本發(fā)明屬于生物技術與醫(yī)學領域，涉及一種抑制劑及抑制劑在醫(yī)學上的應用，尤其涉及一種通過STAT1通路調控miR-17-92及其下游靶基因進而抑制制角質形成細胞過度增殖和免疫異常的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑、抑制劑組合物及其在銀屑病防治方面的應用。

背景技術：

銀屑病是一種自身免疫性皮膚病，在自然人群中發(fā)病率約為2％。此病臨床表現(xiàn)為廣泛分布的皮膚紅斑、脫屑和劇烈的瘙癢，甚至還可出現(xiàn)膿皰、紅皮病以及關節(jié)損害等改變；其主要病理特征是表皮角質形成細胞增殖加速，絲狀分裂周期縮短，并由此出現(xiàn)角化過度、角化不全、表皮增生等病理表現(xiàn)。銀屑病的發(fā)病機制尚不清楚，因而缺乏有效的分子靶向治療藥物?，F(xiàn)有的治療手段中，無論是糖皮質激素、維生素D₃衍生物等經典藥物，還是抗IL-17、TNF-α單克隆抗體等新興靶向制劑，療效均有限，導致銀屑病的治療十分困難，且容易復發(fā)，極大地影響了患者的身心健康和生活質量，給患者的家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。因此，進一步闡明銀屑病發(fā)病的分子機制并開發(fā)針對性藥物具有重要的醫(yī)學價值和社會意義。

近年來，在銀屑病中角質形成細胞的功能異常引起了極大關注。研究證實，銀屑病皮損局部的T淋巴細胞分泌細胞因子，激活角質形成細胞內的炎癥相關分子信號通路，啟動其下游基因的表達，導致角質形成細胞過度增殖，并產生和分泌趨化因子、粘附分子等一系列免疫活性分子，進一步活化T淋巴細胞，促進皮損局部的炎癥反應，最終導致銀屑病的發(fā)生。本申請人前期對銀屑病角質形成細胞內分子調控機制進行研究，發(fā)現(xiàn)miR-17-92這一具有重要功能的microRNA(miRNA)基因簇在銀屑病患者皮損中表達水平升高，且與患者的疾病嚴重程度相關。隨后，對角質形成細胞轉染miR-17-92過表達質粒，發(fā)現(xiàn)miR-17-92能夠顯著抑制增殖相關靶基因CDKN2B和免疫相關靶基因SOCS1的表達，同時證實miR-17-92能夠促進角質形成細胞的增殖和炎癥因子的表達和分泌。上述發(fā)現(xiàn)說明銀屑病中高表達的miR-17-92與角質形成細胞的增殖和免疫功能異常直接相關，是銀屑病治療的潛在分子靶標。

通過生物信息學軟件Jaspar，對可能調控miR-17-92表達的轉錄因子進行預測，發(fā)現(xiàn)其基因啟動子區(qū)存在可能與銀屑病中活化的轉錄因子STAT1結合的位點，提示STAT1可能在銀屑病角質形成細胞中對miR-17-92發(fā)揮轉錄激活作用。既往文獻報道，雷公藤甲素可通過JAK/STAT通路抑制INF-γ信號傳導，下調角質形成細胞(HaCaT細胞)的IFN-γRα，pJak2，pSTAT1水平，抑制IFN-γ誘導的STAT1信號通路的活化。因此，推測雷公藤有效成分可能降低角質形成細胞中STAT1下游的miR-17-92的表達，從而抑制角質形成細胞的過度增殖和炎癥因子分泌。

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質藤本植物，是我國一種常用的傳統(tǒng)中藥，其味苦，有大毒，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結濕、殺蟲止血等功效。藥理及臨床研究證實，雷公藤具有顯著的抗炎及免疫抑制活性，被廣泛用于治療類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。在皮膚科主要用于治療銀屑病和皮肌炎等。然而雷公藤中的化學成分有450余種，結構類型復雜多樣，其治療銀屑病的有效成分的化學結構類型及作用靶點、機制尚未完全闡明。雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷公藤紅素為雷公藤中代表性的三種萜類化合物，具有多種藥理活性，但是應用單體成分來治療銀屑病在臨床尚未見報道，且分子機制尚不清楚。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決背景技術中存在的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種可提高療效并降低雷公藤的毒副作用的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑、抑制劑組合物及應用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑，其特征在于：所述可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑能夠抑制STAT1及p-STAT1的表達水平，進而下調miR-17-92mRNA表達水平，由此調控miR-17-92靶基因CDKN2B，抑制細胞中炎癥因子CXCL1、CXCL10、CXCL16以及IL-6的分泌水平，進而抑制細胞周期進展及免疫功能異常；所述可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑是雷公藤萜類化合物。

