本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑及其制作方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞在DNA損傷后，可通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)通路，實現(xiàn)細(xì)胞的自我修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞也具有上述修復(fù)能力，是導(dǎo)致一些細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物作用一段時間后，藥物敏感性降低的主要原因。因此，細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的抑制劑將有效提高化療藥物的敏感性。目前發(fā)現(xiàn)，具有明確的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的抑制功能的物質(zhì)主要是一些抗腫瘤藥物，如順鉑、鹽酸吉西他濱、絲裂霉素C、長春新堿、5-氟尿嘧啶、博來霉素、紫杉醇等。但是，這些藥物毒副作用大，如博來霉素引發(fā)的肺毒性，長春堿類所致的神經(jīng)毒性，順鉑導(dǎo)致的腎毒性及高頻率聽力障礙，博來霉素、紫杉類可能出現(xiàn)的過敏反應(yīng)等；此外，機(jī)體也會對這些藥物產(chǎn)生抵抗，減弱作用效果。因此，尋找有效措施以降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，同時增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性是十分必要的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提出以鐵皮石斛水提物作為細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的抑制劑，可與化療藥聯(lián)合使用，應(yīng)用于腫瘤治療的目的，提高化療藥物的敏感性，減少化療藥物的用藥劑量，降低毒副作用。本發(fā)明采用的技術(shù)手段如下：一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，按總質(zhì)量100％計，由以下質(zhì)量百分比組分支撐：鐵皮石斛水提物10-100％；所述的鐵皮石斛水提物中包括石斛多糖、石斛堿、石斛芪類、石斛氨基酸類中的一種或兩種以上的混合物。優(yōu)選的，所述修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑為鐵皮石斛水提物，所述的鐵皮石斛水提物中包括石斛多糖、石斛堿、石斛芪類、石斛氨基酸類中的一種或兩種以上的混合物。本發(fā)明還提供了：一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑的制備方法，所述的修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，包括下述步驟：(1)稱取石斛干品剪碎至1cm左右的小段放入煮鍋中，加入蒸餾水，一次加水量：石斛干品質(zhì)量＝1:1～10:1，將石斛干品浸泡1小時后，加熱煮沸，之后煎煮，煎煮時間為0.5-3小時，煮好后，把水煎液用紗布過濾至干凈的燒杯中；(2)再向煮鍋內(nèi)加入蒸餾水，加水量：石斛干品質(zhì)量＝1:1-10:1，加熱煮沸后，之后煎煮，煎煮時間為0.5h-3h，煮好后再用紗布過濾水煎液，所得濾液與步驟(1)制備的濾液合并后，離心收集上清液；(3)將步驟(2)獲得的上清液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后，用冷凍干燥機(jī)干燥鐵皮石斛水提物至粉末狀，直至恒重；(4)用PBS溶解鐵皮石斛水提物粉末，配制成濃度為50-100mg/ml的儲備液，置于-20℃保存。本發(fā)明還提供了：一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑的應(yīng)用，將權(quán)利要求1所述的修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑與細(xì)胞毒性物質(zhì)聯(lián)合使用，用于腫瘤治療。優(yōu)選的，所述細(xì)胞毒性物質(zhì)包括化療藥物。進(jìn)一步的，所述的修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑可單獨或與化療藥物混合用于腫瘤治療的制劑中；所述的化療藥物包括順鉑、紫杉醇、阿霉素、長春新堿、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等中的一種或兩種以上；修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑與化療藥物共同混合的方式可為物理共混或共價接枝方式中的一種或兩種。優(yōu)選的，所述的化療藥物為順鉑。