本發(fā)明涉及肺纖維化治療領(lǐng)域，特別涉及富勒烯或其可藥用鹽在制備用于治療肺纖維化的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺纖維化(pulmonaryfibrosis，pf)是指由于炎癥導(dǎo)致肺部實質(zhì)細胞發(fā)生壞死、組織內(nèi)細胞外基質(zhì)異常增多和過度沉積等因素引起的最終病理結(jié)局，輕者導(dǎo)致肺部組織纖維化，重者引起肺部組織結(jié)構(gòu)破壞而發(fā)生器官硬化。肺纖維化可發(fā)生于各種環(huán)境中，包括不明原因的刺激、環(huán)境或職業(yè)暴露(如石棉、二氧化硅)、由藥物引起(如博來霉素)、或者繼發(fā)于其他疾病，如免疫復(fù)合物亦可誘導(dǎo)肺纖維化。

特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis,ipf)是一種慢性、進行性、纖維化性間質(zhì)性肺炎^[1]，該種疾病以慢性非實質(zhì)損害和纖維化為特征，發(fā)病機制尚不十分清楚。目前認為ipf起源于肺泡上皮反復(fù)發(fā)生微小損傷后的異常修復(fù)，進而導(dǎo)致瘢痕形成以及肺結(jié)構(gòu)破壞^[2,^3]。ipf的發(fā)病可分為三期：(1)前驅(qū)期：環(huán)境因素(吸煙、感染、胃食管反流物等)及遺傳因素(sftpc基因突變等)共同作用，引起反復(fù)的肺泡上皮損傷及異常的損傷修復(fù)反應(yīng)；(2)起始期：部分上皮細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使得部分肺泡上皮凋亡、分泌大量致纖維化因子，包括血小板源性生長因子(pdgf)、成纖維細胞生長因子(fgf)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、轉(zhuǎn)化生長因子13(tgf-13)家族、白細胞介素13(il-13)等，上述因子可以誘發(fā)上皮細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，也可以招募纖維細胞到肺部，并促進成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞分化，形成成纖維細胞灶；(3)進展期：上述間充質(zhì)細胞分泌大量異?；|(zhì)蛋白(主要是膠原蛋白沉積)，使得肺組織重構(gòu)和瘢痕化，最終形成肺纖維化。ipf的主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂和肺纖維化，最終導(dǎo)致肺臟結(jié)構(gòu)和功能的嚴重破壞，其病理主要表現(xiàn)為早期彌漫性肺泡炎及后期大量間質(zhì)細胞增生、基質(zhì)膠原進行性聚集以致取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)，嚴重影響肺的通氣和換氣功能，最終導(dǎo)致呼吸功能衰竭而死亡。

ipf是一種慢性、致死性的疾病，5年生存率通常僅為20％。目前ipf有效的治療藥物只有吡非尼酮和尼達尼布。然而，吡非尼酮有肝功能損害、暈眩以及光過敏等副作用^[4,5]，尼達尼布則可使患者出現(xiàn)肝酶升高、腹瀉等不良反應(yīng)^[6]，影響了臨床廣泛應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)對于肺纖維化、尤其是ipf副作用較低的新型治療藥物。

大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化/抗氧化失衡在ipf的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用^[7]，氧化應(yīng)激與ipf的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)^[9-12]。氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)高活性物質(zhì)如活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)產(chǎn)生過多，超出了機體的清除能力，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡的一種狀態(tài)。ros又稱反應(yīng)性氧類物質(zhì)，其產(chǎn)生過多是導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激的直接因素，并且活性氧也是肺纖維化進程中的重要介質(zhì)。當(dāng)ros持續(xù)高濃度存在，極易與周圍生物大分子物質(zhì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，損害細胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生^[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，ipf患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchialalveolarlavagefluid,balf)中能檢測到大量脂質(zhì)過氧化物^[9]；肺中的抗氧化物質(zhì)含量明顯減少，肺功能與氧化應(yīng)激水平呈負相關(guān)^[10]；肺纖維化的程度與氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)^[11]。大量ros可以使dna單鏈破壞、斷裂，導(dǎo)致肺上皮細胞損傷壞死；激活死亡受體^[13]、線粒體凋亡途徑^[14]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑^[15]等誘導(dǎo)肺上皮細胞凋亡；破壞組織中蛋白酶/抗蛋白酶平衡^[16]，促進膠原沉積，從而促進ipf的發(fā)生發(fā)展。此外，ros能通過調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白磷酸酶受體途徑來調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進tgf-β1、tnf-α、白細胞介素、血小板衍生生長因子等細胞因子的表達^[17]。其中，tgf-β1在肺纖維化形成過程中起關(guān)鍵性作用，被認為是誘導(dǎo)器官纖維化(包括肺纖維化)的“總開關(guān)”^[18]，其數(shù)量最終決定炎癥和纖維化的程度^[19,20]；tnf-α則可以介導(dǎo)呼吸道上皮細胞凋亡，并且上調(diào)促纖維化細胞因子tgf-β1的表達，是促進肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因子^[21]。這些細胞因子表達增高可以加劇細胞損傷凋亡，加劇肺纖維化發(fā)展，然而這些細胞因子表達上調(diào)也可以刺激機體產(chǎn)生更多的ros，使機體處于高ros的環(huán)境中，造成機體持續(xù)損傷，形成一個惡性循環(huán)。如果能糾正體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，將有可能減輕肺纖維化的程度^[12]，因此抗氧化劑有望成為治療肺纖維化的一種新方法。

