本發(fā)明通常涉及治療領(lǐng)域，具體地涉及用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化癥、小兒腦癱、帕金森氏病、重癥肌無力癥、慢性腎衰竭、肺纖維化、腎炎和潰瘍性結(jié)腸炎等由于細(xì)胞損傷引起疾病，通常通過可能嚴(yán)重?fù)p害正常細(xì)胞的藥物和外科手術(shù)治療，治療過程痛苦且漫長。
最近發(fā)現(xiàn)移植正常細(xì)胞來替代被破壞的或損傷的細(xì)胞的替代療法對于這種疾病是有效的，特別地，能夠分化和增殖為所需組織的神經(jīng)細(xì)胞正在大力研究中。
干細(xì)胞是非特化細(xì)胞，其可以在非分化階段無限增殖并可以在應(yīng)答特異性刺激時分化為多種組織。可以形成神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)膜細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞也是具有自我繁殖能力的未分化細(xì)胞。它們通過神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞而分化為神經(jīng)細(xì)胞，例如神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)。
已知可以分化為骨、軟骨、脂肪組織、肌肉、腱、韌帶、神經(jīng)組織和其他的間充質(zhì)干細(xì)胞對于細(xì)胞替代療法是可行的。間充質(zhì)干細(xì)胞主要自骨髓獲得，但是這種間充質(zhì)干細(xì)胞由于其有限的分化和增殖能力而僅提供有限的應(yīng)用。而且，除了發(fā)現(xiàn)與患者具有相同的組織相容性抗原的供體以避免在骨髓移植中的移植物抗宿主反應(yīng)的問題之外，對于這種細(xì)胞替代療法還需進行包括數(shù)個步驟的復(fù)雜、通常痛苦的輸液。
近年來，臍帶血由于其高干細(xì)胞濃度而成為研究者的目標(biāo)。已經(jīng)進行了許多通過移植臍帶血給患者來治療血液病的試驗，而且已經(jīng)建立了以冷凍形式保存臍帶血直至使用的臍帶血庫以用于自體移植療法。
與骨髓不同，臍帶血可以通過簡單地從臍帶獲得而且其幾乎不引起移植物抗宿主反應(yīng)。為此，最近進行了關(guān)于臍帶血臨床應(yīng)用的世界性研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決至少部分上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明人在臍帶血方面進行了深入研究并發(fā)現(xiàn)，包含臍血提取物和艾草提取物的組合物，具有化學(xué)趨向性，自動歸巢修復(fù)損傷細(xì)胞。同時，能夠調(diào)整細(xì)胞環(huán)境，從而解決細(xì)胞損傷引起的機體問題。
本發(fā)明的一方面，提供用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物，其包含臍血提取物、艾草提取物和生理鹽水。
在某些實施方式中，所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物中，所述臍血提取物和所述艾草提取物質(zhì)量份數(shù)之比為2-4:1。
在某些實施方式中，所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物中，所述艾草提取物為利用水蒸氣蒸餾法、大孔樹脂吸附法、溶劑萃取法、微波萃取法和/或超臨界流體萃取法從艾草中提取。
在某些實施方式中，所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物中，所述艾草提取物包含5-羥基-6,7,3’,4’四甲氧基黃酮、5,7-二羥基-6,3’,4’-三甲氧基黃酮、木犀草素和3,4’,5,7-四羥基黃酮。
在某些實施方式中，所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物中，所述艾草提取物包含按照質(zhì)量份計的，20-40份的5-羥基-6,7,3’,4’四甲氧基黃酮、20-40份的5,7-二羥基-6,3’,4’-三甲氧基黃酮、10-20份計木犀草素和40-60份的3,4’,5,7-四羥基黃酮。
在某些實施方式中，所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物中，所述艾草提取物占所述組合物的質(zhì)量濃度為25-60μg/ml。
在某些實施方式中，所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物中，還包含戊巴比妥鈉和6-ohda溶液。
本發(fā)明另一方面，還提供根據(jù)上述的組合物在制備用于修復(fù)受試者體內(nèi)受損神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
在某些實施方式中，所述受試者患有選自由多發(fā)性硬化癥、小兒腦癱、帕金森氏病、重癥肌無力癥、慢性腎衰竭、肺纖維化、腎炎和潰瘍性結(jié)腸炎組成的組中的疾病。
有益效果：
本發(fā)明所述的提供用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物，利用所述組合物進行回輸治療，組合物進入受試者體內(nèi)，趨向性至受損細(xì)胞部位，主動分裂繁殖，促進受損細(xì)胞恢復(fù)，同時，改善人體內(nèi)部環(huán)境，達(dá)到修復(fù)受損細(xì)胞的功能，治療由細(xì)胞受損引起的疾病的目的。
具體實施方式
