一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域。特別涉及穿心蓮內(nèi)酯增敏順鉑在制備治療耐藥性肺癌藥物中的應(yīng)用。

二、

背景技術(shù)：

近年來根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部報(bào)告的數(shù)據(jù)表明，肺癌已替代肝癌成為我國(guó)惡性腫瘤死亡原因第一位(約占全部惡性腫瘤致死的22.7％)。在全球，肺癌的發(fā)病率和死亡率也是居各種癌癥之首?；熓侵委煼伟┑闹饕侄沃?，盡管取得了一定的進(jìn)展，但在過去25年其5年生存率仍未見顯著提高，耐藥成為化療失敗的主要原因。順鉑(cis-dichlorodiamineplatinum，cddp)是臨床肺癌化療的一線藥物，病人在順鉑化療初期通?？梢垣@得良好的療效，但是耐藥性往往嚴(yán)重限制了順鉑的進(jìn)一步治療。國(guó)際癌癥組織推薦以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療作為肺癌的一線標(biāo)準(zhǔn)化療方案，現(xiàn)已取得了一定的療效。

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)，是天然植物穿心蓮(andrographispaniculata(burm.f)ness)的主要有效成份，具有祛熱解毒，消炎止痛之功效，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。關(guān)于穿心蓮內(nèi)酯與順鉑協(xié)同作用治療耐藥性肺癌的報(bào)導(dǎo)尚未出現(xiàn)。本發(fā)明研究了穿心蓮內(nèi)酯在增敏順鉑治療耐藥性肺癌中的作用。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是研究穿心蓮內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合用藥在治療順鉑耐藥性肺癌的效果，增加該化合物的適應(yīng)癥，為老藥新用提供依據(jù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

1.穿心蓮內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)

本發(fā)明所研究的穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)的結(jié)構(gòu)式如下：

2.穿心蓮內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合用藥的藥理試驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人源順鉑耐藥性nsclc細(xì)胞株a549/dpp來自中國(guó)科學(xué)上海細(xì)胞生物研究所，用dmem完全培養(yǎng)基(含10％fbs)培養(yǎng)于37℃、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

2、裸鼠肺癌異種移植模型建立及給藥

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的a549/dpp細(xì)胞用預(yù)冷的pbs洗滌和重懸。將重懸好的細(xì)胞稀釋成4×10⁷個(gè)/ml，以每只裸鼠100μl的體積進(jìn)行皮下注射。待腫瘤長(zhǎng)出后，每隔兩天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小。腫瘤體積計(jì)算公式：v＝0.5*l1*(l2)²，l1代表腫瘤長(zhǎng)度，l2代表腫瘤寬度。植瘤兩周后，把裸鼠(腫瘤平均大小約為50mm³)隨機(jī)分為4組，對(duì)照組(pbs)，順鉑組(0.75mg/kg)，穿心蓮內(nèi)酯組(水溶性穿心蓮內(nèi)酯磺化物5mg/kg)，順鉑組與穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)用組(順鉑0.75mg/kg和穿心蓮內(nèi)酯磺化物5mg/kg)，每組8-10只。腹腔注射給藥，每天一次，持續(xù)30天。

3、免疫印跡

取適量腫瘤組織(約10mg)，用300μlripa裂解液進(jìn)行勻漿。冰浴0.5h，4℃離心12000g，10min，取上清。用bca測(cè)定蛋白含量。制備10％的sds-page膠，以20μg蛋白量上樣電泳。恒壓條件下，積層膠內(nèi)電泳電壓為80v，分離膠電壓為100v。電泳結(jié)束后，用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)至pvdf膜(350ma，90min)。膜用5％脫脂奶粉封閉，室溫1h，膜與一抗共孵，室溫2h，pbst洗滌三次，與適當(dāng)稀釋的二抗共孵，室溫1h，膜同法洗滌三次，與底物共孵1min。膜與x-光膠片在暗盒曝光。

4、annexinv/pi染色

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)a549/dpp細(xì)胞凋亡率。分別單用順鉑(10μg/ml)，單用穿心蓮內(nèi)酯(30μm)或二者合用刺激a549/dpp細(xì)胞，48h后用預(yù)冷的pbs洗滌2次，以結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶個(gè)/ml，吸取100μl細(xì)胞懸液(1×10⁵個(gè)細(xì)胞)于流式細(xì)胞檢測(cè)管中，分別加入5μlfitc-annexinv和5μl碘化丙啶(propidiumiodide，pi)溶液，輕輕震蕩混勻，室溫避光孵育15min后，再加入400μl結(jié)合緩沖液，并立即流式檢測(cè)。每個(gè)樣品收集1×10⁴個(gè)細(xì)胞，使用facscan軟件(bectondickinson，usa)進(jìn)行分析。