富勒烯是除兩種天然存在的元素碳的同素異形體：石墨和金剛石外人類發(fā)現(xiàn)的第三種元素碳的同素異形體^[22]，其具有封閉籠狀結(jié)構(gòu)，類似于足球的形狀。富勒烯的發(fā)現(xiàn)者因此獲得了1996年諾貝爾化學(xué)獎。富勒烯分子在各種類型的球體中含有32-1000個或以上的碳原子。由于富勒烯獨特的球狀結(jié)構(gòu)，在表面上充滿π電子，因此其具有許多特殊的性質(zhì)，目前在電子、醫(yī)療、醫(yī)學(xué)和以增進健康等為目的的應(yīng)用中得到了越來越多的關(guān)注。

隨著對富勒烯的關(guān)注日益增加，在過去對富勒烯在藥品和化妝品中的應(yīng)用進行了大量研究，也提出了許多方案。例如，將富勒烯或者富勒烯混合物混配到化妝品中(日本專利特開平6-192039)、利用富勒烯的紫外線吸收效果制成防曬用化妝品組合物(日本專利特開平9-278625)、以富勒烯作為光敏感劑光學(xué)地使病毒失去活性的方法(日本專利特開平9-322767)、以富勒烯作為抗氧化劑在皮膚外用劑等中的應(yīng)用(日本專利特開2004-250690)、以富勒烯作為抗氧化劑在自由基疾病預(yù)防治療用組合物中的應(yīng)用(中國專利申請cn101098684a)等。

在眾多的富勒烯中，尤以富勒烯c60、c70、c82、c84研究的最為充分。富勒烯c60是80年代中期新發(fā)現(xiàn)的一種碳原子簇，是一種由60個碳原子構(gòu)成的分子，它形似足球，因此又名足球烯，其表面有大量的共價雙鍵，極易與游離基反應(yīng)^[23]。正是由于這一特性，富勒烯c60及其衍生物可以通過清除自由基而達到抗氧化的作用，并且抑制dna氧化損傷^[23,24]。近年來，富勒烯作為一種抗氧化劑被廣泛用于各種生命科學(xué)研究，研究表明富勒烯c60可以抑制腫瘤生長^[25,26]，增強多柔比星等化療藥物對腫瘤的治療效果并減輕其副作用^[27]。中國專利申請cn101098684a等大量文獻中公開了富勒烯c60、c70、c82、c84因其抗氧化性質(zhì)而被用于腫瘤、抗菌等方面的研究。

然而，目前并無將富勒烯用于治療肺纖維化、尤其是ipf誘導(dǎo)的肺纖維化的任何報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明以富勒烯c60為例，以博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化為模型，腹腔注射富勒烯對其進行干預(yù)，通過比較富勒烯干預(yù)組與模型組在干預(yù)前后小鼠的存活率、體重變化、肺泡炎癥和纖維化程度、膠原合成等方面，發(fā)現(xiàn)富勒烯可以提高博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的生存率、減緩小鼠體重下降趨勢、減輕病理形態(tài)學(xué)上纖維化程度、顯著降低肺組織膠原沉積和ros含量，證明了富勒烯對ipf的緩解和治療作用，由此完成了本發(fā)明。

本發(fā)明提供了富勒烯或其可藥用鹽在制備用于治療肺纖維化的藥物中的應(yīng)用，其中所述富勒烯或其可藥用鹽以治療有效量存在于所述藥物中。

所述肺纖維化可以由任何因素最終導(dǎo)致。優(yōu)選地，所述肺纖維化由特發(fā)性肺纖維化導(dǎo)致。

優(yōu)選地，所述富勒烯選自富勒烯c60、c70、c82、c84或其混合物。

優(yōu)選地，所述富勒烯包含結(jié)合含氧基、含氮基、烴基中的一種或多種的富勒烯，所述烴基任選具有取代基。

優(yōu)選地，所述富勒烯的可藥用鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、鋁鹽和/或磺酸鹽。

可用于本發(fā)明的富勒烯優(yōu)選為富勒烯c60。優(yōu)選地，所述富勒烯c60可以為難溶于水的富勒烯c60，其可通過溶于體內(nèi)適用的有機溶劑，包括但不限于食用油例如玉米油、棉籽油、大豆油、芝麻油、花生油、椰子油和/或橄欖油等而進行給藥。優(yōu)選地，所述富勒烯c60為經(jīng)過水溶性修飾的富勒烯c60。

根據(jù)本發(fā)明，所述水溶性修飾的富勒烯c60具有下式表示：f(-x)m，其中

f為富勒烯c60核；

x各自獨立為oh、(ch2)n-so3h、或(ch2)n-so3-的金屬鹽，其中每個n獨立的為2-50之間的整數(shù)；以及

m為2-40之間的整數(shù)。

優(yōu)選地，所述藥物的給藥途徑為口服、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)和/或肌內(nèi)注射。

優(yōu)選地，所述藥物包括可藥用的賦形劑。優(yōu)選地，所述可藥用的賦形劑包括稀釋劑、粘合劑、分散劑、表面活性劑、潤滑劑、包衣材料、調(diào)味劑、著色劑、控制釋放制劑和/或甜味劑等。