現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的多種示例性實施方式，該詳細(xì)說明不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對本發(fā)明的某些方面、特性和實施方案的更詳細(xì)的描述。
應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為具體公開了該范圍的上限和下限值以及它們之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括或排除在范圍內(nèi)。
除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻沖突時，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明中，名詞術(shù)語既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。本發(fā)明中所述的“至少一種”不僅僅指包含“一個”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個”或“多種”的情況。
本發(fā)明中，所述“細(xì)胞損傷”是指任何類型的細(xì)胞損傷，特別是神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞損傷，此類細(xì)胞損傷可引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷。神經(jīng)系統(tǒng)損傷容易導(dǎo)致例如伴隨由于受損的運動或感覺神經(jīng)導(dǎo)致的行為功能障礙的疾病，例如多發(fā)性硬化癥、小兒腦癱、帕金森氏病、重癥肌無力癥、慢性腎衰竭、肺纖維化、腎炎和潰瘍性結(jié)腸炎等。
本發(fā)明中，所述“臍血”是指哺乳動物(例如，人類)胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液。優(yōu)選地，胎盤和臍帶可從動物體分離后經(jīng)冷凍保存。更優(yōu)選地，胎盤和臍帶為從動物體分離的新鮮胎盤和臍帶。更優(yōu)選地，胎盤和臍帶為從動物例如人體分離后1-12小時，優(yōu)選1-5小時之內(nèi)的胎盤和臍帶。新鮮的胎盤和臍帶具有更多高活性的物質(zhì)。因此，本發(fā)明的臍帶血優(yōu)選為新鮮胎盤和臍帶中的血液。
本發(fā)明中，所述“臍血提取物”是指包含臍血成分的液體。優(yōu)選地，包含利用一定提取方法從臍血中提取的物質(zhì)。示例性地所述提取方法包括將臍帶血樣品與細(xì)胞稀釋劑接觸的步驟；隨后加入細(xì)胞沉淀劑的步驟；待分層后取出上層細(xì)胞液離心濃縮獲得沉淀，隨后將所述沉淀鋪到分層劑上層，離心分離得到中間的油狀層的步驟。
本發(fā)明中，所述稀釋劑為下列水溶液之一：0.1-30％氯化鈉注射液和0.1-20％的腦蛋白水解物組成的水溶液，或者0.1-30％的ph為7-7.5的磷酸鹽緩沖液和0.1％-20％的腦蛋白水解物組成的水溶液。優(yōu)選地，所述稀釋劑為0.1-15％氯化鈉注射液和0.1-10％的腦蛋白水解物組成的水溶液。更優(yōu)選地，所述稀釋劑為0.1-3％氯化鈉注射液和0.1-5％的腦蛋白水解物組成的水溶液。例如，所述稀釋劑為0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％、2.7％或3％氯化鈉注射液和0.1％、0.5％、0.7％、0.9％、1.5％、1.8％、2.1％、2.7％、3％、3.7％、4.2％、4.7％或5％的腦蛋白水解物組成的水溶液。優(yōu)選地，所述稀釋劑為0.1-30％的ph為7-7.5的磷酸鹽緩沖液和0.1％-20％的腦蛋白水解物組成的水溶液。優(yōu)選地，所述稀釋劑為0.1-15％的ph為7-7.5的磷酸鹽緩沖液和0.1％-10％的腦蛋白水解物組成的水溶液。更優(yōu)選地，所述稀釋劑為0.1-3％的ph為7-7.5的磷酸鹽緩沖液和0.1％-5％的腦蛋白水解物組成的水溶液。例如，所述稀釋劑為0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％、2.7％或3％的ph為7-7.5的磷酸鹽緩沖液和0.1％、0.5％、0.7％、0.9％、1.5％、1.8％、2.1％、2.7％、3％、3.7％、4.2％、4.7％或5％的腦蛋白水解物組成的水溶液。
在某些實施方案中，所述腦蛋白水解物為選自下列產(chǎn)品之一：國藥準(zhǔn)字h20052182、國藥準(zhǔn)字h20003386、國藥準(zhǔn)字h20003384或國藥準(zhǔn)字h20003385。
在某些實施方案中，所述沉淀劑為0.1-30％羥乙基淀粉水溶液或0.1-20％甲基纖維素水溶液。優(yōu)選地，所述沉淀劑為1-10％羥乙基淀粉水溶液或0.3-1.5％甲基纖維素水溶液。更優(yōu)選地，所述沉淀劑為3-7％羥乙基淀粉水溶液或0.3-1％甲基纖維素水溶液。例如，所述沉淀劑為3％、4％、5％、6％或7％的羥乙基淀粉水溶液。再例如，所述沉淀劑為0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的甲基纖維素水溶液。
在某些實施方案中，所述分層劑包含密度為1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺的水溶液。優(yōu)選地，液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為1.01-1.088g/ml、優(yōu)選1.035-1.08g/ml、更優(yōu)選為1.075g/ml。