上述可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑是雷公藤倍的半萜生物堿、雷公藤的二萜類化合物和/或雷公藤的三萜類化合物。

上述可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑優(yōu)選是雷公藤的二萜類化合物和/或雷公藤的三萜類化合物。

上述可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑是雷公藤甲素、雷公藤內酯酮和/或雷公藤紅素。

上述雷公藤甲素、雷公藤內酯酮和/或雷公藤紅素中單體化合物的有效劑量水平不低于10^-7M,所述雷公藤甲素的有效劑量優(yōu)選60nM；所述雷公藤內酯酮的有效劑量優(yōu)選80nM；所述雷公藤紅素的有效劑量優(yōu)選100nM

一種基于如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑所形成的抑制劑組合物，其特征在于：所述抑制劑組合物含有如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑作為活性成分。

上述抑制劑組合物還包括能夠使如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑穩(wěn)定和/或能夠增強所述可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑效果的輔料。

上述輔料是藥學上可接受的載體和/或賦形劑。

根據(jù)如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑在制備用于預防、控制和/或治療銀屑病的藥物中的應用。

根據(jù)如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑在制備用于靶向預防、靶向控制和/或靶向治療銀屑病藥物中的應用。

本發(fā)明的優(yōu)點是：

本發(fā)明提供了一種可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑、抑制劑組合物及應用，該可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑能夠抑制STAT1及p-STAT1的表達水平，進而下調miR-17-92mRNA表達水平，由此調控miR-17-92靶基因CDKN2B，抑制細胞中炎癥因子CXCL1、CXCL10、CXCL16以及IL-6的分泌水平，進而抑制細胞周期進展及免疫功能異常；可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑是雷公藤萜類化合物，尤其是作為雷公藤的二萜類化合物和/或三萜類化合物代表的雷公藤甲素、雷公藤內酯酮以及雷公藤紅素，是從雷公藤3種化學結構類型(倍半萜生物堿、二萜、三萜共7個單體)中篩選出來的3個具有顯著抑制抑制銀屑病角質形成細胞增殖的單體化合物；確定了雷公藤中有效成分的結構類型，在保證同樣用量的情況下，可以提高療效并降低雷公藤的毒副作用。本發(fā)明首次闡明了雷公藤治療銀屑病的分子機制，即有效單體通過抑制STAT1的表達，進而抑制了miR-17-92的轉錄激活，從而減弱miR-17-92對下游靶基因CDKN2B的抑制作用，防止角質形成細胞的過度活化。本發(fā)明為銀屑病的防治提供了一條新途徑，有望為銀屑病的治療研究提供新的靶點和靶向治療藥物分子，在醫(yī)藥學領域的應用前景廣闊。

附圖說明

圖1為檢測銀屑病患者臨床樣本中miR-17-92表達水平的異常及與病情嚴重程度的相關性分析；

圖2為利用生物信息學分析技術預測miR-17-92上下游調控分子；

圖3為利用CCK-8方法檢測3種雷公藤單體化合物單獨處理HaCaT細胞后，對細胞增殖的影響；

圖4為利用WesternBlot法評價經7種雷公藤單體化合物分別單獨處理后HaCaT細胞胞內STAT1，p-STAT1，p15蛋白表達水平的影響；

圖5為利用qRT-PCR法評價經7種雷公藤單體化合物分別單獨處理后HaCaT細胞后對STAT1，miR-17-92mRNA表達水平的影響；

圖6為利用qRT-PCR法評價經7種雷公藤單體化合物分別單獨處理后HaCaT細胞后對CXCL9，CXCL10，CXCL16，IL-6mRNA表達水平的影響。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑，該可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑能夠抑制STAT1及p-STAT1的表達水平，進而下調miR-17-92mRNA表達水平，由此調控miR-17-92靶基因CDKN2B，抑制細胞中炎癥因子CXCL1、CXCL10、CXCL16以及IL-6的分泌水平，進而抑制細胞周期進展及免疫功能異常；可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑是雷公藤萜類化合物，該雷公藤萜類化合物是雷公藤倍的半萜生物堿、雷公藤的二萜類化合物和/或雷公藤的三萜類化合物，優(yōu)選雷公藤的二萜類化合物和/或雷公藤的三萜類化合物。其中，雷公藤的二萜類化合物和/或雷公藤的三萜類化合物是雷公藤甲素、雷公藤內酯酮和/或雷公藤紅素；雷公藤甲素、雷公藤內酯酮和/或雷公藤紅素中單體化合物的有效劑量水平不低于10^-7M,雷公藤甲素的有效劑量優(yōu)選60nM；雷公藤內酯酮的有效劑量優(yōu)選80nM；雷公藤紅素的有效劑量優(yōu)選100nM。

