本發(fā)明涉及一種殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑的制備方法，屬于黏土礦物功能材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自20世紀(jì)中葉發(fā)現(xiàn)抗生素對(duì)動(dòng)物的促生長(zhǎng)作用以來(lái)，抗生素飼料添加劑促進(jìn)了動(dòng)物生產(chǎn)性能的充分發(fā)揮，但隨著飼料工業(yè)與集約化養(yǎng)殖迅猛發(fā)展，動(dòng)物病害發(fā)生率越來(lái)越高，造成養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)對(duì)抗生素的極度依賴(lài)（nature2013;499:394-396）。長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)降低腸道微生物區(qū)系的多樣性，破壞優(yōu)勢(shì)菌群區(qū)系，引起動(dòng)物免疫機(jī)能下降，死亡率增多，并造成耐藥細(xì)菌增多，產(chǎn)生“超級(jí)病菌”（mbio,2016,7:e02039-15）。目前抗生素濫用已形成了“飼用抗生素使用—?jiǎng)游锬退幘a(chǎn)生—食物鏈轉(zhuǎn)移—人類(lèi)耐藥病原菌感染”的鏈條，對(duì)人類(lèi)健康存在潛在威脅（acsnano2014;8:10682-10686）。

多年來(lái)，世界各國(guó)均意識(shí)到抗生素養(yǎng)殖的危害，超級(jí)細(xì)菌以及“限抗”成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)，越來(lái)越多的國(guó)家已提倡“無(wú)抗養(yǎng)殖”（中國(guó)豬業(yè)，2012，7:21-22）。針對(duì)這一世界性難題，科學(xué)工作者開(kāi)始探索新的抗生素替代品，為無(wú)抗養(yǎng)殖、綠色養(yǎng)殖、健康養(yǎng)殖提供可行的途徑和可能的技術(shù)支撐。

在動(dòng)物安全養(yǎng)殖方面，目前國(guó)內(nèi)外研究較多的抗生素替代品主要有益生菌、有機(jī)酸、抗菌肽、寡糖和植物提取物等（飼料工業(yè),2014,35:1-5；actabiomaterialia,2011,7:1431-1440；internationaljournaloffoodmicrobiology,2010,139:102-107；actabiomaterialia,2015,12:62-69；trendsinfoodscience&technology,2013,34:96-108）。但上述產(chǎn)品尚無(wú)法完全替代抗生素，主要原因要么是產(chǎn)品成本較高（如抗菌肽），要么是提取工藝較為繁瑣（如植物提取物），要么是抑菌和殺菌作用不強(qiáng)（如有機(jī)酸）。近年來(lái)，采用復(fù)合微生態(tài)制劑的無(wú)抗飼料，亦有一定的使用效果，但并沒(méi)有大規(guī)模推廣應(yīng)用。

凹凸棒石是一種具有一維棒晶結(jié)構(gòu)的黏土礦物，具有大的比表面積，同時(shí)具有一定的孔道結(jié)構(gòu)，作為載體材料在功能復(fù)合材料、催化或藥物載體材料和功能涂料等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，但在抗菌方面的國(guó)內(nèi)應(yīng)用還沒(méi)有得到有效挖掘（凹凸棒石棒晶束解離及其納米功能復(fù)合材料.北京:科學(xué)出版社,2014）。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加凹凸棒石可吸附腸道病原菌和重金屬、霉菌毒素等有毒有害物質(zhì)（中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014,41:133-138）。由此可見(jiàn)，凹凸棒石的安全性和功效性具備制備抗菌功能材料的前提，但在飼料中直接添加凹凸棒石，其抗菌性能有限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑的制備方法，所得納米復(fù)合抗菌劑對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均表現(xiàn)出強(qiáng)的抗菌活性，同時(shí)對(duì)細(xì)菌或霉菌分泌的毒素具有較強(qiáng)的吸附能力，替代動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期使用的抗生素。

