本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肥胖是指由于能量過剩導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)的過度堆積所致的慢性疾病。肥胖可分為單純性肥胖和繼發(fā)性肥胖，通常意義上的肥胖指的是單純性肥胖，主要是由于能量攝入大于消耗，導(dǎo)致多余能量在體內(nèi)以脂肪形式過度聚集而成。繼發(fā)性肥胖是伴隨某些疾病發(fā)生的，如垂體性肥胖。目前采用體重指數(shù)(body mass index,BMI)作為判定肥胖的標(biāo)準(zhǔn)，BMI≥25為超重，≥30視為肥胖。近年來，由于飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，無論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，肥胖的發(fā)病率急劇上升。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，中國的超重人群已超過34％。隨著肥胖發(fā)生率的增加，肥胖引發(fā)Ⅱ型糖尿病、心血管疾病甚至癌癥等慢性疾病的發(fā)病率也逐年增加。因此，肥胖是當(dāng)今世界范圍內(nèi)一個(gè)重要的公共健康問題，針對(duì)肥胖的干預(yù)策略是防治肥胖相關(guān)疾病的重要措施。

機(jī)體內(nèi)脂肪組織可分為以貯存能量為主的白色脂肪組織(肥胖主要累及部位)和以產(chǎn)熱方式消耗能量為主的棕色脂肪組織；而白色脂肪組織中出現(xiàn)表達(dá)棕色脂肪特異性解偶聯(lián)蛋白(UCP1)的米色脂肪組織，即白色脂肪米色化，可促進(jìn)機(jī)體以產(chǎn)熱方式消耗能量，有效抵抗肥胖的發(fā)生發(fā)展。

脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)存在于脂肪組織血管基質(zhì)成分(SVF)中，具有自我更新和多向分化潛能。ADSC在體外可被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等不同的組織細(xì)胞，是目前組織修復(fù)和再生領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以攜帶具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)和RNA多種物質(zhì)等，并將有效成分及信息高效傳遞至受體細(xì)胞，在細(xì)胞間的信息交流中起重要作用。

目前對(duì)于脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的研究主要涉及在腎臟、眼底疾病中的用途(CN102048756A)、在治療勃起功能障礙的用途(CN105902568A)、在制備肝纖維化治療制劑的用途(CN103436555A)、在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎制劑的用途(CN105748519A)、在制備肝癌化療增敏制劑中的用途(CN103451152A)等，但迄今還未有關(guān)于脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體在治療肥胖方面的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的提供脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以在不影響小鼠攝食量的基礎(chǔ)上，通過誘導(dǎo)白色脂肪米色化抑制小鼠的體重增加，達(dá)到治療肥胖的作用，由此提出了下述的發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一方面，提供脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體由如下方法制備而成：

(1)將剝離的脂肪組織分散于消化液中，以產(chǎn)生細(xì)胞懸浮液；

(2)離心細(xì)胞懸浮液，以形成細(xì)胞沉淀，分離沉淀，洗滌，得到含有脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)的血管基質(zhì)成分(SVF)；

(3)在體外培養(yǎng)體系中對(duì)ADSC進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集擴(kuò)增培養(yǎng)后的上清液，濃縮，向濃縮后的上清液中加入外泌體提取試劑，即提取得到脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述消化液是由KRB緩沖液和Ⅰ型膠原酶組成；更優(yōu)選的，KRB緩沖液和Ⅰ型膠原酶的組成比例為1ml：2mg。

優(yōu)選的，步驟(2)中，離心轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心時(shí)間為5分鐘。

優(yōu)選的，步驟(3)中，擴(kuò)增培養(yǎng)的條件為：用不含外泌體的10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含有bFGF)培養(yǎng)ADSC。

優(yōu)選的，步驟(3)中，所述外泌體提取試劑為Exoquick-TCTM外泌體提取試劑。

本發(fā)明中，所述脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體具有TSG101、CD9、CD63和HSP90標(biāo)志。

優(yōu)選的，本發(fā)明中，所述脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體來源于小鼠附睪處脂肪組織。