在某些實施方案中，將所述稀釋樣品與所述沉淀劑按體積1:1混合。
在某些實施方案中，將所述稀釋樣品與所述沉淀劑按體積2:1混合。
在某些實施方案中，將所述稀釋樣品和所述沉淀劑按照體積2:1混合后，搖勻1-8分鐘，靜置3分鐘-180分鐘，待分層后吸取上層細(xì)胞液，分裝至50ml離心管中，以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1-20分鐘，棄上清液得到所述濃縮樣品。
在某些實施方案中，用生理鹽水稀釋所述濃縮樣品，將稀釋后的所述濃縮樣品鋪設(shè)在所述分層劑上，以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速，離心1-60分鐘，收集臍血提取物。進一步地所述臍血提取物為位于所述離心管中間位置的2-4mm厚的油狀細(xì)胞層。
在某些實施方案中，所述方法還包括將所述臍血提取物用生理鹽水清洗1-5次。
本發(fā)明中，所述“艾草提取物”是指從艾草中提取的物質(zhì)。所述艾草提取物在所述組合物中的濃度為25-60μg/ml。進一步地，所述艾草提取物占所述組合物的質(zhì)量濃度為30-45μg/ml。更進一步地，所述艾草提取物占所述組合物的質(zhì)量濃度為30、32、35、37、40、42或45μg/ml。
本發(fā)明中，所述“艾草提取物”主要包含揮發(fā)油、黃酮類、三萜類衍生物、微量元素、鞣質(zhì)、綠原酸、朝鮮薊酸、脂肪酸、鞣酸和多糖。進一步地，所述揮發(fā)油主要包括單萜類化合物、單萜類衍生物、倍單萜類化合物及其衍生物；進一步地，所述揮發(fā)油包括葉腦、松油醇、α-側(cè)柏烯、蒎烯、崁烯、香檜烯、1-辛烯-3-醇、對-聚傘花素、1,8-桉葉素、γ-松油烯、樟腦、龍腦、萜品烯-4-醇、α-松油醇、丁香酚、反-丁香酚、順-β-合歡烯草烯、β-芹子烯、丁香烯氧化物、六氫金歡基丙酮基棕櫚酸等。進一步地，所述黃酮類主要包括黃酮和黃酮醇化合物，進一步地，所述黃酮類主要包括游離黃酮，更進一步地，所述黃酮類包括5,7-二羥基-6,3,4-三甲氧基黃酮、5-羥基-6,7,3,4四甲氧基黃酮、5,7,4’-三羥基-6,3’-二甲氧基黃酮、5,3,7,3’,4-五羥基黃酮、5,7,4’-三羥基黃酮、芹菜素、木犀草素和單乃芬等。進一步地，所述三萜類化合物包括α-及β-香樹脂醇、無羈萜、α-及β-香樹脂醇的乙酸酯、羽扇烯酮、粘霉烯酮、羊齒烯酮、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷酮、西米杜鵑醇和3β-甲氧基-9β、19-環(huán)羊毛甾-23(e)烯-25,26-二醇等。進一步地，所述微量元素包含金屬錫(sr)、鉻(cr)、鈷(co)、鎳(ni)、錳(mn)、銅(cu)、鋅(zn)、鐵(fe)、鈉(na)、鉀(k)、鈣(ca)和鎂(mg)。
本發(fā)明中，所述的“艾草提取物”是利用水蒸氣蒸餾法、大孔樹脂吸附法、溶劑萃取法、微波萃取法和/或超臨界流體萃取法從艾草中提取的。進一步地，所述大孔徑樹脂吸附法是以大孔吸附試著xda-1吸附艾草提取液中的所述艾草合物，所述的超臨界流體萃取法，是用臨界二氧化碳萃取技術(shù)萃取艾草中的所述艾草提取物。更進一步地，將艾草葉放置于蒸餾燒瓶中，用40-60％的乙醇溶解搖勻，靜止20-40分鐘；用微波爐解凍檔處理1-3分鐘；將蒸餾燒瓶放置在55-70℃恒溫水浴中回流2小時，趁熱抽濾棄去濾渣。然后濾液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用石油醚萃取濾液中的葉綠素、胡蘿卜素和脂溶性脂類等雜質(zhì)。棄去上層液，保留下層液。重復(fù)萃取2-5次，直至濾液顏色無色是，將濾液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用30-50％的乙醇除去多糖、蛋白質(zhì)等可溶性雜質(zhì)。每2ml去雜溶液加入12.5ml的30-50％的乙醇和1mlnano2，5-10分鐘后，按照每2ml去雜溶液對應(yīng)0.8ml6％的al(no3)3的比例加入al(no3)3，5-10分鐘后，按照每2ml去雜溶液對應(yīng)3.5ml10％naoh的比例加入naoh，震蕩混勻，獲取所述艾草提取物。
本發(fā)明的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法胃腸外施用，例如通過注射進入損傷區(qū)域以及注射進入腦脊液例如腰椎穿刺術(shù)和實質(zhì)注射(parenchymalinjection)、靜脈或動脈。優(yōu)選地，其可以通過直接注射施用。另外，可以使用douglaskondziolka(douglaskondziolka，pittsburgh，1998)的臨床方法將本發(fā)明的組合物施用給損傷區(qū)域。特別地，將對象的顱骨切開一個直徑1cm的孔，將于hbss(hank’s平衡鹽溶液)中的組合物的懸浮液通過長針注射器和立體定位架而注射進該孔。
所述組合物的典型劑量范圍從1×105到1×107細(xì)胞/kg體重/注射，優(yōu)選從5×105到5×106細(xì)胞/kg體重/注射，其可以單劑量或分份劑量施用。另外，應(yīng)理解實際施用給某個患者的有效成分的量應(yīng)根據(jù)多種相關(guān)因素包括被分化增殖的神經(jīng)細(xì)胞的量、選擇的施用途徑和個體患者的體重、年齡和性別確定。例如，用量為，45ml的臍血提取物濃度為6.2×105個/ml組合物懸液，50ml的臍血提取物濃度為5.7×105個/ml組合物懸液，55ml的臍血提取物濃度為4.9×105個/ml組合物懸液，60ml的臍血提取物濃度為5.8×105個/ml組合物懸液，58ml的臍血提取物濃度為.5×105個/ml組合物懸液，61ml的臍血提取物濃度為5.8×105個/ml組合物懸液，60ml的臍血提取物濃度為5.7×105個/ml組合物懸液。