5、統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以mean±sd表示。腫瘤體積兩組間的比較，用mann-whitneytest，其他數(shù)據(jù)兩組間比較用student’stwo-tailedt-test來檢驗(yàn)各組間的差異。***代表p＜0.001，**代表p＜0.01，*代表p＜0.05。

3.穿心蓮內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合用藥的藥理試驗(yàn)結(jié)果及分析

從圖1、2、3可以看出，單用順鉑(0.75mg/kg)或單用穿心蓮內(nèi)酯(5mg/kg)對(duì)順鉑耐藥性肺癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)無顯著抑制作用，但是二者聯(lián)用對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用明顯增強(qiáng)。在治療終點(diǎn)(給藥第30天)，聯(lián)合用藥組腫瘤大小與pbs對(duì)照組相比，腫瘤抑制率達(dá)到59.22％(腫瘤抑制率＝1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/對(duì)照組腫癌體積；p＜0.01，mann-whitneytest)。與單用順鉑組相比，腫瘤抑制率提高了41.71％(59.22％vs17.51％，p＜0.05，mann-whitneytest)。聯(lián)用組與單用穿心蓮內(nèi)酯組平均腫瘤重量分別為(0.134±0.056)vs(0.290±0.043)g(p＜0.05，students’ttest)，減少0.156g；聯(lián)用組與pbs對(duì)照組平均腫瘤重量分別為(0.134±0.056)vs(0.350±0.114)g(p＜0.01，students’ttest)，減少0.216g。

如圖4所示，與pbs對(duì)照組相比，聯(lián)用組腫瘤組織總蛋白中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白parp的剪切形式明顯增加，表明聯(lián)合用藥可能促進(jìn)順鉑耐藥性肺癌細(xì)胞的凋亡。

從圖5可以看出，順鉑(10μg/ml)與穿心蓮內(nèi)酯(30μm)聯(lián)用與順鉑單用相比，明顯提高了體外培養(yǎng)的耐藥性肺癌細(xì)胞的凋亡能力。這一結(jié)果佐證了圖4的在體結(jié)果。

四、附圖說明

圖1、小鼠移植瘤體積變化。

穿心蓮內(nèi)酯5mg/kg單用或順0.75mg/kg單用對(duì)順鉑耐藥肺癌細(xì)胞株a549/ddp體內(nèi)生長(zhǎng)沒有明顯影響，但聯(lián)合給藥時(shí)，能夠有效抑制小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合順鉑組與pbs對(duì)照組相比，腫瘤抑制率達(dá)到59.22％(p＜0.01，mann-whitneytest)(腫瘤抑制率＝1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/對(duì)照組腫瘤體積)。

圖2、給藥終止后剝除的小鼠移植腫瘤。

給藥30天，處死小鼠，剝離小鼠移植腫瘤，進(jìn)行拍照。

圖3、腫瘤重量。

稱量腫瘤重量，聯(lián)用組與單用穿心蓮內(nèi)酯組平均腫瘤重量分別為(0.134±0.056)vs(0.290±0.043)g(p＜0.05，students’ttest)，聯(lián)用組與pbs對(duì)照組平均腫瘤重量分別為(0.134±0.056)vs(0.350±0.114)g(p＜0.01，students’ttest)。

圖4、腫瘤組織蛋白印跡。

提取腫瘤組織總蛋白，蛋白印跡考察了凋亡相關(guān)指標(biāo)parp的剪切變化，可以看出，與pbs對(duì)照組相比，聯(lián)用組parp的剪切顯著增強(qiáng)。

圖5、順鉑耐藥肺癌細(xì)胞株凋亡檢測(cè)

annexinv-pi雙染流式技術(shù)檢測(cè)了順鉑耐藥肺癌細(xì)胞株的凋亡，可以看出，順鉑10μg/ml與穿心蓮內(nèi)酯30μm聯(lián)用與順鉑單用相比，明顯提高了細(xì)胞凋亡能力(p＜0.001，students’ttest)。

五、具體實(shí)施方式

本發(fā)明采用穿心蓮內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合用藥治療耐藥性肺癌。通過裸鼠異種移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用與單用順鉑或單用穿心蓮內(nèi)酯相比，腫瘤生長(zhǎng)抑制率顯著提高，平均腫瘤重量也明顯下降。聯(lián)用組腫瘤組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白parp的剪切增強(qiáng)，表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡。體外實(shí)驗(yàn)也表明穿心蓮內(nèi)酯與順鉑聯(lián)用可明顯增加耐藥性肺癌細(xì)胞株的凋亡。

以上結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合用藥能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡從而抑制順鉑耐藥性肺癌的發(fā)展，為制備治療耐藥性肺癌的藥物提供依據(jù)。