進(jìn)一步的，所述的腫瘤包括消化道腫瘤、呼吸道腫瘤、子宮及其附件腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌等中的一種或兩種以上。優(yōu)選的，所述的腫瘤為肝癌。本發(fā)明的有益效果為：(1)一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，可與傳統(tǒng)化療藥聯(lián)合使用，應(yīng)用于腫瘤治療。(2)一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，可提高化療藥物的敏感性，減少化療藥物的用藥劑量，降低毒副作用。(3)一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，可降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，提高化療藥物的治療效果，降低腫瘤細(xì)胞的存活率。附圖說明下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1為鐵皮石斛水提物和順鉑對細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)蛋白表達(dá)的影響示意圖；圖1A為Westernblotting結(jié)果圖；圖1B1為Lig4蛋白的表達(dá)水平量化圖；圖1B2為RAD51蛋白的表達(dá)水平量化圖；圖1B3為PCNA蛋白的表達(dá)水平量化圖；圖2為MTT法檢測鐵皮石斛水提物和順鉑對肝癌細(xì)胞增殖的影響示意圖。具體實施方式實施例1一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，所述修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑為鐵皮石斛水提物，所述的鐵皮石斛水提物中包括石斛多糖、石斛堿、石斛芪類、石斛氨基酸類中的一種或兩種以上的混合物。上述修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑的制備方法為：1、稱取200g鐵皮石斛干品剪碎至1cm左右的小段放入煮鍋中，加入1L蒸餾水，將石斛干品浸泡1h；用電磁爐2100W煮沸，800W煎煮1h；煮好后，把水煎液用紗布過濾至干凈的燒杯中；2、再向煮鍋內(nèi)加入700ml蒸餾水，2100W煮沸后，800W煎煮1h；再用紗布過濾水煎液，將兩次濾液合并后，12000rpm離心20min，收集上清液；3、設(shè)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀90轉(zhuǎn)/分，溫度為30℃，濃縮鐵皮石斛水提物；用冷凍干燥機(jī)干燥鐵皮石斛水提物24h至粉末狀；用PBS溶解鐵皮石斛水提物粉末，配制成濃度為96.16mg/ml的儲備液，置于-20℃保存?zhèn)溆?。將鐵皮石斛水提物儲備液用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到2.4mg/ml，作為工作液；4、取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞，接種至6孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后加入2.4mg/ml鐵皮石斛水提物工作液2ml，處理48h后，胰酶消化2min，1000rpm離心5min收集細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液置于冰上裂解30min，每隔10min用移液器吹打一次；4℃，12000rpm，離心10min后收集上清獲取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。如圖1所示，上述修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑的應(yīng)用：分別加入用封閉液稀釋的一抗Lig4(1:500)，RAD51(1:500)，PCNA(1:4000)，Tubulin(1:1000)，4℃孵育過夜；次日，TBST溶液漂洗3次，每次10min；二抗結(jié)合：加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗(1:5000)，室溫孵育2h；顯影及數(shù)據(jù)分析：在PVDF膜上涂勻ECL發(fā)光試劑，設(shè)置顯影程序，用凝膠成像系統(tǒng)記錄目的條帶顯影照片，并應(yīng)用ImageLab軟件進(jìn)行灰度值分析，以Tubulin(表達(dá)量記為1)為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達(dá)量(RelativeExpression,RE)。結(jié)果顯示，RAD51蛋白的表達(dá)量為0.59，PCNA蛋白的表達(dá)量0.31，Lig4蛋白的表達(dá)量為1.56。圖1A為Westernblotting結(jié)果圖，圖1B為3種蛋白的表達(dá)水平量化圖。