優(yōu)選地，所述藥物劑型包括片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、咀嚼膠劑、混懸劑、乳液、注射溶液和/或脂質(zhì)體注射懸液。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)富勒烯可以明顯降低肺纖維化小鼠肺組織中ros的含量。并且，發(fā)明人觀察到富勒烯干預(yù)后，tgf-β1與tnf-α的含量較blm組明顯降低，提示富勒烯可以使tgf-β1與tnf-α的表達減少(結(jié)果未示出)。所以，發(fā)明人推測富勒烯可能是通過降低ros的含量，從而減輕過多的活性氧對肺組織的損傷，進而降低tgf-β1、tnf-α等細胞因子的表達，最終減輕炎癥及纖維化的程度，達到抑制肺纖維化的效果。

另外，富勒烯生物安全性好、毒副作用低，本發(fā)明中使用的富勒烯c60沒有毒副作用^[28,29]，并且口服富勒烯c60可以將大鼠的壽命延長一倍^[30]。因此富勒烯更有可能成為臨床上一種新的抗肺纖維化治療藥物。

附圖說明

圖1示出了博來霉素(blm)模型組和富勒烯c60各劑量組(1、10、100和500mg/kg)在給藥后小鼠生存率隨時間的變化情況。

圖2示出了空白對照組(ns)、博來霉素(blm)模型組和富勒烯c60各劑量組(1、10、100和500mg/kg)在給藥后小鼠體重隨時間的變化情況。

圖3示出了在造模第28天時各處理組小鼠肺部ct圖像。a為正常小鼠肺部ct；b為blm模型組小鼠肺部ct；c為blm誘導(dǎo)后10mg/kgc60處理組小鼠肺部ct；d為blm誘導(dǎo)后吡非尼酮處理組小鼠肺部ct。

圖4示出了在造模第28天時各處理組小鼠病理he(上圖)及masson(下圖)染色結(jié)果。a為正常小鼠肺部病理；b為blm模型組小鼠肺部病理；c為blm誘導(dǎo)后10mg/kgc60處理組小鼠肺部病理；d為blm誘導(dǎo)后吡非尼酮處理組小鼠肺部病理。

圖5示出了在造模第28天時各處理組ashcroft評分結(jié)果。ns：空白對照組；blm：博來霉素模型組；blm+c60：blm誘導(dǎo)后10mg/kgc60處理組；blm+pir：blm誘導(dǎo)后吡非尼酮處理組。**p<0.01；**p<0.001。

圖6示出了在造模第28天時各處理組小鼠肺部膠原免疫組化染色結(jié)果。a為正常小鼠肺部病理；b為blm模型組小鼠肺部病理；c為blm誘導(dǎo)后10mg/kgc60處理組小鼠肺部病理；d為blm誘導(dǎo)后吡非尼酮處理組小鼠肺部病理。

圖7示出了圖6所示膠原免疫組化染色結(jié)果的統(tǒng)計分析。ns：空白對照組；blm：博來霉素模型組；blm+c60：blm誘導(dǎo)后10mg/kgc60處理組；blm+pir：blm誘導(dǎo)后吡非尼酮處理組。*p<0.05；**p<0.01。

圖8示出了在造模第28天時各處理組小鼠肺組織內(nèi)ros含量。ns：正常對照組；blm：博來霉素模型組；c6010mg/kg：c6010mg/kg處理組。*p<0.05；***p<0.001。

具體實施方式

下面，將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明的范圍將不限于此。

除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同的意義。在本文中具體提到的所有出版物，為包括描述和公開在出版物中報道的可能與本發(fā)明相結(jié)合使用的化學(xué)物質(zhì)、儀器、統(tǒng)計分析和方法在內(nèi)的所有目的，以其全部內(nèi)容通過參考并入本文。在本說明書中引用的所有參考文獻應(yīng)該被視為指示了本領(lǐng)域的技術(shù)水平。本文中的任何內(nèi)容不應(yīng)被解釋為承認本發(fā)明沒有權(quán)利早于通過在先發(fā)明的這些公開。

富勒烯本身難溶于水，可通過溶于體內(nèi)適用的有機溶劑而給藥到體內(nèi)。為方便給藥，富勒烯可以經(jīng)過水溶性修飾，使其具備水溶性。制備水溶性富勒烯的方法在本領(lǐng)域中是已知的，其制備方法具體可參見美國專利no.5,994,410、no.5,177,248、no.5,294,732、duganl.l.etal，procnatlaadsci.usa94:9434-9439等，這些現(xiàn)有技術(shù)文件均以其整體通過引用并入本文。

當(dāng)在本文中使用時，“可藥用”包括在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適于與人類和動物的組織接觸而無過多毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或者與合理的效益/風(fēng)險比相稱的其它問題并發(fā)癥的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。

在說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“包括”和“包含”是開放性術(shù)語，并且應(yīng)該被解釋為意味著“包括但不限于”。這些術(shù)語涵蓋了更加限制性的術(shù)語“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”。還應(yīng)該指出，術(shù)語“包含”與“包括”、“特征在于”與“具有”可以互換使用。

當(dāng)在本文中和權(quán)利要求書中使用時，沒有具體數(shù)量的指稱包括其單數(shù)或復(fù)數(shù)指稱物，除非上下文明確敘述不是如此。此外，無具體數(shù)量的指稱、術(shù)語“一個或多個”和“至少一個”可以互換使用。

當(dāng)提供值的范圍時，應(yīng)該理解，在所述范圍的上下限之間的每個居間值和居間值的任何組合或子組合，以及所述陳述的范圍內(nèi)的任何其他陳述的或居間的值，都被涵蓋在所敘述的值的范圍之內(nèi)。

