本發(fā)明涉及一種滴眼液，具體涉及一種治療角膜損傷的脂肪干細(xì)胞制劑滴眼液及其制備方法。
背景技術(shù)：
：眼睛的健康問題與視力的好壞緊密聯(lián)系的，如果眼睛出現(xiàn)損傷的話，視力會大大的受到影響。角膜損傷約占嚴(yán)重眼外傷中51％。角膜是重要的屈光介質(zhì)，角膜損傷后可能形成不同程度的瘢痕，或角膜曲率的改變，嚴(yán)重影響視力。因此，角膜外傷的及時修復(fù)能最大限度地減少瘢痕和散光形成，以保留和恢復(fù)視功能。角膜損傷的常見因素包括：燒傷、外傷與感染等因素，常見的癥狀有眼睛流淚、疼痛等。如果是被紫外線損傷的話，會出現(xiàn)角膜上皮的損害，出現(xiàn)眼瞼紅腫、結(jié)膜充血、眼鏡異物感很重，畏光、流淚等，還伴有視物模糊。現(xiàn)在臨床常用的修復(fù)類眼藥水有主要由重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子構(gòu)成的貝復(fù)舒滴眼液，和主要由重組人表皮生長因子構(gòu)成的易貝滴眼液等。它們都是基因工程表達(dá)的細(xì)胞因子藥物，已經(jīng)證實一定的臨床安全性及有效性，但對一些較嚴(yán)重的角膜損傷病例，組織修復(fù)情況還不盡人意，瘢痕形成明顯，視功能恢復(fù)不理想。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：現(xiàn)有技術(shù)中存在組織修復(fù)情況還不盡人意，瘢痕形成明顯，視功能恢復(fù)不理想的問題，目的在于提供了臨床修復(fù)效果更明顯的一種治療角膜損傷的脂肪干細(xì)胞制劑滴眼液及其制備方法。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種治療角膜損傷的脂肪干細(xì)胞制劑滴眼液，包括細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液為：由脂肪干細(xì)胞首先通過間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度達(dá)到90％以上后，再分離得到培養(yǎng)上清液，最后將培養(yǎng)上清液經(jīng)過濃縮后獲得的濃縮液。本發(fā)明通過培育脂肪細(xì)胞獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液，能達(dá)到更好地組織修復(fù)效果，并且，通過表1中實施例1-5的效果對比可知：本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)液能更好地促進(jìn)角膜組織的修復(fù)，修復(fù)效果極佳。進(jìn)一步，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中還添加有g(shù)mp標(biāo)準(zhǔn)的hregf、bfgf和hlif；hregf添加后的終濃度為0.1～0.2μg/ml，bfgf添加后的終濃度為0.02～0.06μg/ml，hlif添加后的終濃度為0.01～0.06μg/ml。通過上述hlif的作用，能有效達(dá)到抑制干細(xì)胞分化，保存干細(xì)胞干性的作用。并且，通過表1中實施例1～3的效果對比可知：本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)液與hregf、bfgf和hlif之間存在相互促進(jìn)的作用，效果極佳。即，通過上述條件的設(shè)置，能使本發(fā)明的修復(fù)效果達(dá)到最佳，效果更加顯著。更進(jìn)一步地，所述濃縮的倍數(shù)為2～8倍。所述濃縮的方式采用冷凍真空干燥方法。一種治療角膜損傷的脂肪干細(xì)胞制劑滴眼液的制備方法，包括：取脂肪細(xì)胞，進(jìn)行脂肪細(xì)胞的清洗，然后加入等體積的膠原酶進(jìn)行消化；進(jìn)行消化后細(xì)胞的清洗，離心去上清液，重懸后轉(zhuǎn)入間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培育，細(xì)胞傳代至3～6代時，進(jìn)行細(xì)胞鑒定，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90％以上后獲得培養(yǎng)上清液；將培養(yǎng)上清液濃縮后制成細(xì)胞培養(yǎng)液。所述間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中還添加有g(shù)mp標(biāo)準(zhǔn)的hregf、bfgf和hlif；hregf添加后的終濃度為0.1～0.2μg/ml，bfgf添加后的終濃度為0.02～0.06μg/ml，hlif添加后的終濃度為0.01～0.06μg/ml。通過上述各組成成分和配比的結(jié)合，能極大地提高修復(fù)效果，恢復(fù)效果極其顯著。進(jìn)一步，所述膠原酶采用i型膠原酶，消化時間為50～70分鐘，所述i型膠原酶的濃度為0.2％～0.3％。更進(jìn)一步，所述清洗采用生理鹽水進(jìn)行處理；消化后細(xì)胞清洗完成后再在2000rpm的條件下離心5min，去除上清液。所述重懸時采用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行處理，間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)入t75培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述上清液采用冷凍真空干燥方法進(jìn)行濃縮，濃縮的倍數(shù)為2～8倍；濃縮后經(jīng)過0.22μm的除菌濾器，過濾除菌制成成品。