子nf-κb的轉(zhuǎn)錄活性，并抑制因此導(dǎo)致的炎癥因子tnf-α和il-6的釋放。圖3e～3g為檢測(cè)結(jié)果，其中，圖3e為westernblot結(jié)果，圖3f～圖3h為相應(yīng)指標(biāo)的mrna表達(dá)水平，可見(jiàn)化合物6b可以有效激活nrf2信號(hào)通路，并激活其下游的抗氧化蛋白的表達(dá)。