鐵皮石斛水提物(2.4mg/ml)和順鉑(1.5μM)處理48h后，圖1B2顯示RAD51蛋白的表達(dá)降低，圖1B3顯示PCNA蛋白的表達(dá)降低，圖1B1顯示Lig4蛋白的表達(dá)升高表明鐵皮石斛水提物聯(lián)合低劑量順鉑調(diào)控DNA損傷修復(fù)通路，增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較例11、用精密電子天平稱取4mg順鉑粉末至EP管中，加入50μl二甲基亞砜溶劑，配制成順鉑濃度為80mg/ml的儲存液，于-20℃冰箱中避光保存，使用前分別用RPMI-1640和MEM培養(yǎng)基稀釋到1.5μM。2、取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞，接種至6孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后加入步驟1)配置的順鉑稀釋液2ml，處理48h后，胰酶消化2min，1000rpm離心5min收集細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液置于冰上裂解30min，每隔10min用移液器吹打一次；4℃，12000rpm，離10min后收集上清獲取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。3、分別加入用封閉液稀釋的一抗Lig4(1:500)，RAD51(1:500)，PCNA(1:4000)，Tubulin(1:1000)，4℃孵育過夜；次日，TBST溶液漂洗3次，每次10min；二抗結(jié)合：加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗(1:5000)，室溫孵育2h；顯影及數(shù)據(jù)分析：在PVDF膜上涂勻ECL發(fā)光試劑，設(shè)置顯影程序，用凝膠成像系統(tǒng)記錄目的條帶顯影照片，并應(yīng)用ImageLab軟件進(jìn)行灰度值分析，以Tubulin(表達(dá)量記為1)為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達(dá)量(RelativeExpression,RE)。圖1顯示，RAD51蛋白的表達(dá)量為0.86，PCNA蛋白的表達(dá)量為0.79，Lig4蛋白的表達(dá)量為1.35。實施例21、稱取200g鐵皮石斛干品剪碎至1cm左右的小段放入煮鍋中，加入1L蒸餾水，將石斛干品浸泡1h；用電磁爐2100W煮沸，800W煎煮1h；煮好后，把水煎液用紗布過濾至干凈的燒杯中。2、再向煮鍋內(nèi)加入700ml蒸餾水，2100W煮沸后，800W煎煮1h；再用紗布過濾水煎液，將兩次濾液合并后，12000rpm離心20min，收集上清液。3、設(shè)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀90轉(zhuǎn)/分，溫度為30℃，濃縮鐵皮石斛水提物；用冷凍干燥機(jī)干燥鐵皮石斛水提物24h至粉末狀；用PBS溶解鐵皮石斛水提物粉末，配制成濃度為96.16mg/ml的儲備液，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?、用精密電子天平稱取4mg順鉑粉末至EP管中，加入50μl二甲基亞砜溶劑，配制成順鉑濃度為80mg/ml的儲存液，于-20℃冰箱中避光保存。5、胰酶消化處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，HepG2細(xì)胞3.5×104個/ml，SNU449細(xì)胞4.5×104個/ml，接種至96孔板中，每孔200μl，每個濃度梯度設(shè)置三個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔。6、次日，待細(xì)胞貼壁后分別加入三組物質(zhì)：①預(yù)先配制好的多個濃度梯度的鐵皮石斛水提物培養(yǎng)基200μl(分別含0,2.4,2.88,3.36,3.84,4.32mg/ml鐵皮石斛水提物)；②含不同濃度順鉑藥物(0,1.5,3,6,9,12μM)的培養(yǎng)基200μl；③含鐵皮石斛水提物2.4mg/ml，及不同濃度順鉑藥物(0,1.5,3,6,9,12μM)的培養(yǎng)基200μl。放置入37℃含5％二氧化碳濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。7、取出96孔板，向每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4h，小心吸除培養(yǎng)液，向每孔加入150μlDMSO溶液；將96孔板置于搖床上搖晃10min，然后置于酶標(biāo)儀上振蕩2min，充分溶解甲瓚，并在492nm下測定各孔的光吸收值，以不同濃度組別為橫坐標(biāo)，相對存活率為縱坐標(biāo)做柱形圖；相對存活率計算：相對存活率I(％)＝(藥物處理組-調(diào)零孔)/(對照組-調(diào)零孔)×100％；結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析，以p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著，p＜0.001表示差異非常顯著。