實施例
實施例1
獲取臍血提取物、艾草提取物和生理鹽水。
將所述臍血提取物、所述艾草提取和所述生理鹽水按照體積比為2:1:1的比例混合，制得所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物。
上述方案中，所述艾草提取物占所述組合物的質(zhì)量濃度為25μg/ml。
且所述艾草提取物包含按照質(zhì)量份計的，20份的5-羥基-6,7,3’,4’四甲氧基黃酮、20份的5,7-二羥基-6,3’,4’-三甲氧基黃酮、10份的木犀草素和40份的3,4’,5,7-四羥基黃酮。
上述方案中，所述組合物還包含戊巴比妥鈉和6-ohda溶液。
實施例2
獲取臍血提取物、艾草提取物和生理鹽水。
將所述臍血提取物、所述艾草提取和所述生理鹽水按照體積比為3:1:1.5的比例混合，制得所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物。
上述方案中，所述艾草提取物占所述組合物的質(zhì)量濃度為60μg/ml。
且所述艾草提取物包含按照質(zhì)量份計的，40份的5-羥基-6,7,3’,4’四甲氧基黃酮、40份的5,7-二羥基-6,3’,4’-三甲氧基黃酮、20份計木犀草素和60份的3,4’,5,7-四羥基黃酮。
上述方案中，所述組合物還包含戊巴比妥鈉和6-ohda溶液。
實施例3
獲取臍血提取物、艾草提取物和生理鹽水。
將所述臍血提取物、所述艾草提取和所述生理鹽水按照體積比為4:1:2的比例混合，制得所述的用于促進細(xì)胞損傷修復(fù)的組合物。
上述方案中，所述艾草提取物占所述組合物的質(zhì)量濃度為40μg/ml。且所述艾草提取物包含按照質(zhì)量份計的，30份的5-羥基-6,7,3’,4’四甲氧基黃酮、30份的5,7-二羥基-6,3’,4’-三甲氧基黃酮、115份計木犀草素和50份的3,4’,5,7-四羥基黃酮。
上述方案中，所述組合物還包含戊巴比妥鈉和6-ohda溶液。
藥理實驗
動物飼養(yǎng)于spf級實驗動物實驗室條件下，室內(nèi)溫度19-22℃，相對濕度40％-50％，給予全價顆粒飼料，自由攝食、飲水。
精神神經(jīng)系統(tǒng)實驗：
取質(zhì)量18-22g的km小鼠80只，雌雄比例均為1:1，隨機分為四組，依次為實驗組1、實驗組2、實驗組3和對照組，每組20只，雌雄各半。實驗組1至實驗組3給藥組分設(shè)0.5、1.0、2.0ul/kg的臍血提取物濃度為8×107個/ml組合物懸液，對照組給予5％葡萄糖注射液，均按0.1ml/10g體重尾靜脈注射給藥。
實驗內(nèi)容
給藥后10min，觀察小鼠的一般行為表現(xiàn)，步態(tài)、姿勢、肌肉緊張度、瞳孔變化、流涎、二便、皮毛等，同對照組比較，了解受試藥對動物的影響。
給藥后10min，置小鼠于自發(fā)活動測定儀中，穩(wěn)定5min后，測定10min內(nèi)自主活動次數(shù)，用組間t檢驗進行統(tǒng)計處理。
實驗結(jié)果
1.小鼠一般行為的硬性：實驗各組動物在用藥后60min內(nèi)的一般行為，步態(tài)、肌緊張度、活動、飲食、皮毛及二便，均無顯著變化，未見有瞳孔大小改變，豎毛、倦伏、流涎等異常癥狀，同對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.小鼠協(xié)調(diào)運動的影響：各組動物于給藥前及給藥后各觀測點的跌落率均為0，表明在實驗所用0.5、1.0、2.0ul/kg劑量下對小鼠協(xié)調(diào)運動無明顯影響。
3.對小鼠自主活動的影響：組合物懸液各劑量組對小鼠自主活動的影響，實驗組1.0、2.0ul/kg劑量時，活動次數(shù)略有減少，但同對照組比較，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，表明組合物懸液對小鼠自主活動無明顯影響，如表1所示。
表1對小鼠自主活動的影響
注：與對照組比較p＞0.05。
呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)實驗
以體重12-18kg的健康雜種家犬8只，設(shè)置實驗組1、實驗組2、實驗組3和對照組，每組2只，雌雄各一只。實驗組1至實驗組3給藥組分設(shè)0.5、1.0、2.0ul/kg的臍血提取物濃度為8×107個/ml組合物懸液，對照組給予5％葡萄糖注射液，均按1ml/10g體重股靜脈插管給藥，注射速度為30s。
實驗內(nèi)容
用戊巴比妥鈉30mg/kg，靜脈注射麻醉后，背位固定，分離右頸總動脈，插管連接tp—101型壓力轉(zhuǎn)換能以多導(dǎo)生理記錄儀記錄收縮壓，舒張壓及平均動脈壓；以針形電極刺入四肢皮下記錄ⅱ導(dǎo)聯(lián)心電圖，以立位轉(zhuǎn)換能器連接胸骨記錄呼吸頻率及幅度。分別在靜脈注射給藥后1、2、5、10、15、20及30min時記錄上述各項指標(biāo)，觀察組合物懸液對呼吸，心電及血壓的作用，用t檢驗法進行用藥前后顯著性檢驗分析。
實驗結(jié)果
1.對呼吸系統(tǒng)的影響：靜脈注射各劑量后，分別在不同時間點描記呼吸頻率及幅度的變化，結(jié)果表明給藥組在0.5、1.0ul/kg劑量時靜脈注射對麻醉犬各時間點的呼吸頻率及幅度均無明顯作用，在2.0ul/kg劑量時，頻率及幅度均略有增加，但同對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明組合物懸液對犬的呼吸系統(tǒng)無顯著影響，如表2所示。
表2對麻醉犬呼吸頻率及幅度的影響
注：對照組和實驗組與用藥前比較p均＞0.05。
心血管系統(tǒng)的影響：
