本發(fā)明涉及內含抑制素的納米粒子，尤其涉及用于增強細胞功能的內含抑制素納米粒子制劑。另外，本發(fā)明還涉及含有內含抑制素納米粒子的干細胞及其制備方法。

背景技術：

抑制素(statin)作為抑制肝臟中膽固醇生物合成的限速酶即hmg-coa還原酶的化合物為人所知。通過抑制素可使血液中的膽固醇值下降，因此被用于高膽固醇血癥的治療藥物。另外，臨床試驗還表明，除了高膽固醇血癥以外，抑制素因其抗炎作用而對心絞痛、心肌梗死之類的缺血性心臟病、以及動脈硬化等疾病也有效。

迄今為止，為了提高抑制素對上述疾病的治療效果、降低副作用進行了各種研究，例如專利文獻1中公開了通過將抑制素包覆在納米粒子內，并對患者局部給予該內含抑制素納米粒子，能夠用比以往更少量的抑制素促進血管生成。

另外，近年來還進行了使用具有多潛能性、可分化成心肌細胞的干細胞，治療缺血性心臟病的研究。非專利文獻1中公開了通過對心肌梗死模型小鼠的心肌直接給予脂肪組織源性干細胞，可實現(xiàn)心臟功能的改善和梗死尺寸的減小。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開2012-21002號公報

非專利文獻

非專利文獻1：masaakiiietal.，laboratoryinvestigation(2011)91，539-552

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

為了治療心肌梗死等缺血性心臟病，在給予例如上述專利文獻1所公開的內含抑制素的納米粒子的情況下，如上所述，通過對患者局部給予內含抑制素的納米粒子，利用比以往更少量的抑制素可實現(xiàn)有效性，但需要對患部進行局部給藥，給藥不便，還期待有效性的進一步提高。另外，在不采用局部給藥而采用靜胍給藥等的情況下，需要更多容量，還有可能產生副作用。

另一方面，非專利文獻1公開了在使用干細胞治療心肌梗死等缺血性心臟病的情況下，也需要干細胞對患部的局部給藥，例如在對小鼠的心肌進行給藥時，為了獲得治療效果，所需的細胞量為5×10⁵細胞/小鼠(cells/mouse)。作為干細胞，例如可使用間充質來源的成體干細胞(somaticstemcell)，此類干細胞可從骨髓或脂肪組織中獲得，但一次所得干細胞量有限，因此將干細胞用于上述治療等時，最好使用較少的細胞數(shù)。由此，為了利用更少數(shù)量的干細胞來獲得優(yōu)異的治療效果，需要使該干細胞的各種功能提高。

本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于可提高該干細胞的功能，以提高用作細胞制劑的干細胞對疾病的治療效果、抑制副作用。

用于解決問題的方案

為了達成上述目的，本發(fā)明人進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)通過使干細胞中含有將抑制素包覆在納米粒子內而成的內含抑制素納米粒子，可增強該干細胞的功能，將抑制素高效地傳遞至所需患部，在缺血性心臟病等各種疾病的治療中顯示出良好的效果，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子制劑特征在于，包含將抑制素包覆在含有生物吸收性聚合物(bioabsorbablepolymer)的納米粒子內而成的內含抑制素納米粒子，該納米粒子的個數(shù)平均粒徑小于1000nm，用于增強干細胞的功能。

本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子制劑通過對干細胞進行處理，可增強該處理后的干細胞的功能，通過對生物體內給予該干細胞，顯示出各種有效性。具體而言，若用本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子制劑對干細胞進行處理，則處理后的干細胞通過吞噬作用而攝取內含抑制素納米粒子，攝取了內含抑制素納米粒子的干細胞，其遷移能力(migratorycapacity)、增殖能力和血管生成因子產生能力增強。因此，通過對患有例如缺血性心臟病的患者體內給予經本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子處理的可分化成心血管系統(tǒng)細胞的干細胞，干細胞集聚于缺血部位而增殖并釋放出血管生成因子，從而促進缺血部位的血管生成。進而，該集聚并增殖的干細胞分化成心肌從而促進心肌的再生。另外，通過本發(fā)明涉及的攝取了內含抑制素納米粒子的干細胞的給藥，促使存在于心外膜附近的細胞在心肌梗死部位分裂增殖，從而促進心肌的再生。其結果，顯示出優(yōu)異的缺血性心臟病的治療效果。另外，該干細胞可以緩慢釋放出被其攝取的抑制素，由此，還可獲得抑制素本身的血管生成效果等抑制素所特有的各種效果，因此對以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療有益。進而，通過從集聚于患部的干細胞釋放出的抑制素，可使體內的干細胞、骨髓源性血管內皮祖細胞(epc)的集聚亢進，其結果，在例如缺血性心臟病的情況下，可進一步促進缺血部分的心肌再生。另外，抑制素等化合物在單純靜胍給藥時，會隨著血流而被運送至患部，但在心肌梗死等缺血性心臟病中，血流受阻，難以正常到達患部，而本發(fā)明所述的抑制素被遷移性增強的干細胞攝取并運送，因此即便血流受阻也能到達患部。即，可形成良好的藥物傳遞系統(tǒng)，從而能夠減少應給藥的細胞數(shù)。通過上述作用，可對心肌梗死等缺血性心臟病的治療發(fā)揮極好的效果。應予說明，為了使干細胞通過上述吞噬作用高效地攝取內含抑制素納米粒子，上述納米粒子的個數(shù)平均粒徑小于1000nm。

本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子制劑中，作為生物吸收性聚合物，可以使用聚乳酸聚合物(polylacticacid：pla)或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)：plga)。