本發(fā)明的原理是：選用具有一維棒晶結(jié)構(gòu)的凹凸棒石為載體，制備zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料，再負(fù)載環(huán)境友好、無(wú)毒的殼寡糖季銨鹽，形成有機(jī)-無(wú)機(jī)納米復(fù)合抗菌劑。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：先將凹凸棒石配制成懸浮液，然后在攪拌條件下，依次加入表面活性劑、鋅鹽和氫氧化鈉溶液，超聲處理30min后，離心，烘干，再置于馬弗爐煅燒處理得到zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料，進(jìn)而復(fù)合季銨化殼寡糖，得殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑；其具體步驟如下：

（1）前驅(qū)體的制備：在攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10~30%的凹凸棒石懸浮液，向懸浮液中依次加入表面活性劑和鋅鹽溶液，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph=8，然后超聲處理30min，離心，烘干，得zn(oh)2/凹凸棒石；

（2）zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料的制備：將前驅(qū)體zn(oh)2/凹凸棒石過(guò)200目篩，置于馬弗爐中450℃煅燒處理2~4h，得zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料；

（3）殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑的制備：在攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料溶液，接著向溶液中加入季銨化改性殼寡糖，85℃反應(yīng)6h后，離心，烘干，粉碎，包裝，得殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑。

其中，所述的表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、司班、吐溫中的一種，加入量為凹凸棒石質(zhì)量比的0.5~2%。

其中，所述的鋅鹽為硫酸鋅、醋酸鋅、硝酸鋅中的一種，加入量為凹凸棒石質(zhì)量比的10~50%。

其中，所述的季銨化改性殼寡糖為n-羥丙基三甲基氯化銨殼寡糖、o-羥丙基三甲基氯化銨殼寡糖、羧甲基羥丙基三甲基氯化銨殼寡糖、n-三甲基殼寡糖季銨鹽、n-烷基化殼寡糖季銨鹽以及長(zhǎng)碳鏈殼寡糖季銨鹽中的一種，取代度在40~90%之間，加入量為凹凸棒石質(zhì)量比的1~10%。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、在凹凸棒石棒狀形貌表面擔(dān)載具有較強(qiáng)抗菌活性的zno和季銨化改性的殼寡糖，利用zno和季銨化改性殼寡糖分別對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌強(qiáng)的敏感性，進(jìn)而制備一種安全、高效、廣譜和生物相容性好的納米復(fù)合抗菌劑，主要應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑中，解決動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)抗生素的依賴(lài)性；2、本發(fā)明的工藝路徑經(jīng)濟(jì)可行，原材料屬天然黏土礦物，來(lái)源廣泛、廉價(jià)易得。

附圖說(shuō)明

圖1為中間體zn(oh)2/凹凸棒石的場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡照片。

圖2為zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料的場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡照片。

圖3為實(shí)施例3得到的殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑對(duì)大腸桿菌mic測(cè)試結(jié)果，其中：（a）空白組，（b）陽(yáng)性組，（c）2.5mg/ml，（d）1.5mg/ml，（e）1mg/ml，（f）0.5mg/ml。

圖4為實(shí)施例3得到的zno/殼寡糖/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌mic測(cè)試結(jié)果，其中：（a）空白組，（b）陽(yáng)性組，（c）10mg/ml，（d）5mg/ml，（e）2.5mg/ml，（f）1.5mg/ml。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1：在機(jī)械攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的凹凸棒石漿液，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石0.5%的司班-80、30%的硝酸鋅，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph=8，然后超聲處理30min，離心，烘干，過(guò)200目篩，置于馬弗爐中450℃煅燒處理4h，得zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料；在攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的zno/凹凸棒石溶液，接著向溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石10%取代度為75%羧甲基羥丙基三甲基氯化銨殼寡糖，85℃反應(yīng)6h后，離心，烘干，粉碎，包裝，得殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑。

實(shí)施例2：在機(jī)械攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的凹凸棒石漿液，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石1%的十六烷基三甲基溴化銨、20%的硝酸鋅，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph=8，然后超聲處理30min，離心，烘干，過(guò)200目篩，置于馬弗爐中450℃煅燒處理3h，得zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料；在攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的zno/凹凸棒石溶液，接著向溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石1%取代度為62%n-羥丙基三甲基氯化銨殼寡糖，85℃反應(yīng)6h后，離心，烘干，粉碎，包裝，得殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑。