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：1、本發(fā)明通過培育脂肪細(xì)胞獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液合，能達(dá)到更好地角膜組織修復(fù)效果，并且本發(fā)明中的脂肪細(xì)胞通過包含有hregf、bfgf和hlif的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培育后，能夠使脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液與添加的生長因子之間存在相互促進(jìn)的效果，效果極佳。2、本發(fā)明不存在免疫排斥等問題，具有強大的細(xì)胞再生與修復(fù)的作用，效果十分顯著。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明實施例的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，并不構(gòu)成對本發(fā)明實施例的限定。在附圖中：圖1為實施例1的成品處理后角膜組織在100倍下的染色結(jié)果切片圖。圖2為實施例2的成品處理后角膜組織在100倍下的染色結(jié)果切片圖。圖3為實施例3的成品處理后角膜組織在100倍下的染色結(jié)果切片圖。圖4為實施例4的成品處理后角膜組織在100倍下的染色結(jié)果切片圖。圖5為實施例5的成品處理后角膜組織在100倍下的染色結(jié)果切片圖。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。實施例1一種治療角膜損傷的脂肪干細(xì)胞制劑滴眼液，包括細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液為：由脂肪干細(xì)胞首先通過間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度達(dá)到90％以上后，再分離得到培養(yǎng)上清液，最后將培養(yǎng)上清液經(jīng)過濃縮后獲得的濃縮液。上述細(xì)胞培養(yǎng)液的制備方法，具體如下：取脂肪20ml，用生理鹽水清洗兩次，然后加入等體積的濃度為0.25％的i型膠原酶進(jìn)行消化，消化過程中反復(fù)震蕩，消化60min后，再加入等體積的原代培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打混勻后，采用生理鹽水進(jìn)行細(xì)胞的清洗，2000rpm離心5min后去上清液，再次加入生理鹽水進(jìn)行細(xì)胞的清洗，2000rpm離心5min后去上清液，沉淀采用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸，重懸后轉(zhuǎn)入盛裝有間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的t75培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培育，細(xì)胞進(jìn)行傳代，4代時進(jìn)行細(xì)胞鑒定，當(dāng)鑒定出細(xì)胞密度達(dá)到90％以上后，獲取培養(yǎng)上清液；采用冷凍真空干燥方法對培養(yǎng)上清液進(jìn)行濃縮，濃縮6倍后制成細(xì)胞培養(yǎng)液。本實施例中該間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基采用cellgenix開發(fā)的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。實施例2本實施例與實施例1的區(qū)別在于，間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的組成成份不同，具體設(shè)置如下：一種治療角膜損傷的脂肪干細(xì)胞制劑滴眼液，包括細(xì)胞培養(yǎng)液，上述細(xì)胞培養(yǎng)液的制備方法為：取脂肪20ml，用生理鹽水清洗兩次，然后加入等體積的濃度為0.25％的i型膠原酶進(jìn)行消化，消化過程中反復(fù)震蕩，消化60min后，再加入等體積的原代培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打混勻后，采用生理鹽水進(jìn)行細(xì)胞的清洗，2000rpm離心5min后去上清液，再次加入生理鹽水進(jìn)行細(xì)胞的清洗，2000rpm離心5min后去上清液，沉淀采用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸，重懸后轉(zhuǎn)入盛裝有間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的t75培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培育，細(xì)胞進(jìn)行傳代，4代時進(jìn)行細(xì)胞鑒定，當(dāng)鑒定出細(xì)胞密度達(dá)到90％以上后，獲取培養(yǎng)上清液；采用冷凍真空干燥方法對培養(yǎng)上清液進(jìn)行濃縮，濃縮6倍后制成細(xì)胞培養(yǎng)液。