2.1平均動脈壓和心率的影響，組合物懸液靜脈注射1.0、2.0ul/kg時，對麻醉犬的心率計平均動脈壓無明顯作用，同對照組及用藥前相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，表明組合物懸液在本劑量時無心血管刺激作用，如表3和表4所示。
表3對麻醉犬平均動脈壓的影響(kpa)
注：與用藥前比較p＞0.05。
表4對麻醉犬心率的影響(次/min)
注：與用藥前比較p＞0.05。
2.2心電圖檢測，靜脈注射組合物懸液0.5、1.0、2.0ul/kg計量時，對麻醉犬心電圖無明顯作用，其各波間隔時間及電壓振幅均在正常范圍內(nèi)波動，用藥前后及用藥組同對照組相比，均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明組合物懸液在本實驗所用劑量下，對麻醉犬的心電圖無影響，如表5所示。
表5對麻醉犬ⅱ導(dǎo)聯(lián)心電圖(ecg)的影響
上述組合物懸液靜脈滴注后，對小鼠的一般行為、協(xié)調(diào)運動及自主活動，和對麻醉犬的心率、收縮壓、舒張壓及平均動脈壓檢測均無不良影響，表明組合物懸液靜脈滴注的安全性較高。
急性毒性實驗
受試者：a組嚙齒類動物組：周齡6-9周的sd大鼠，體重180-240g，其包括60只sd大鼠的實驗組和20只sd大鼠的對照組，實驗組和對照組的雌雄比例均為1:1；b組非嚙齒類動物組：月齡6-10個月beagle犬，體重8-15kg，其包括30只beagle犬的實驗組和10只beagle犬的對照組，實驗組和對照組的雌雄比例均為1:1。
實驗方法：給藥后2h同時觀察各組觀察動物反應(yīng)，以后每天上、下午各觀察一次，連續(xù)觀察15天。
給藥量：a組實驗組每20只分別按照起始劑量a、中間劑量b和最大劑量c給藥；b組實驗組每10只分別按照起始劑量a、中間劑量b和最大劑量c給藥；
a組：a.大鼠2.5ml/kg、b.大鼠5.0ml/kg、c.大鼠10.0ml/kg；
b組：a.beagle犬1.25ml/kg、b.beagle犬2.5ml/kg、c.beagle犬5.0ml/kg。
實驗記錄：參與實驗的大鼠及beagle犬在實驗周期內(nèi)皆未出現(xiàn)死亡，體重稍有增加，大鼠平均增加10-15g，犬平均增加400-900g，實驗組與空白對照組相比無明顯差別。除最大劑量組及空白對照組出現(xiàn)陽性表現(xiàn)外，其余各組均為出現(xiàn)有意義的陽性體征，如表6所示，癥狀陽性表現(xiàn)用“+”表示，陰性表現(xiàn)用“—”表示，并記錄了陽性表現(xiàn)的出現(xiàn)比例及起始時間(實驗結(jié)束后對全部實驗動物進行大體解剖，其組織器官的體積，顏色，質(zhì)地均未見異常。
表6急性毒性實驗結(jié)果
注：
(1)a組實驗組大鼠偶發(fā)呼吸急促(1/20)，給藥后30min出現(xiàn)，持續(xù)2min。
(2)a組實驗組大鼠自發(fā)活動增多(3/20)，表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)，給藥后3-15天間歇性出現(xiàn)。
(3)b組實驗組beagle犬自發(fā)活動增多(2/20)，表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)，給藥后7-14天間歇性出現(xiàn)。
(4)a組空白對照組大鼠出現(xiàn)困倦(2/20)，表現(xiàn)為偶爾昏睡，正常飼養(yǎng)第8-13天間歇性出現(xiàn)。
(5)b組空白對照組beagle犬出現(xiàn)困倦(1/20)，表現(xiàn)為偶爾昏睡，正常飼養(yǎng)第9-11天間歇性出現(xiàn)。
(6)b組實驗組beagle犬出現(xiàn)小微血管擴張(1/20)，表現(xiàn)為舌、耳、結(jié)膜、陰囊發(fā)紅、體熱等，給藥后5-13天出現(xiàn)。
實驗結(jié)果
1.最高劑量下，a組實驗組大鼠偶發(fā)的呼吸急促，持續(xù)時間很短，考慮可能與該大鼠心肺功能不全有關(guān)。
a組實驗組3只大鼠及b組實驗組2只beagle犬在給藥后分別出現(xiàn)了間歇性的自發(fā)活動增加，探究，梳理毛發(fā)，運動增加，考慮是由于干細(xì)胞增殖，增加了神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)使其表現(xiàn)為興奮狀態(tài)。
另有a組對照組2只大鼠及b組對照組1只beagle犬出現(xiàn)昏睡狀態(tài)，但易警醒而恢復(fù)正?；顒?，睡眠中樞短暫受到抑制，考慮可能與飼養(yǎng)環(huán)境較封閉，運動減少，通風(fēng)不良有關(guān)。
b組實驗組1只beagle犬出現(xiàn)體表微血管擴張，微循環(huán)加快，考慮為心輸出量增加，或局部環(huán)境溫度過高所致。
2.起始劑量a到中間劑量b均未出現(xiàn)有意義的陽性表現(xiàn)，說明組合物懸液作用于動物的安全性高，最高劑量下偶發(fā)中樞神經(jīng)興奮，說明其不良反應(yīng)少，受試者安全范圍為大鼠0～5.0ml/kg，beagle犬0～2.5ml/kg，毒性反應(yīng)小，對心腦肺等重要器官基本無不良影響，并且短時間內(nèi)可恢復(fù)正常。
長期毒性實驗
受試者：spf級sd大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量80-90g。動物飼養(yǎng)于spf級實驗動物實驗室條件下，室內(nèi)溫度19-22℃，相對濕度40％-50％，每籠6只動物，給予鼠全價顆粒飼料，自由攝食、飲水。
實驗方法：