本發(fā)明的第二方面，提供包含上述脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的組合物在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三方面，提供脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備促進(jìn)白色脂肪米色化的生物制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明首次提出了脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備治療肥胖藥物中的新用途。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，ADSC來源外泌體可以促進(jìn)白色脂肪米色化，以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)熱驅(qū)動(dòng)的能量消耗，從而抵抗肥胖的發(fā)生發(fā)展，本發(fā)明的ADSC來源外泌體可以在不影響能量攝入的基礎(chǔ)上抑制體重增加，達(dá)到治療肥胖的作用，從而可作為用于肥胖治療的新的生物制劑。此外，本發(fā)明還提供了上述脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，操作簡單可行。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對(duì)本申請的進(jìn)一步理解，本申請的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對(duì)本申請的不當(dāng)限定。

圖1：脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的透射電鏡圖；圖中，白色標(biāo)尺為150nm。

圖2：外泌體標(biāo)志western-blot的鑒定結(jié)果。

圖3：體重曲線的變化。

圖4：外泌體干預(yù)治療結(jié)束后體重的統(tǒng)計(jì)圖。

圖5：外泌體干預(yù)治療時(shí)攝食量的統(tǒng)計(jì)圖。

圖6：外泌體干預(yù)治療結(jié)束后各個(gè)部位脂肪的照片。

圖7：脂肪重量的統(tǒng)計(jì)圖。

圖8：白色脂肪米色化中UCP1的表達(dá)；圖中A：小鼠附睪處脂肪組織中UCP1的表達(dá)；圖中B：下肢皮下脂肪組織中UCP1的表達(dá)。

圖9：肝臟重量的統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

術(shù)語說明：

肥胖：由于能量過剩導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)的過度堆積所致的慢性疾病。

ADSC(adipose-derived mesenchymal stem cell)：脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞，存在于脂肪組織的血管基質(zhì)成分中，是脂肪組織中的脂肪細(xì)胞前體，具有自我更新和多向分化潛能。

外泌體(exosome)：是細(xì)胞分泌外排的一類囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約為30-120nm，內(nèi)含多種蛋白和RNA物質(zhì)，可通過旁分泌或者內(nèi)分泌方式作用于相應(yīng)的組織或細(xì)胞，是介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞的一個(gè)重要介質(zhì)。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中還未有關(guān)于脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體在治療肥胖的報(bào)道?；诖耍景l(fā)明提出了一種脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。

在本申請的一種實(shí)施方案中，通過建立飲食誘導(dǎo)高脂肥胖模型，進(jìn)行ADSC來源外泌體干預(yù)，分別檢測外泌體干預(yù)后小鼠的體重、攝食量、不同部位脂肪組織的重量變化、小鼠附睪處脂肪組織以及下肢皮下脂肪組織中UCP1的表達(dá)以及小鼠肝臟的重量。

綜上，通過上述研究發(fā)現(xiàn)：ADSC來源外泌體能減輕飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的體重，以及各個(gè)部位的脂肪重量，起到治療肥胖的作用。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本申請的技術(shù)方案。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

實(shí)施例1：ADSC的提取與分離

⑴脂肪組織的分離：選取10～12周齡C57BL/6雄性小鼠，脫頸處死小鼠后，打開腹腔，剝離其附睪處脂肪，盡量去除血管，稱取脂肪重量后，浸于PBS中冰上放置。

⑵配制消化液：根據(jù)脂肪重量，按照每克脂肪需3ml KRB緩沖液，6mgⅠ型膠原酶的比例配制使用。

⑶脂肪組織消化：將剝離好的脂肪組織機(jī)械剪碎后，加入配制好的消化液中，混勻后置于37℃搖床中消化45分鐘，2000rpm，離心5分鐘，小心取出底部的細(xì)胞置于不加酶的KRB中，冰上放置。

⑷過濾：用100μm孔徑銅網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，濾過后的混懸液2000rpm，離心5分鐘，棄上清。

⑸洗滌：沉淀物加入雙倍體積的無酶KRB緩沖液，混勻后2000rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀物即為含有ADSC的脂肪組織基質(zhì)細(xì)胞(SVF)。