當(dāng)在本文中使用時，“給藥”是指將化合物導(dǎo)入到受試者的身體中，優(yōu)選導(dǎo)入到受試者的系統(tǒng)循環(huán)中，正如在下面更詳細描述的。實例包括但不限于口服、表面、頰、舌下、肺、透皮、透粘膜以及皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)注射，或采取通過消化道的液體或固體藥劑的形式。

當(dāng)在本文中使用時，化合物的“治療有效量”是足以在疾病或病癥的治療或管理中提供治療性益處，或延遲或最小化與所述疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的量。化合物的“治療有效量”意味著單獨或與其他療法組合時，在所述疾病或病癥的治療或管理中提供治療性益處的治療藥劑的量。術(shù)語“治療有效量”可以涵蓋改善總體治療、減少或避免疾病或病癥的癥狀或病因、或提高另一種治療藥劑的治療效能的量?！爸委熡行Я俊睂㈦S著化合物、待治療的疾病狀態(tài)、待治療疾病的嚴重性、受試者的年齡和相對健康、給藥途徑和形式、主治醫(yī)療或獸醫(yī)從業(yè)人員的判斷和其他因素而變。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“治療”考慮到了在患者患有指定疾病或障礙時采取的降低所述疾病或障礙的嚴重性或延遲或減慢所述疾病或障礙的進程的行動。

當(dāng)在本文中使用時，“受試者”包括哺乳動物和非哺乳動物?！安溉閯游铩笔侵覆溉榫V的任何成員，包括但不限于人類、非人類靈長動物例如黑猩猩和其他猿類和猴物種；農(nóng)場動物例如牛、馬、綿羊、山羊和豬，家畜例如兔、狗和貓；實驗室動物包括嚙齒動物例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳動物的實例包括但不限于鳥類等。術(shù)語“受試者”不指示特定年齡或性別。本發(fā)明所針對的主要受試者是用血液透析治療或接受血液透析的人類。術(shù)語“受試者”在本文中可以與術(shù)語“患者”或“個體”互換使用。

當(dāng)在本文中使用時，“口服劑型”可以包括膠囊(即由外殼和填充物構(gòu)成的固體口服劑型)，其中外殼由單一密封外套或配合在一起并有時用帶子密封的兩個半外套構(gòu)成，并且其中膠囊外殼可以由明膠、淀粉或纖維素或其他適合的材料制成，可以是軟質(zhì)或硬質(zhì)的，并且填充有可以傾倒或擠壓的固體或液體成分?？诜┬鸵部梢允悄z囊或包衣球粒，其中將藥物包封在由適合形式的明膠制成的硬質(zhì)或軟質(zhì)的可溶性容器或“外殼”內(nèi)。藥物本身可以采取顆粒的形式，所述顆粒已被施加不同量的包衣，或者采取延遲釋放包衣膠囊形式，其中藥物被包封在由適合形式的明膠制成的硬質(zhì)或軟質(zhì)的可溶性容器或“外殼”內(nèi)。此外，可以將膠囊覆蓋在指定的包衣中，其以與作為常規(guī)劑型存在的一種或多種藥物相比，至少允許降低給藥頻率的方式釋放一種或多種藥物。

口服劑型還可以是延遲釋放膠囊，其中藥物被包封在由適合形式的明膠制成的硬質(zhì)或軟質(zhì)的可溶性容器內(nèi)，并且其在不是給藥后立即的其他時間釋放藥物(或多種藥物)，因此腸溶包衣制品是延遲釋放劑型。藥物被包封在硬質(zhì)或軟質(zhì)容器或“外殼”內(nèi)的延遲釋放球粒膠囊，也是有用的。在這些情形中，藥物本身采取已被施加腸溶包衣的顆粒的形式，因此將藥物的釋放延遲到它通入到腸中為止。延遲釋放膠囊和薄膜包衣延遲釋放膠囊，也是有用的。

此外，將膠囊覆蓋在指定的薄膜包衣中，其以與作為常規(guī)劑型存在的一種或多種藥物相比，至少允許降低給藥頻率的方式釋放一種或多種藥物。明膠包衣的膠囊(其中藥物被包封在由適合形式的明膠制成的硬質(zhì)或軟質(zhì)的可溶性容器內(nèi)的固體劑型；通過加帶過程，將膠囊用另外的明膠層包衣，以便形成完整密封)，液體填充的膠囊(一種固體劑型，其中藥物被包封在通過添加多元醇例如山梨糖醇或甘油而增塑，并且因此具有比硬殼膠囊略微更稠的稠度的可溶性明膠外殼內(nèi))。

通常，活性成分可以被溶解或懸浮在液體介質(zhì)中，可以是顆粒(小粒子或細粒)、球粒(含有或不含賦形劑的由高度純化的藥物構(gòu)成的小的無菌固體物質(zhì)，其通過顆粒形成或通過壓制和模制來制造)或延遲釋放包衣的球粒(一種固體劑型，其中藥物本身采取顆粒的形式，所述顆粒已被施加不同量的包衣，并且其以與作為常規(guī)劑型存在的一種或多種藥物相比，允許降低給藥頻率的方式釋放一種或多種藥物)。