將組合物懸液每日上午以最大劑量2.0ul/kg尾靜脈注射給藥1次，對照組注射等劑量的蒸餾水，每周稱1次體重并記錄攝食量，根據(jù)體重的變化重新計算給藥量。根據(jù)急性毒性試驗、藥效學(xué)試驗結(jié)果確定組合物懸液高劑量組2.0ul/kg、中劑量組1.0ul/kg、低劑量組0.5ul/kg。
觀察指標(biāo)：
1.一般觀察給藥期間，觀察動物的外觀，行為活動，飲食、糞便及被毛的情況，并記錄體質(zhì)量(每周稱重1次)、進食量、進水量。
2.血液學(xué)檢查采用美國雅培cd-1200型全自動血球記數(shù)儀，測定紅細(xì)胞(rbc)、白細(xì)胞(wbc)、血小板(plt)、紅細(xì)胞壓積容量(hct)、紅細(xì)胞平均體積(mcv)、平均血紅蛋白含量(mch)、平均血紅蛋白濃度(mchc)、淋巴細(xì)胞數(shù)目(lym)、單核細(xì)胞數(shù)目(mid)、粒細(xì)胞數(shù)目(gra)、紅細(xì)胞分布寬度(rdw)和血紅蛋白(hgb)。
3.血液生化檢測采用日本日立7610型自動儀，測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、總蛋白(tp)、白蛋白(alb)、尿素氮(urea)、肌酐(crea)和總膽紅素(tb)等。
4.系統(tǒng)尸解及臟器系數(shù)全面細(xì)致觀察每只動物的臟器，并稱量每只動物的心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺和腦等，并計算臟器系數(shù)。
表7組合物懸液對給藥180d末期大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響
表8組合物懸液對停藥15d后大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響
表9組合物懸液對給藥180d末期大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響
表10組合物懸液對停藥15d后大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響
表11組合物懸液對給藥180d末期大鼠臟器系數(shù)的影響
結(jié)論：大鼠長期毒性實驗以3個劑量(即2.0，1.0，0.5ul/kg)連續(xù)給藥6個月及停藥2周后，對大鼠一般狀況、體質(zhì)量增長無明顯影響；血液學(xué)指標(biāo)及血液生化學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，對大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器重量，臟器系數(shù)與對照組比較均無顯著差異，并對大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、子宮等重要臟器進行組織檢查也未見明顯病理改變。故本實驗結(jié)果提示組合物懸液在大鼠6個月長期毒性實驗中，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)及延遲性毒性反應(yīng)，可以安全地應(yīng)用于臨床。
血管刺激性、溶血、過敏性實驗
材料：組合物懸液，其中干細(xì)胞的含量為8×107個/ml、5％葡萄糖注射液、甲醛、白蛋白、牛血清白蛋白、白百破三聯(lián)疫苗和伊文思藍(lán)。
受試動物：日本大耳白家兔，體重2-3kg，雌雄兼用；荷蘭豚鼠，體重200-250g，雄性；sd大鼠，體重180-220g，雄性。
血管刺激性實驗
實驗開始前，動物預(yù)先飼養(yǎng)1周以觀察其活動表現(xiàn)，動物室溫度22-24℃，濕度40％-60％。取家兔3只，右側(cè)耳緣靜脈以無菌操作方法注射量為8.3ml/kg(注：由于該系列實驗涉及到受試物的耐受性，因此選用干細(xì)胞懸液范圍中的最大濃度進行試驗)的組合物懸液，左側(cè)耳緣靜脈注射等體積5％葡萄糖注射液，1次/d，連續(xù)給藥5d。上述兩組均分別于末次給藥后96h，肉眼觀察注射部位有無紅腫、充血等刺激現(xiàn)象，處死動物，以耳緣靜脈注射點至向心方向，連續(xù)取3段血管連同周圍組織，每段1cm，用10％甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切5μm薄片，he染色，光鏡下做組織學(xué)檢查，另一側(cè)對照血管也同法處理。
溶血實驗
制備2％兔紅細(xì)胞混懸液，取健康家兔1只，自心臟取血約20ml，置于三角瓶中，用玻璃棒攪拌，除去纖維蛋白，然后將血移入刻度離心管內(nèi)，加入生理鹽水10ml，混勻后離心5min(2000-2500r/min)，去除上清液，再加生理鹽水混勻離心，反復(fù)洗滌3-4次，至上清液無色透明，將所得紅細(xì)胞按其容積用生理鹽水稀釋成2％的混懸液。
取干凈試管7支，編號排列于試管架上，按配比量依次加入2％兔紅細(xì)胞混懸液和生理鹽水，混勻后，置于37℃恒溫箱中30min，然后于1-5管中加入不同量的組合物懸液，分別為1ml、2ml、3ml、4ml和5ml，6號管中加入1ml生理鹽水，7號管中加入1ml溶血素。(第6管為陰性對照管，第7管為陽性對照管)，搖勻，置37℃恒溫箱中進行溫育，觀察0.25、0.5、0.75、1、2、3和24h有無溶血及凝集情況。
結(jié)果判定：
全溶血：溶液澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留。
部分溶血：溶液澄明紅色或棕色，管底有少量紅細(xì)胞殘留。
無溶血：紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無色澄明。