本實施例中該間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包括cellgenix開發(fā)的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，并且在cellgenix開發(fā)的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中添加gmp標(biāo)準(zhǔn)的hregf、bfgf和hlif；hregf添加后的終濃度為0.15μg/ml，bfgf添加后的終濃度為0.04μg/ml，hlif添加后的終濃度為0.04μg/ml。實施例3本實施例為實施例2的對照實施例，本實施例中的滴眼液由終濃度為1.5μg/ml的hregf，終濃度為0.4μg/ml的bfgf，終濃度為0.4μg/ml的hlif組成。實施例4本實施例為本發(fā)明的對照實施例，本實施例中滴眼液為貝復(fù)舒滴眼液。實施例5本實施例與實施例2的區(qū)別在于，本實施例中間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中添加的hregf、bfgf和hlif的濃度不同，具體如下：其中，hregf按照0.4μg/ml的添加量添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，bfgf按照0.1μg/ml的添加量添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，hlif按照0.1μg/ml的添加量添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中。采用上述實施例1～實施例5的成品對家兔進(jìn)行試驗，試驗方式如下：一、建立家兔模型采用外科手術(shù)造損的方式，使創(chuàng)傷深達(dá)角膜基質(zhì)層，進(jìn)而建立家兔模型。二、治療方法治療時間為5天，每組重復(fù)三次。每天早晚滴眼治療兩次，每次30微升，治療過程觀察角膜感染與修復(fù)情況，以及家兔飲食行動等其它反應(yīng)。三、治療效果檢測治療時間結(jié)束后處死家兔，取角膜全層送病理切片，每一份標(biāo)本進(jìn)行雙染色處理，即h&e染和masson染色；同時提供生理鹽水組。檢測結(jié)果如下：1、生理鹽水組與貝復(fù)舒滴眼液治療組均有輕微膿性分泌物，實驗組別未見明顯感染，治療全程家兔飲食行動正常。2、根據(jù)h&e染和masson染色的結(jié)果整理出修復(fù)情況表，修復(fù)情況如表1所示，表1中的+代表修復(fù)程度，+越多，修復(fù)效果越好，-代表未有修復(fù)。表1表皮細(xì)胞彈力層基質(zhì)層生理鹽水++--實施例1++++++實施例2+++++++++++++實施例3+++++++實施例4++++-實施例5++++++++++3、提供實施例1～5的滴眼液處理后在100倍下的染色結(jié)果切片圖；通過該圖片可以看出：圖1中表皮連續(xù)完整，上皮細(xì)胞層數(shù)平均為3，細(xì)胞形態(tài)不分明，提示上皮過度增殖產(chǎn)生疤痕?；讓尤杂猩羁虅澓?。基質(zhì)層未見明顯增殖，且膠原排列不整齊。圖2的表皮已經(jīng)生長完全并且細(xì)胞層數(shù)平均為5層?；讓悠秸?。基質(zhì)層完整且彈力纖維排列完整。圖3中表皮連續(xù)完整，上皮細(xì)胞層數(shù)平均4層，且細(xì)胞形態(tài)清晰分明。基底膜不平整。前彈力層丟失，基質(zhì)層直接與表皮層相續(xù)，見少量炎細(xì)胞浸潤。圖4中表皮連續(xù)完整，細(xì)胞平均2層?；讓右娒黠@的深刻劃痕。前彈力層部分修復(fù)，膠原排列不完整。未見基質(zhì)層增生。有炎癥細(xì)胞浸潤。圖5中表皮連續(xù)完整，上皮細(xì)胞層數(shù)平均3層，且細(xì)胞形態(tài)清晰分明。基底層有少量深刻劃痕。基質(zhì)層完整，但彈力纖維過多，提示過度增殖。進(jìn)而可以確認(rèn)，通過本發(fā)明的成品可以有效使角膜劃傷愈合至正常，并且已有正常生理功能。通過上述圖片以及表1中的數(shù)據(jù)以及圖1～圖5的切片結(jié)果可知：實施例1～3的結(jié)果可以證明：本發(fā)明通過在間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中還添加gmp標(biāo)準(zhǔn)的hregf、bfgf和hlif，能夠使脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液與添加的生長因子之間存在相互促進(jìn)的效果；實施例2和實施例3與5的數(shù)據(jù)結(jié)果對比證明：只有在培養(yǎng)基中添加本發(fā)明濃度下的生長因子，才能有效達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)液與生長因子之間相互促進(jìn)的效果；通過實施例1和3-5與實施例2的試驗結(jié)果對比可知：本發(fā)明濃度下獲得的滴眼液的修復(fù)效果最佳，優(yōu)于濃縮無添加細(xì)胞因子對照組與貝復(fù)舒對照組。以上所述的具體實施方式，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12