同時，本發(fā)明還提供了一種基于如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑所形成的抑制劑組合物，抑制劑組合物含有如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑作為活性成分，除了活性成分外，該抑制劑組合物還包括能夠使如前所述的可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑穩(wěn)定和/或能夠增強所述可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑效果的輔料，輔料是藥學上可接受的載體和/或賦形劑。

第三，本發(fā)明還提供了可抑制角質形成細胞的過度增殖的抑制劑在制備用于預防和/或治療銀屑病的藥物中的應用，尤其是在制備用于靶向預防和/或靶向治療銀屑病藥物中的應用。

本發(fā)明所采用的雷公藤甲素(Triptolide)、雷公藤內酯酮(Triptonide)和雷公藤紅素(Celastrol)治療銀屑病的分子機制是：雷公藤甲素(Triptolide)、雷公藤內酯酮(Triptonide)和雷公藤紅素(Celastrol)可顯著的引起角質形成細胞增殖抑制，使角質形成細胞阻滯在G2/M期，雷公藤甲素(Triptolide)、雷公藤內酯酮(Triptonide)和雷公藤紅素(Celastrol)3種單體可抑制銀屑病角質形成細胞內STAT1的轉錄因子活性，下調miR-17-92表達水平，回復其靶基因CDKN2B表達，從而抑制角質形成細胞的過度增殖和炎癥因子分泌，發(fā)揮治療銀屑病的作用。藥物含有一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。

下面結合實施例和附圖對本發(fā)明所提供的技術方案作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

需要說明的是：本發(fā)明實施例使用的臨床樣本資料來源于中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院皮膚病理中心，本發(fā)明所使用的雷公藤單體化合物來源于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心。

實施例1

檢測銀屑病患者臨床樣本中miR-17-92表達水平的異常及與病情嚴重程度的相關性分析，其結果如圖1所示。

分別取銀屑病患者皮損和正常對照皮膚各30例，剪去皮下組織，約100mg，液氮冷凍后研磨，然后加入1mL Trizol，按RNA提取試劑盒說明進行提取，提取的總RNA用紫外分光光度計測定OD值及濃度。miR-17-92在沒有被加工成成熟的miRNA時以mRNA的形式存在，采用檢測mRNA的方法檢測miR-17-92簇的表達，使用TAKARA公司的反轉錄試劑盒及SYBR熒光定量檢測試劑盒進行；同時使用Tiangen公司的反轉錄試劑盒及SYBR熒光定量檢測試劑盒檢測miR-17-92成熟體的表達。每個樣本做3個重復，反應在qRT-PCR儀上進行，使用β-actin(mRNA)和RUNU6(miRNA)作為內參，結果采用iQ 5-standard Edition Optical System ver2.1(Bio-Rad Inc)分析，得出各個樣本的miR-17-92簇、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92a的相對表達量。

前期提取了29例進展期尋常型銀屑病患者的皮損與24例性別和年齡匹配的正常皮膚組織RNA，反轉錄后行qRT-PCR檢測，結果顯示銀屑病患者皮損中miR-17-92表達水平顯著高于正常皮膚，參見圖1中的A；將患者皮損的miR-17-92表達水平與其PASI評分進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)miR-17-92的表達水平與銀屑病的嚴重程度呈正相關(r＝0.80，p<0.05)，參見圖1中的B，提示miR-17-92與銀屑病的發(fā)生發(fā)展有關；將8例銀屑病患者的皮損進行真表皮分離，分別提取表皮和真皮的RNA進行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損中表皮miR-17-92表達水平明顯高于真皮，參見圖1中的C，說明miR-17-92多分布于皮損的表皮層。同時，分別檢測了銀屑病患者皮損miR-17-92各成熟體的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b和miR-20a在銀屑病患者皮損中表達水平升高，而miR-92a的表達水平則與正常皮膚無明顯差異，提示miR-17-92在轉錄后可能存在對成熟體miRNA生成的特異性調控，參見圖1中的D。