⑹種板：按照一只小鼠所提細(xì)胞接種至六孔板中一個(gè)孔的原則進(jìn)行種板。加入含有bFGF的DMEM條件培養(yǎng)基重懸。每孔加入2ml培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，24-30小時(shí)后換液。

⑺傳代：細(xì)胞融合度達(dá)90％時(shí)可進(jìn)行傳代。用PBS清洗細(xì)胞表面，加入適當(dāng)胰酶消化細(xì)胞，按照每孔細(xì)胞傳至一個(gè)10cm平皿的原則進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第四代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2：ADSC來源的外泌體的提取與鑒定

用不含外泌體的10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含有bFGF)培養(yǎng)ADSC。取第四代ADSC細(xì)胞培養(yǎng)上清，0.22μm無菌過濾器過濾后，5000g，100K濃縮離心管4℃離心30分鐘，取上室濃縮液于新的無菌15ml離心管中，加入Exoquick-TCTM外泌體提取試劑，置于4℃過夜后，5000g,4℃離心30分鐘，棄上清，用無菌PBS重懸沉淀并分裝，凍于-80℃保存。

將提取到的外泌體用透射電鏡的方法對(duì)其直接大小以及形態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示；用western-blot的方法檢測外泌體標(biāo)志TSG101，CD9，CD63，HSP90，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例3：ADSC來源外泌體對(duì)飲食誘導(dǎo)高脂肥胖模型的影響

(1)建立飲食誘導(dǎo)高脂肥胖模型與外泌體干預(yù)

7周齡C57BL/6雄性小鼠用于建立肥胖模型。在一周的預(yù)高脂飲食適應(yīng)后，給予高脂飲食(HFD)(含有60％cal)喂養(yǎng)，以普通飲食(NCD)喂養(yǎng)作為對(duì)照組。高脂12-20周后，腹腔注射實(shí)施例2制備的外泌體(30μg/mouse，每3天注射一次，連續(xù)注射6-8周)，即為HFD-exosome組；腹腔注射生理鹽水組為對(duì)照組，即HFD-NS。普通飲食喂養(yǎng)小鼠腹腔注射生理鹽水組為NCD-NS。

(2)檢測小鼠的體重變化

高脂喂養(yǎng)以及外泌體干預(yù)期間，每周檢測小鼠體重并繪制成曲線進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可以看出，ADSC來源的外泌體干預(yù)治療一段時(shí)間后，HFD-exosome組小鼠的體重增加明顯減緩。

(3)檢測小鼠的攝食量

外泌體干預(yù)治療后，每天檢測干預(yù)組與生理鹽水對(duì)照組小鼠的攝食量，結(jié)果如圖5所示。由圖5結(jié)果可以看出，外泌體干預(yù)治療過程中并不影響小鼠的攝食量。

(4)檢測小鼠不同部位的脂肪組織重量變化

外泌體干預(yù)治療后，取小鼠不同部位的脂肪組織，拍照并稱重。結(jié)果如圖6和圖7所示，外泌體干預(yù)治療后小鼠附睪處脂肪組織(EpiWAT)，下肢皮下脂肪組織(IngWAT)，以及上肢皮下脂肪組織(AsWAT)重量均有不同程度減少，棕色脂肪組織(BAT)重量變化不大。

(5)檢測小鼠附睪處脂肪組織以及下肢皮下脂肪組織中UCP1的表達(dá)

外泌體干預(yù)治療后，檢測小鼠附睪處脂肪組織以及下肢皮下脂肪組織中UCP1的表達(dá)，由圖8可知，外泌體干預(yù)治療后，小鼠附睪處脂肪組織(圖8A)以及下肢皮下脂肪組織(圖8B)中UCP1的表達(dá)量有所升高。

結(jié)果表明：ADSC來源外泌體能夠促進(jìn)白色脂肪米色化，從而驅(qū)動(dòng)消耗脂肪。

(6)小鼠肝臟重量變化情況

外泌體干預(yù)治療后，取小鼠的肝臟并稱重。如圖9結(jié)果顯示，外泌體干預(yù)治療后小鼠的肝臟重量有所降低。

以上結(jié)果顯示，ADSC來源外泌體能抑制飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的體重增加，以及各個(gè)部位的脂肪重量，起到治療肥胖的作用。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。