凝集：雖不溶血，但出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，振搖后不能分散。
全身主動過敏實驗
實驗開始前，動物預(yù)先飼養(yǎng)1周以觀察其活動表現(xiàn)，動物室溫度22-24℃，濕度40％-60％。
取48只健康雄性豚鼠，隨機分成5％葡萄糖注射液組、陽性藥物組(白蛋白組)、組合物懸液大劑量組和組合物懸液小劑量組，每組12只。分別給各組豚鼠隔日腹腔注射5％葡萄糖注射液、陽性藥物25mg/kg，組合物懸液4.16ul/kg，體積為0.5ml，共注射3次，然后每組內(nèi)分成兩批，第1次給藥后14d及21d分別靜脈注射5％葡萄糖注射液、陽性藥物50mg/kg和組合物懸液16.64ul/kg，體積為1ml，觀察豚鼠在靜脈注射后30min內(nèi)有無表12中的躁動、搔鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、甚至死亡等過敏反應(yīng)癥狀。
表12過敏反應(yīng)癥狀
被動皮膚過敏實驗
制備大鼠含ige的抗血清，清取4只健康雄性sd大鼠，按注射劑大鼠同種被動皮膚過敏試驗的要求，分別腹腔注射5％葡萄糖注射液、牛血清白蛋白25mg/kg、組合物懸液4.16ul/kg和白百破三聯(lián)疫苗1ml/只，隔日1次、共3次。11d后眼眶取血，分離血清，－20℃保存，備用。
實驗開始前，動物預(yù)先飼養(yǎng)1周以觀察其活動表現(xiàn)，動物室溫度22-24℃，濕度40％-60％。
取16只健康雄性sd大鼠，隨機分為5％葡萄糖組、陽性組(牛血清白蛋白組)、組合物懸液大劑量組和小劑量組。分別在各組大鼠背中線兩側(cè)距脊柱約1.5cm處備皮，4cm×4cm。
取上述含ige的抗血清，用5％葡萄糖注射液按1:2、1:4、1:8和1:16比例分別稀釋成4個稀釋度，將稀釋的抗血清按逆時針方向(左上-左下-右下-右上)皮內(nèi)注射于大鼠背部預(yù)先備皮部位，每一稀釋度注射一個點，每點注射0.1ml。致敏24h后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的0.8％伊文思藍(lán)染料共1ml，進行激發(fā)。30min后處死各組大鼠，測量皮膚內(nèi)層的藍(lán)色反應(yīng)斑直徑，直徑大于5mm者判定為陽性。不規(guī)則斑點的直徑為長徑與短徑之和。
結(jié)果：
1.血管刺激性實驗：給藥組3只家兔耳緣靜脈注射部位均未見紅腫、充血等刺激現(xiàn)象。光鏡病理組織學(xué)檢查：組合物懸液給藥組和5％葡萄糖對照組家兔耳緣靜脈注射部位血管結(jié)構(gòu)完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹、變性、壞死，管壁無炎細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)無血栓形成。
2.溶血性實驗：在0.25-3h及24h內(nèi)除第7管(陽性對照管)溶液呈現(xiàn)澄明紅色，其余6管均末見澄明紅色，且紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無色澄明，經(jīng)振搖后紅細(xì)胞能均勻分散。表明組合物懸液無溶血及無凝集作用。
3.全身主動過敏實驗：5％葡萄糖注射液組、組合物懸液大劑量組、組合物懸液小劑量組在靜脈給藥30min后，豚鼠活動正常，未出現(xiàn)1-20級反應(yīng)癥狀，判定為過敏反應(yīng)陰性。而陽性藥組豚鼠出現(xiàn)痙攣、抽搐、休克死亡，判定為過敏反應(yīng)極強陽性。
4.被動皮膚過敏實驗：組合物懸液大劑量組、組合物懸液小劑量組和5％葡萄糖注射液組大鼠背部皮膚均未見藍(lán)色反應(yīng)斑點。陽性組注射部位皮膚均不同程度的出現(xiàn)藍(lán)色斑點反應(yīng)，其中1:16處有3例出現(xiàn)藍(lán)斑，1:8處有4例出現(xiàn)藍(lán)斑，1:4與1:2處6例均出現(xiàn)藍(lán)斑，藍(lán)斑直徑均大于5mm，判定為陽性反應(yīng)。結(jié)果表明：組合物懸液無同種被動皮膚致敏作用。
結(jié)論：
本實驗采用的方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，4項指標(biāo)檢測組合物懸液均未出現(xiàn)陽性結(jié)果，說明組合物懸液對血管無刺激性，無溶血作用，全身主動過敏反應(yīng)陰性，無同種被動皮膚致敏作用。表明組合物懸液安全性好，可供臨床應(yīng)用。
試驗例1
使用實施例1至3任一的所述組合物，對6-羥多巴胺損毀制備的帕金森病大鼠模型行為學(xué)的影響進行試驗。
以體重250～300g的健康雄性wistar大鼠80只為受試者，以60只雄性wistar大鼠作為建模群體，
1)構(gòu)建模型
a.建模群體的大鼠稱重并腹腔注射戊巴比妥鈉48mg/kg麻醉。
b.將麻醉后的大鼠固定于江灣i型腦立體定位儀上，頭部正中切口，剝離骨膜，止血。參照george圖譜，用牙科鉆在顱骨頂鉆孔，定位坐標(biāo)為：門齒與耳桿平行，前囪后3mm，旁開3.0mm，顱骨表面下9.0mm，將自制同心套管插入右側(cè)ns區(qū)(套管外徑0.7mm，內(nèi)管外徑0.4mm，內(nèi)管比外管前端長1.5mm),用502膠和自凝牙托粉固定。
c.微量注射器吸6-ohda溶液4μl(含9.0μg6-ohda和8.8μg抗壞血酸)，速度為1μg/min，注射后留置4min退出，縫合皮膚。