實施例2

利用生物信息學分析技術預測miR-17-92上下游調控分子，其結果如圖2所示。

通過網站http：//genome.ucsc.edu/，獲得miR-17-92基因簇上游5000bp的啟動子序列，同時利用http：//jaspar.genereg.net/網站預測發(fā)現(xiàn)miR-17-92的啟動子區(qū)存在潛在的STAT1結合位點，參見圖2中的A，提示STAT1存在對miR-17-92的轉錄激活作用。利用生物信息學預測軟件Targetscan、miRbase、Pictar等進行預測分析，發(fā)現(xiàn)miR-17-92中多個miRNA成熟體存在與靶基因CDKN2B和SOCS1mRNA 3’UTR結合的位點。

結果參見圖2中的B，提示miR-17-92可能對他們具有轉錄后調控作用。

實施例3

利用CCK-8方法檢測7種雷公藤單體化合物單獨處理HaCaT細胞后，對細胞增殖的影響，其結果參見圖3。

測試樣品：雷公藤單體代表性化合物，主要結構類型為倍半萜生物堿類，二萜類化合物及三萜類化合物。(1)雷公藤定堿(LGT-1)，(2)雷公藤次堿(LGT-2)，(3)雷公藤晉堿(LGT-3)，(4)雷公藤甲素(LGT-4)，(5)雷公藤酯甲(LGT-5)，(6)雷公藤紅素(LGT-6)，(7)雷公藤內酯酮(LGT-7)，(8)雷公藤甲素+雷公藤紅素+雷公藤內酯酮，三種單體聯(lián)合使用(LGT-8)。樣品配制：DMSO為溶劑，配制化合物初始濃度為1.0×10^-2M；依次倍比稀釋到6個濃度梯度作為供試樣品：10^-3M、10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M；在圖3中，3種雷公藤單體化合物單獨處理HaCaT細胞后，對細胞增殖的影響。

細胞培養(yǎng)：5000個/孔的細胞密度為種于96孔板；37℃，5％CO₂條件下于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后吸去培養(yǎng)基，然后每孔加入各供試樣品2uL，每個濃度的供試樣品需5個復孔，再加入200uL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后吸去培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑(1：10稀釋于培養(yǎng)基中)100uL，37℃避光溫孵1h后，酶標儀測定OD₄₅₀吸光值。

基于紫外分光光計原理的酶標儀測定方法，CCK-8試劑在450nM波長下樣本吸光度值代表了細胞活力，吸光度值越高，細胞增殖越多。由圖3可以看出，雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內酯酮及三者聯(lián)合用藥后對細胞增殖有顯著的抑制作用。三種單體的有效劑量水平分別在在60nM，100nM和80nM。

實施例4

利用WesternBlot法評價經7種雷公藤單體化合物分別單獨處理后HaCaT細胞內STAT1和p15蛋白表達水平的影響，其結果參見圖4。

建立細胞因子刺激角質形成細胞的體外模型，加入雷公藤系列化合物作用24h后，細胞因子可顯著上調STAT1的表達水平，而雷公藤系列化合物中雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內酯酮處理組的細胞中STAT1顯著下調，并且周期抑制蛋白p15表達明顯增加，提示雷公藤中這三種成分可抑制角質形成細胞增殖，并且下調了miR-17-92的上游轉錄激活因子STAT1。

實施例5

利用qRT-PCR法評價經3種雷公藤單體化合物分別單獨處理后HaCaT細胞后對miR-17-92mRNA表達水平的影響，其結果參見圖5。

建立細胞因子刺激角質形成細胞的體外模型，加入雷公藤系列化合物作用24h后，收集細胞提取RNA，反轉錄為cDNA后，qRT-PCR實驗分析雷公藤系列化合物對角質形成細胞中miR-17-92mRNA表達水平的影響。在圖5中，雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內酯酮及其聯(lián)合應用后對角質形成細胞中miR-17-92mRNA表達水平均有顯著的下調作用。

實施例6

利用qRT-PCR法評價經3種雷公藤單體化合物分別單獨處理后HaCaT細胞后對CXCL1，CXCL9，CXCL10，CXCL16的mRNA表達水平的影響，結果請參見圖6。

建立細胞因子刺激角質形成細胞的體外模型，加入雷公藤系列化合物作用24h后，收集細胞提取RNA，反轉錄為cDNA后，qRT-PCR實驗分析雷公藤系列化合物對角質形成細胞中CXCL1，CXCL9，CXCL10，CXCL16，mRNA表達水平的影響。結果顯示：細胞因子刺激角質形成細胞后參與免疫應答的趨化因子CXCL1，CXCL9，CXCL10和CXCL16表達均顯著上調，而雷公藤系列化合物雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內酯酮及其聯(lián)合應用后均可顯著降低這些趨化因子的轉錄，提示其具有抑制免疫應答的作用，可用于改善銀屑病皮損微環(huán)境的炎癥反應。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。