其他形式包括丸劑(旨在用于口服給藥的含有藥劑的小的圓形固體劑型)、粉劑(可能旨在內(nèi)服或外用的干燥的細粉藥物和/或化學(xué)物質(zhì)的密切混合物)、酏劑(含有溶解的藥劑的透亮、香味宜人的增甜的含水酒精液體；它旨在口服使用)、咀嚼膠劑(各種不同形狀的增甜和調(diào)味的不溶性塑性材料，其在被咀嚼時將藥物物質(zhì)釋放到口腔中)、糖漿(含有高濃度蔗糖或其他糖類的口服溶液；該術(shù)語也被用于包括在甜味和粘性介質(zhì)中制備的任何其他液體劑型，包括口服懸液)、片劑(含有藥物、帶有或不帶有適合的稀釋劑的固體劑型)、咀嚼片劑(用于咀嚼的含有藥物、帶有或不帶有適合的稀釋劑的固體劑型，其在口腔中產(chǎn)生口味怡人的殘留物，所述殘留物易于吞咽并且不留下苦味或令人不快的余味)、包衣片劑或延遲釋放片劑、可分散片劑、泡騰片劑、延遲釋放片劑、薄膜包衣片劑或薄膜包衣延遲釋放片劑，其中片劑被配制成使得所包含的藥物可以在攝入后長時間段內(nèi)可用。

在其他形式中，可以提供溶液用片劑、懸液用片劑、多層片劑、延遲釋放多層片劑，其中片劑被配制成與作為常規(guī)劑型存在的藥物相比，至少允許降低給藥頻率?？诜澜馄瑒⒖诜澜庋舆t釋放片劑、可溶性片劑、糖衣片劑、滲透片劑等，也是適合的。

口服劑型組合物可以包含活性藥物成分和一種或多種無活性藥物成分例如賦形劑、稀釋劑、增溶劑、醇類、粘合劑、受控釋放聚合物、腸溶聚合物、崩解劑、賦形劑、著色劑、調(diào)味劑、甜味劑、抗氧化劑、防腐劑、顏料、添加劑、填充劑、懸浮劑、表面活性劑(例如陰離子型、陽離子型、兩性或非離子型)等。各種fda批準的表面用無活性成分可以在fda的“無活性成分數(shù)據(jù)庫”(theinactiveingredientsdatabase)中找到，該數(shù)據(jù)庫含有制造商旨在用于此目的的無活性成分，其中根據(jù)21cfr210.3(b)(7)中給出的活性成分的定義，無活性成分在某些情況下也可以被當(dāng)作活性成分。酒精是取決于產(chǎn)品配方、可以被當(dāng)作有活性或無活性的成分的良好實例。

當(dāng)在本文中使用時，可注射和輸注的劑型包括但不限于可注射脂質(zhì)體，其由脂質(zhì)體構(gòu)成或形成脂質(zhì)體(通常由磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)雙層囊泡，其被用于包封活性藥物物質(zhì))。包含無菌制劑的旨在腸胃外使用的注射液，也是適合的。包括由無菌、無熱原制劑構(gòu)成的乳液，旨在腸胃外給藥的注射乳液或脂質(zhì)復(fù)合物注射液，也是適合的。

其他形式包括用于溶液注射的粉劑，其是無菌制劑，旨在重構(gòu)以形成用于腸胃外使用的溶液；用于懸液注射的粉劑，其是無菌制劑，制造重構(gòu)以形成用于腸胃外使用的懸液；用于脂質(zhì)體懸液注射的冷凍干燥的粉劑，其是無菌的冷凍干燥的制劑，旨在重構(gòu)用于腸胃外使用，其被配制成允許在重構(gòu)后形成脂質(zhì)體(通常由磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)雙層囊泡，其被用于將活性藥物物質(zhì)包封在脂質(zhì)雙層內(nèi)或水性空間中)；用于溶液注射的冷凍干燥的粉劑，其是通過凍干(“冷凍干燥”)制備的旨在用于溶液的劑型，所述凍干是涉及在極低壓力下，在冷凍狀態(tài)下從產(chǎn)品除去水的過程。

這旨在用于隨后添加液體以產(chǎn)生在所有方面符合注射要求的溶液；用于注射懸液的凍干粉劑，所述注射懸液是旨在腸胃外使用的含有懸浮在適合的流體介質(zhì)中并在所有方面符合無菌懸液要求的液體制劑；旨在用于懸液的藥劑通過凍干(“冷凍干燥”)來制備，所述凍干是涉及在極低壓力下，在冷凍狀態(tài)下從產(chǎn)品除去水的過程；注射溶液，其是含有溶解在適用于注射的適合的溶劑或互溶溶劑的混合物中的一種或多種藥物的液體制劑；注射溶液濃縮物，其是用于腸胃外使用的無菌制劑，在添加適合的溶劑后產(chǎn)生在所有方面符合注射要求的溶液。

注射懸液包含適用于注射的液體制劑，其由分散在粒子不溶于其中的整個液相中的固體粒子構(gòu)成，所述液相也可以由分散在整個水性相中的油相或分散在整個油相中的水性相構(gòu)成。脂質(zhì)體注射懸液包含適合于注射的液體制劑，其由分散在整個水性相中的油相構(gòu)成，以便形成脂質(zhì)體(通常由磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)雙層囊泡，其被用于將活性藥物物質(zhì)包封在脂質(zhì)雙層內(nèi)或水性空間中)。超聲注射懸液包含適合于注射的液體制劑，其由分散在粒子不溶于其中的整個液相中的固體粒子構(gòu)成。此外，當(dāng)將氣體鼓泡通過懸液時對產(chǎn)品進行超聲，這導(dǎo)致由固體粒子形成微球。