實(shí)施例3：在機(jī)械攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的凹凸棒石漿液，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石2%的十二烷基硫酸鈉、10%的硝酸鋅，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph=8，然后超聲處理30min，離心，烘干，過(guò)200目篩，置于馬弗爐中在450℃煅燒處理2h，得zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料；在攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的zno/凹凸棒石溶液，接著向溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石5%取代度為45%n-三甲基殼寡糖季銨鹽，在85℃反應(yīng)6h后，離心，烘干，粉碎，包裝，得殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑。

實(shí)施例4：在機(jī)械攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的凹凸棒石漿液，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石1.5%的十二烷基硫酸鈉、25%的硝酸鋅，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph=8，然后超聲處理30min，離心，烘干，過(guò)200目篩，置于馬弗爐中在450℃煅燒處理4h，得zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料；在攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的zno/凹凸棒石溶液，接著向溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石3%取代度在90%羧甲基羥丙基三甲基氯化銨殼寡糖，在85℃反應(yīng)6h后，離心，烘干，粉碎，包裝，得殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑。

實(shí)施例5：在機(jī)械攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%的凹凸棒石漿液，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石1%的吐溫-40、15%的硝酸鋅，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph=8，然后超聲處理30min，離心，烘干，過(guò)200目篩，置于馬弗爐中在450℃煅燒處理3h，得zno/凹凸棒石納米復(fù)合材料；在攪拌下，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的zno/凹凸棒石溶液，接著向溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凹凸棒石2.5%取代度為52%十六烷基三甲基氯化銨殼寡糖在85℃反應(yīng)6h后，離心，烘干，粉碎，包裝，得殼寡糖/zno/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑。

zno/殼寡糖/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌劑的抗菌性能測(cè)試采用最小抑菌濃度法（mic），測(cè)試步驟如下：

（1）細(xì)菌菌液的制備：取-20℃保存的大腸桿菌k88或金黃色葡萄球菌解凍后接種到培養(yǎng)基中，在37℃160r/min振蕩培養(yǎng)12h后，按照1:100的菌液與新鮮培養(yǎng)基體積比，再次接種到相應(yīng)新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，備用；

（2）含抗菌材料培養(yǎng)基的配制：將適量的待測(cè)樣與對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基混合均勻后經(jīng)高壓滅菌；待培養(yǎng)基冷卻至50~60℃，加入滅菌平皿中，制備成相應(yīng)濃度的待測(cè)樣培養(yǎng)基，待冷卻后備用；每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)；

（3）接種菌液：用移液器取1μl菌液（含菌量約10⁸cfu/ml）點(diǎn)種于含抗菌材料的平皿中，每個(gè)皿分別在3個(gè)不同點(diǎn)點(diǎn)種；

陽(yáng)性對(duì)照組：以同樣方法在不含抗菌材料的瓊脂平皿中點(diǎn)種作為陽(yáng)性對(duì)照；

空白對(duì)照組：不含抗菌材料的瓊脂平皿不點(diǎn)種作為空白對(duì)照；

（4）平皿培養(yǎng)及結(jié)果觀(guān)察：將接種后的平皿放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24h；培養(yǎng)結(jié)束后，若菌落生長(zhǎng)，則在平皿中會(huì)形成直徑約為5-8mm（每個(gè)點(diǎn)菌量約為10⁵cfu）菌液圈；若菌落被抑制生長(zhǎng)，則無(wú)菌落圈出現(xiàn)；單一菌落生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。

測(cè)試結(jié)果表明：zno/殼寡糖/凹凸棒石納米復(fù)合抗菌材料對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）和革蘭氏陽(yáng)性（金黃色葡萄球菌）的最小抑菌濃度均分別達(dá)到1.5mg/ml和2.5mg/ml。