d.21天參照francois的實驗方法(包括行動遲緩實驗、抓握實驗和尾強直實驗記錄強直癥狀的變化、震顫實驗)記錄帕金森氏病的三大癥狀.并記錄肌電圖變化，以鑒別大鼠模型建立是否成功。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①出現(xiàn)行動遲緩實驗持續(xù)35min②抓握實驗持續(xù)55min、尾強直實驗持續(xù)30min③震顫頻率在48次/分以上和肌電圖群放電位頻率在4-8次/秒。
2)對比試驗
選取建模成功的60只大鼠，并將其隨機分為40只的試驗組和20只模型對照著，以及以20只雄性wistar大鼠作為空白對照組
分別將試驗組的40只大鼠自尾靜脈注射組合物懸液0.5ml/100g。模型對照組的20只大鼠注射生理鹽水0.5ml/100g?？瞻讓φ战M大鼠不予處理。
觀察方法：以上大鼠在相同環(huán)境下正常飼養(yǎng)12-16周，分別進行以下定量觀察：1)直桿實驗：測試實驗動物的運動協(xié)調(diào)和平衡能力；2)懸掛實驗：檢測實驗動物的神經(jīng)肌肉異常和運動力量；3)游泳實驗：檢測實驗動物的體力和運動能力。
3)實驗結(jié)果：
直桿實驗
建模前，各組大鼠在塑料桿上的表現(xiàn)均為合格，水平放置和傾斜位置時都能在桿上不掉下來。
建模后，大鼠不能全部完成直桿實驗，大多數(shù)大鼠在橫桿傾斜到45度之前掉落橫桿，能夠完成的合格率僅有3％。
試驗組大鼠進行干細(xì)胞懸液注射處理后，82％的大鼠經(jīng)過訓(xùn)練能夠完成該實驗，而經(jīng)生理鹽水注射處理的模型對照組大鼠仍然無法完成該實驗。
鋼絲懸掛實驗
建模前，各組大鼠在鋼絲籠蓋上的表現(xiàn)均為合格，能夠緊緊抓住翻轉(zhuǎn)過來的蓋子而不掉下來。
建模后，大鼠不能完成該實驗，大多數(shù)大鼠在持續(xù)懸掛60秒左右掉落，合格率不足1％。
在對試驗組大鼠進行干細(xì)胞懸液注射處理后，90％的大鼠經(jīng)過訓(xùn)練能夠完成該實驗，而經(jīng)生理鹽水注射處理的模型對照組大鼠仍然無法完成該實驗。
游泳實驗
建模前，對各組大鼠進行連續(xù)3天，每天20分鐘的適應(yīng)性訓(xùn)練，全部大鼠在水槽中的表現(xiàn)均為合格，能夠連續(xù)在水中運動，下沉次數(shù)較少。
建模后，大鼠不能全部完成該實驗，95％的大鼠出現(xiàn)了易疲勞，反復(fù)下沉的表現(xiàn)。
在對試驗組大鼠進行干細(xì)胞懸液注射處理后，89％的大鼠經(jīng)過訓(xùn)練能夠完成該實驗，而經(jīng)生理鹽水注射處理的模型對照組大鼠仍然無法完成該實驗。
試驗例2
受試者：76歲男性帕金森??；
試驗過程：經(jīng)靜脈滴注組合物懸液一次，用量分別為45ml的臍血提取物濃度為6.2×105個/ml組合物懸液；
試驗效果：
受試前，3年前開始出現(xiàn)隨意運動困難，動作緩慢，吃力。后逐漸出現(xiàn)右手靜止性震顫，頭部震顫，面部表情僵硬，走路時步幅縮短，步態(tài)慌張，雙臂肌肉強直。睡眠差，易激惹。
受試45天后，該患者情緒明顯穩(wěn)定，精神好，頭部震顫頻率逐漸減低，肌肉較從前松弛，表情較從前增多，行走較從前穩(wěn)健，睡眠規(guī)律，質(zhì)量較前有明顯改善，經(jīng)自體對比可見，臍帶血干細(xì)胞進入體內(nèi)后，可以自動識別并移行至細(xì)胞損傷部位，分裂增殖成新的黑質(zhì)細(xì)胞，替代退行的神經(jīng)細(xì)胞分泌多巴胺，抑制乙酰膽堿的作用，從而緩解“震顫麻痹”的癥狀，逐漸恢復(fù)大腦功能和自主行為能力。
試驗例3
受試者：68歲男性以震顫為首發(fā)癥狀的帕金森?。?/p>
試驗過程：經(jīng)靜脈滴注組合物懸液二次，間隔2個月，用量分別為50ml的臍血提取物濃度為5.7×105個/ml組合物懸液和為55ml的臍血提取物濃度為4.9×105個/ml組合物懸液。
試驗效果：
受試前，2年前左手手指開始出現(xiàn)緩慢節(jié)律性震顫，且癥狀表現(xiàn)逐漸加重，現(xiàn)已波及頭部與左上肢。四肢及面部肌肉僵直，隨意運動受限，走路步距小，呈慌張步態(tài)，對事物反應(yīng)明顯變慢。
受試6個月后，以上癥狀明顯緩解，震顫頻率降低，肌張力較前有所降低，精神狀態(tài)較好，睡眠佳。
試驗例4
受試者：82歲女性帕金森病患者，同時伴有老年性癡呆癥狀。
試驗過程：經(jīng)靜脈滴注組合物懸液，用量為60ml的臍血提取物濃度為5.8×105個/ml組合懸液；
試驗效果：
受試前，5年前逐漸出現(xiàn)震顫麻痹的癥狀，認(rèn)知功能減退，自發(fā)運動減少，動作困難吃力，時常健忘，不能處理日常事務(wù)。
受試3個月后，患者震顫麻痹的頻率較前明顯降低，可做簡單的自主運動，可主動與人交流，認(rèn)知障礙也有所緩解。
試驗例5
受試者：79歲男性重度帕金森??；
試驗過程：經(jīng)靜脈滴注組合物懸液三次，每次間隔2個月，用量分別為58ml的臍血提取物濃度為5.5×105個/ml組合物懸液，61ml的臍血提取物濃度為5.8×105個/ml組合物懸液和60ml的臍血提取物濃度為5.7×105個/ml組合物懸液；
試驗效果：
受試前，5年前出現(xiàn)震顫麻痹的癥狀，后逐漸出現(xiàn)僵直，協(xié)調(diào)功能障礙，累及運動功能，動作笨拙，缺乏面部表情，說話含糊，音量低，免疫功能低下，經(jīng)常感冒，且情緒上伴有焦慮抑郁。
受試6個月后，經(jīng)家屬反饋患者精神狀況得到改善，面部肌肉的僵直有所緩解，8個月后該患者震顫頻率較前明顯降低，自主動作較前靈活，可主動與他人進行簡單的日常交流，且語句較清晰，音量增高。
在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可對本發(fā)明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。由本發(fā)明的說明書得到的其他實施方式對技術(shù)人員而言是顯而易見得的。本申請說明書和實施例僅是示例性的。