腸胃外載體系統(tǒng)包括一種或多種制藥上適合的賦形劑，例如溶劑和共溶劑、增溶劑、潤濕劑、懸浮劑、增稠劑、乳化劑、螯合劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、還原劑、抗微生物防腐劑、增量劑、防護劑、滲漲度調(diào)節(jié)劑和特殊添加劑。適合于腸胃外給藥的配方方便地包含活性成分的無菌油性或水性制劑，其優(yōu)選地與受體的血液等滲。

實施例

實施例1：

材料和方法

1.實驗動物：6-8周齡的雄性c57bl/6j小鼠，體重22～25克，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心喂養(yǎng)。

2.藥品與試劑

3.動物模型建立

本發(fā)明采用研究肺纖維化和ipf時常用的博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型^[31]。稱量小鼠體重并用1％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，將小鼠呈仰臥位固定于操作臺上，常規(guī)消毒，行頸正中切口，鈍性分離氣管旁肌肉，暴露氣管；用1ml注射器由氣管軟骨環(huán)間隙緩緩注入生理鹽水或博來霉素(3.5mg/kg^[32])(對照組注入生理鹽水，其余各組注入博來霉素)，立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn)3～5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)；縫合皮膚^[33]。

4.動物分組、給藥方法以及標(biāo)本處理

探索適宜劑量：各劑量組，分別為：對照組(ns)，模型組(blm)，1mg/kgc60干預(yù)組、10mg/kgc60干預(yù)組、100mg/kgc60干預(yù)組、500mg/kgc60干預(yù)組，每日腹腔注射一次，各組均于21天處死，記錄各組小鼠的死亡時間及體重變化。

治療組，分別為：對照組(ns)，模型組(blm)，10mg/kgc60干預(yù)組，每日腹腔注射一次，吡非尼酮(300mg/kg/d，bid)組。各組均于14天開始治療，28天處死，記錄各組小鼠的第28天的ct、病理以及膠原含量分析。

5.肺組織石蠟切片h&e染色

1)烘烤：石蠟切片放置于60℃恒溫箱中烘烤2h；

2)脫蠟和水化：切片放置在二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中各20min，無水乙醇ⅰ、無水乙醇ⅱ中各5min，95％乙醇1min，70％乙醇1min，50％乙醇1min，30％乙醇1min，自來水洗2遍后，放入去離子水中2分鐘；

3)染色：蘇木精染色5min，流水沖洗3遍，1％鹽酸酒精分化30sec，流水沖洗3遍，氨水返藍，上下3下，水洗3遍，1％伊紅染色30sec，流水沖洗3遍；

4)梯度脫水和透明：切片放置于95％乙醇ⅰ30sec，95％乙醇ⅱ2min，無水乙醇ⅰ、無水乙醇ⅱ中各5min，二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中各5min；

5)中性樹膠封片：封片時注意將片子擦拭干凈，同時防止氣泡產(chǎn)生；

6)采集圖片信息：aperio臺式玻片掃描儀采集圖片信息。

6.肺組織石蠟切片免疫組化染色

1)烘烤：石蠟切片置于金屬染色架上，放置于60℃恒溫箱中烘烤2h；

2)脫蠟和水化：切片放置在二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中各20min，無水乙醇ⅰ、無水乙醇ⅱ中各5min，95％乙醇1min，70％乙醇1min，50％乙醇1min，30％乙醇1min，自來水洗2遍后，浸入0.001mol/ledta(ph8.0)緩沖液中(注意石蠟切片上的肺組織需完全浸入edta溶液中)；

3)高壓熱修復(fù)抗原：在沸水中加熱edta緩沖液，蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定，210w加熱10min，鎖定鍋蓋，加壓，160w加熱8min，擰松閥門，待其減壓至正常，將edta緩沖液放在通風(fēng)陰涼處使其自然冷卻；

4)消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性：待edta緩沖液自然冷卻后，取出石蠟切片，水洗2遍后，盡量吸干組織周圍的水分，在組織上滴加3％過氧化氫，濕盒放置15min，自來水洗三次后，pbs液中平衡10min；

5)一抗孵育：按照抗體使用說明書推薦比例稀釋一抗后，將一抗滴加到玻片的組織上(需完全覆蓋組織)，4℃孵育過夜；

6)hrp標(biāo)記二抗孵育：一抗孵育結(jié)束后，pbs沖洗，2min×3次，使用hrp標(biāo)記二抗孵育1h，pbs沖洗，2min×3次；

7)dab顯色：室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5-20min之間，自來水終止顯色；

8)細胞核染色：終止顯色后自來水充分沖洗，蘇木精輕度復(fù)染；

9)脫水、透明、封片：如h&e染色所述；

10)采集圖片信息：aperio臺式玻片掃描儀采集圖片信息，aperiosoftware統(tǒng)計目的蛋白在肺組織不同部位的相對表達情況。

7.masson染色、ros測定均按試劑盒說明書操作。

8.統(tǒng)計分析

采用graphpadprism6軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差表示，比較組間的差異用t檢驗。以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

實施例2：劑量選擇

各組生存率以及體重變化的比較：造模后第21天，正常對照組小鼠全部存活，blm組以及低劑量干預(yù)組存活率均為30％，10mg/kgc60干預(yù)組存活66.7％(如圖1)。由各組小鼠的體重變化曲線(如圖2)可知，正常對照組小鼠體重明顯升高，blm組體重明顯下降，而10mg/kgc60干預(yù)組的體重變化明顯優(yōu)于blm組。這說明10mg/kg富勒烯c60可以提高肺纖維化小鼠的生存率，減緩小鼠體重下降趨勢。因此，后續(xù)實驗以10mg/kg富勒烯c60為所選劑量。