8、如圖2A、圖2B及表1所示，鐵皮石斛水提物對HepG2和SNU449細(xì)胞的IC50分別是3.35±0.525mg/ml、3.543±0.549mg/ml；順鉑對HepG2和SNU449細(xì)胞的IC50分別是12.638±1.102μM、15.09±1.179μM；聯(lián)合鐵皮石斛水提物用藥后，順鉑對HepG2和SNU449細(xì)胞的IC50分別是4.655±0.668μM、5.729±0.436μM。表明鐵皮石斛水提物可顯著降低順鉑用量，達(dá)到同樣的抑制肝癌細(xì)胞增殖的效果。表1.兩種肝癌細(xì)胞各處理組的半數(shù)致死率(IC50)DCIC50CisplatinIC50聯(lián)合組CisplatinIC50HepG2細(xì)胞3.35±0.525mg/ml12.638±1.102μM4.655±0.668μMSNU449細(xì)胞3.543±0.549mg/ml15.09±1.179μM5.729±0.436μM如圖2A、圖2B及表1所示，鐵皮石斛水提物(2.4mg/ml)聯(lián)合順鉑(1.5μM)，作用于HepG2和SNU449肝癌細(xì)胞48h后，用MTT方法檢測細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示鐵皮石斛水提物聯(lián)合低劑量順鉑抑制肝癌細(xì)胞的增殖。我們把對照組細(xì)胞的存活率設(shè)為100％，加藥處理組細(xì)胞的存活率＝藥物處理組細(xì)胞的平均存活率/對照組細(xì)胞的存活率×100％。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實施例3一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑的制備方法，所述的修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，包括下述步驟：(1)稱取石斛干品剪碎至1cm左右的小段放入煮鍋中，加入蒸餾水，一次加水量：石斛干品質(zhì)量＝1:1，將石斛干品浸泡1小時后，加熱煮沸，之后煎煮，煎煮時間為0.5小時，煮好后，把水煎液用紗布過濾至干凈的燒杯中；(2)再向煮鍋內(nèi)加入蒸餾水，加水量：石斛干品質(zhì)量＝1:1，加熱煮沸后，之后煎煮，煎煮時間為0.5h，煮好后再用紗布過濾水煎液，所得濾液與步驟(1)制備的濾液合并后，離心收集上清液；(3)將步驟(2)獲得的上清液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后，用冷凍干燥機(jī)干燥鐵皮石斛水提物至粉末狀，直至恒重；(4)用PBS溶解鐵皮石斛水提物粉末，配制成濃度為50mg/ml的儲備液，置于-20℃保存。本實施例能夠快速制備修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，并且消耗低。實施例4一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑的制備方法，所述的修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，包括下述步驟：(1)稱取石斛干品剪碎至1cm左右的小段放入煮鍋中，加入蒸餾水，一次加水量：石斛干品質(zhì)量＝10:1，將石斛干品浸泡1小時后，加熱煮沸，之后煎煮，煎煮時間為3小時，煮好后，把水煎液用紗布過濾至干凈的燒杯中；(2)再向煮鍋內(nèi)加入蒸餾水，加水量：石斛干品質(zhì)量＝10:1，加熱煮沸后，之后煎煮，煎煮時間為3h，煮好后再用紗布過濾水煎液，所得濾液與步驟(1)制備的濾液合并后，離心收集上清液；(3)將步驟(2)獲得的上清液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后，用冷凍干燥機(jī)干燥鐵皮石斛水提物至粉末狀，直至恒重；(4)用PBS溶解鐵皮石斛水提物粉末，配制成濃度為100mg/ml的儲備液，置于-20℃保存。本實施例制備修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑能夠每次制備較多，適于大量制備的情況。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明涉及的一種修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的抑制劑，可與傳統(tǒng)化療藥聯(lián)合使用，應(yīng)用于腫瘤治療，提高化療藥物的敏感性，減少化療藥物的用藥劑量，降低毒副作用，降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，提高化療藥物的治療效果，降低腫瘤細(xì)胞的存活率。本發(fā)明可在腫瘤治療藥物領(lǐng)域廣泛推廣。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3