實施例3：小鼠肺部ct結(jié)果比較

造模第28天，各組小鼠肺部ct表現(xiàn)如圖3。模型組肺部ct顯示，縱隔窗有大量的實質(zhì)填充，而10mg/kgc60治療組以及吡非尼酮治療組較模型組明顯改善。

實施例4：he與masson染色比較

光鏡觀察所見，對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁未見增厚，肺泡上皮細胞結(jié)構(gòu)完整；blm組肺泡結(jié)構(gòu)破壞顯著，肺泡腔充斥纖維組織，甚至是完全纖維化；10mg/kgc60以及吡非尼酮干預(yù)組均以連續(xù)的肺泡間隔增厚為主，病理較blm組明顯減輕(如圖4)；對病理染色進行ashoft評分^[34](如圖5)，10mg/kgc60以及吡非尼酮干預(yù)組較blm組明顯降低(p<0.01)，但是10mg/kgc60和吡非尼酮干預(yù)組沒有明顯的差異。

實施例5：小鼠肺部膠原含量比較

對各治療組肺組織進行膠原的免疫組化染色(如圖6)，并對其進行統(tǒng)計(如圖7)，可見模型組膠原沉積明顯增多，而10mg/kgc60以及吡非尼酮干預(yù)組中膠原的含量明顯降低，且10mg/kgc60和吡非尼酮干預(yù)組沒有明顯的差異。

實施例6：小鼠肺部ros含量比較

如圖8所示，氣管內(nèi)注射博來霉素小鼠肺組織內(nèi)ros明顯升高，然而，用10mg/kgc60干預(yù)后則顯著降低(p<0.05)，提示富勒烯c60可以降低肺纖維化小鼠肺組織中的活性氧的含量。

應(yīng)理解，雖然已結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的特定實施方式對本發(fā)明進行了描述，但前面的描述和其后的實施例旨在說明而非限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，可作出各種改變并且可用等效物代替，并且此外應(yīng)理解，其它方面、優(yōu)點和修改將是本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所顯而易見的。除了本文所述的實施方式之外，本發(fā)明涵蓋并且要求保護由本文所引用發(fā)明的特征和所引用現(xiàn)有技術(shù)參考文獻的特征(其補充本發(fā)明的特征)的組合所產(chǎn)生的那些發(fā)明。類似地，應(yīng)理解，任何所述材料、特征或物品可與任何其它材料、特征或物品組合使用，并且這些組合被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

參考文獻

[1]raghug,collardhr,eganjj,etal.anofficialats/ers/jrs/alatstatement:idiopathicpulmonaryfibrosis:evidence-basedguidelinesfordiagnosisandmanagement[j].amjrespircritcaremed,2011,183(6):788-824.doi:10.1164/rccm.2009-040gl.

[2]visscherdw,myersjl.histologicspectrumofidiopathicinterstitialpneumonias[j].procamthoracsoc,2006,3(4):322-329.doi:10.1513/pats.200602-019tk.

[3]陳茹萱,胡立星,徐作軍.肺泡上皮細胞在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病中的作用[j].中華醫(yī)學(xué)雜志,2016,96(20):1625-1627.doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.20.019.

[4]takeday,tsujinok,kijimat,etal.efficacyandsafetyofpirfenidoneforidiopathicpulmonaryfibrosis[j].patientpreferadherence,2014,8:361-370.doi:10.2147/ppa.s37233.

[5]valeyred,alberac,bradfordwz,etal.comprehensiveassessmentofthelong-termsafetyofpirfenidoneinpatientswithidiopathicpulmonaryfibrosis[j].respirology,2014,19(5):740-747.doi:10.1111/resp.12297.

[6]mazzeime,richeldil,collardhr.nintedanibinthetreatmentofidiopathicpulmonaryfibrosis[j].theradvrespirdis,2015,9(3):121-129.doi:10.1177/1753465815579365.

[7]wadsworthrm.oxidativestressandtheendothelium[j].expphysiol,2008,93(1):155-157.doi:10.1113/expphysiol.2007.038687.

[8]papaharalambusca,griendlingkk.basicmechanismsofoxidativestressandreactiveoxygenspeciesincardiovascularinjury[j].trendscardiovascmed,2007,17(2):48-54.doi:10.1016/j.tcm.2006.11.005.

[9]cantinam,northsl,fellsga,etal.oxidant-mediatedepithelialcellinjuryinidiopathicpulmonaryfibrosis[j].jclininvest,1987,79(6):1665-1673.doi:10.1172/jci113005.

[10]gaof,koenitzerjr,tobolewskijm,etal.extracellularsuperoxidedismutaseinhibitsinflammationbypreventingoxidativefragmentationofhyaluronan[j].jbiolchem,2008,283(10):6058-6066.doi:10.1074/jbc.m709273200.

[11]daniilzd,papageorgioue,koutsokeraa,etal.serumlevelsofoxidativestressasamarkerofdiseaseseverityinidiopathicpulmonaryfibrosis[j].pulmpharmacolther,2008,21(1):26-31.doi:10.1016/j.pupt.2006.10.005.

[12]teixeirakc,soaresfs,rochalg,etal.attenuationofbleomycin-inducedlunginjuryandoxidativestressbyn-acetylcysteineplusdeferoxamine[j].pulmpharmacolther,2008,21(2):309-316.doi:10.1016/j.pupt.2007.07.006.

[13]liug,berir,muellera,etal.molecularmechanismsofasbestos-inducedlungepithelialcellapoptosis[j].chembiolinteract,2010,188(2):309-318.doi:10.1016/j.cbi.2010.03.047.

[14]fuyq,fangf,luzy,etal.n-acetylcysteineprotectsalveolarepithelialcellsfromhydrogenperoxide-inducedapoptosisthroughscavengingreactiveoxygenspeciesandsuppressingc-junn-terminalkinase[j].explungres,2010,36(6):352-361.doi:10.3109/01902141003678582.

[15]jorgensene,stinsona,shanl,etal.cigarettesmokeinducesendoplasmicreticulumstressandtheunfoldedproteinresponseinnormalandmalignanthumanlungcells[j].bmccancer,2008,8:229.doi:10.1186/1471-2407-8-229.

[16]reesmd,kennettec,whitelockjm,etal.oxidativedamagetoextracellularmatrixanditsroleinhumanpathologies[j].freeradicbiolmed,2008,44(12):1973-2001.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2008.03.016.

[17]chaudharyni,rothgj,hilbergf,etal.inhibitionofpdgf,vegfandfgfsignallingattenuatesfibrosis[j].eurrespirj,2007,29(5):976-985.doi:10.1183/09031936.00152106.

[18]simepj,o'reillykm.fibrosisofthelungandothertissues:newconceptsinpathogenesisandtreatment[j].clinimmunol,2001,99(3):308-319.doi:10.1006/clim.2001.5008.

[19]cuzzocreas,genoveset,faillam,etal.protectiveeffectoforallyadministeredcarnosineonbleomycin-inducedlunginjury[j].amjphysiollungcellmolphysiol,2007,292(5):l1095-1104.doi:10.1152/ajplung.00283.2006.

[20]kanghr,leecg,homerrj,etal.semaphorin7aplaysacriticalroleintgf-beta1-inducedpulmonaryfibrosis[j].jexpmed,2007,204(5):1083-1093.doi:10.1084/jem.20061273.

[21]faillam,genoveset,mazzone,etal.pharmacologicalinhibitionofleukotrienesinananimalmodelofbleomycin-inducedacutelunginjury[j].respirres,2006,7:137.doi:10.1186/1465-9921-7-137.

[22]h.w.kroto,j.r.heath,etal.c60:buckmisnterfulleren[j].nature,1985,318,162-163.doi:10.1038/318162a0

[23]krusicpj,wassermane,keizerpn,etal.radicalreactionsofc60[j].science,1991,254(5035):1183-1185.doi:10.1126/science.254.5035.1183.

[24]andrievskygv,bruskovvi,tykhomyrovaa,etal.peculiaritiesoftheantioxidantandradioprotectiveeffectsofhydratedc60fullerenenanostucturesinvitroandinvivo[j].freeradicbiolmed,2009,47(6):786-793.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2009.06.016.

[25]prylutskasv,burlakaap,klymenkopp,etal.usingwater-solublec60fullerenesinanticancertherapy[j].cancernanotechnol,2011,2(1-6):105-110.doi:10.1007/s12645-011-0020-x.

[26]shij,wangl,gaoj,etal.afullerene-basedmulti-functionalnanoplatformforcancertheranosticapplications[j].biomaterials,2014,35(22):5771-5784.doi:10.1016/j.biomaterials.2014.03.071.

[27]panchukrr,prylutskasv,chumaklvv,etal.applicationofc60fullerene-doxorubicincomplexfortumorcelltreatmentinvitroandinvivo[j].jbiomednanotechnol,2015,11(7):1139-1152.

[28]gharbin,pressacm,hadchouelm,etal.[60]fullereneisapowerfulantioxidantinvivowithnoacuteorsubacutetoxicity[j].nanolett,2005,5(12):2578-2585.doi:10.1021/nl051866b.

[29]johnstonhj,hutchisongr,christensenfm,etal.thebiologicalmechanismsandphysicochemicalcharacteristicsresponsiblefordrivingfullerenetoxicity[j].toxicolsci,2010,114(2):162-182.doi:10.1093/toxsci/kfp265.

[30]baatit,bourassetf,gharbin,etal.theprolongationofthelifespanofratsbyrepeatedoraladministrationof[60]fullerene[j].biomaterials,2012,33(19):4936-4946.doi:10.1016/j.biomaterials.2012.03.036.

[31]mouratisma,aidinisv.modelingpulmonaryfibrosiswithbleomycin[j].curropinpulmmed,2011,17(5):355-361.doi:10.1097/mcp.0b013e328349ac2b.

[32]lixx,jiangdy,huangxx,etal.toll-likereceptor4promotesfibrosisinbleomycin-inducedlunginjuryinmice[j].genetmolres,2015,14(4):17391-17398.doi:10.4238/2015.december.21.8.

[33]thrallrs,bartonrw,d'amatoda,etal.differentialcellularanalysisofbronchoalveolarlavagefluidobtainedatvariousstagesduringthedevelopmentofbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisintherat[j].amrevrespirdis,1982,126(3):488-492.doi:10.1164/arrd.1982.126.3.488.

[34]hübnerrh,gitterw,elmne,etal.standardizedquantificationofpulmonaryfibrosisinhistologicalsamples[j].biotechniques,2008,44(4):507-511,514-517.doi:10.2144/000112729.