通過pla和plga在體內水解，可將所包覆的抑制素釋放，另外，pla通過水解而分解成乳酸，plga通過水解而分解成乳酸和乙二醇，最終分別成為水和二氧化碳，對人和動物無害，因此特別優(yōu)選將pla或plga用作納米粒子材料。

本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子制劑優(yōu)選為用于增強作為上述干細胞的脂肪源性干細胞的制劑。

脂肪源性干細胞可如下獲得：采集脂肪組織，對所采集的組織進行膠原酶處理后，利用離心比重法(centrifugalspecificgravitymethod)僅采集單核細胞，將所采集的單核細胞用培養(yǎng)板培養(yǎng)4日左右，選取并分離出粘附的細胞作為脂肪源性干細胞。另外，還可以使用celution系統(tǒng)(cytoritherapeutics，inc.制)等簡便而大量地從脂肪組織中提取、分離培養(yǎng)脂肪源性干細胞。脂肪源性干細胞屬于間充質干細胞，具有優(yōu)異的多潛能性，另外，如上所述，由于脂肪源性干細胞能夠簡便而大量地采集，因此有利于用于各種疾病的治療。

另外，本發(fā)明涉及的功能增強干細胞特征在于，含有將上述抑制素包覆在生物相容性納米粒子內而成的內含抑制素納米粒子。

這種本發(fā)明涉及的功能增強干細胞含有上述內含抑制素納米粒子，因此如上所述，可通過該內含抑制素納米粒子來增強細胞功能，對以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療發(fā)揮優(yōu)異效果。另外，本發(fā)明涉及的功能增強細胞能夠緩慢釋放出抑制素，該釋放出的抑制素可使骨髓干細胞、骨髓源性血管內皮祖細胞(epc)的集聚亢進，因此有利于缺血性心臟病等的治療。

由于上述理由，本發(fā)明涉及的功能增強干細胞優(yōu)選為上述脂肪源性干細胞，還優(yōu)選為了治療心肌梗死等缺血性心臟病而給予患者的干細胞。

另外，本發(fā)明涉及的功能增強干細胞還可以與藥學上可接受的溶劑和賦形劑混合制成細胞制劑。本發(fā)明涉及的干細胞對生物體內的給藥優(yōu)選無需開胸等手術的給藥，還優(yōu)選制成靜胍給藥用細胞制劑。由此，本發(fā)明涉及的干細胞可以簡便地對患者給藥。另外，如上所述，本發(fā)明涉及的功能增強干細胞起到優(yōu)異的藥物傳遞系統(tǒng)的作用，可將干細胞集聚在所需患部并緩慢釋放抑制素，因此無需局部給藥，即使采用靜胍給藥也能夠以較少容量獲得良好的效果。

本發(fā)明涉及的功能增強干細胞的制備方法特征在于，包括用上述內含抑制素納米粒子對干細胞進行處理的步驟。特別是，在上述用內含抑制素納米粒子對干細胞進行處理的步驟中，優(yōu)選向培養(yǎng)有干細胞的培養(yǎng)基中添加內含抑制素納米粒子使其濃度達到20μg/ml～100μg/ml，處理時間為30分鐘～2小時。

由此，通過向培養(yǎng)有干細胞的培養(yǎng)基中添加內含抑制素納米粒子這一簡便的步驟，能夠得到上述功能增強干細胞。另外，通過以上述濃度和時間進行處理，可將內含抑制素納米粒子高效地攝入干細胞內。

由于上述理由，在本發(fā)明涉及的功能增強干細胞的制備方法中，優(yōu)選使用脂肪源性干細胞作為干細胞，另外還優(yōu)選使用用于治療缺血性心臟病的干細胞。

發(fā)明的效果

根據本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子、以及含有該內含抑制素納米粒子的功能增強干細胞及其制備方法，能夠增強干細胞的功能，通過對生物體內給予該干細胞，對以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療有效。

附圖說明

圖1是示出向脂肪源性干細胞的培養(yǎng)基中添加終濃度達到20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml或100μg/ml的內含羅丹明紅熒光染料(rhodamineredfluorescentdye)的pla納米粒子，1小時后或2小時后用激光共聚焦熒光顯微鏡(confocallaserfluorescencemicroscope)觀察干細胞所得結果的照片。

圖2是示出以100μg/ml的濃度用內含辛伐他汀的pla納米粒子對脂肪源性干細胞進行1小時處理后，對從脂肪源性干細胞釋放到培養(yǎng)基中的辛伐他汀量進行測定所得結果的圖表。

圖3(a)是示出經pla納米粒子或內含抑制素的pla納米粒子處理后的脂肪源性干細胞的遷移性測定結果的圖表，(b)是示出經內含抑制素的pla納米粒子處理后的脂肪源性干細胞的增殖性測定結果的圖表。

圖4是示出使用定量pcr法對經內含抑制素納米粒子處理后的脂肪源性干細胞中的血管生成因子的mrna表達進行測定所得結果的圖表，示出作為血管生成因子的(a)vegf-a、(b)vegf-c、(c)fgf-2的rna表達的測定結果。

圖5是示出給予pbs、內含抑制素納米粒子、脂肪源性干細胞、或者攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠心臟的超聲診斷結果的圖表，(a)表示左室射血分數(shù)(ef)，(b)表示左室縮短分數(shù)(fs)，(c)表示左室舒張末期內徑(lvdd)，(d)表示左室收縮末期內徑(lvds)。

圖6是示出給予pbs、或者攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞28日后，心肌梗死模型小鼠心臟的照片。

圖7(a)是示出給予pbs、內含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細胞、或者攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經馬松三色染色(massontrichromestain)所得結果的照片，(b)是示出各切片中纖維化部分的長度的圖表，(c)是示出各切片中纖維化部分的心肌壁厚的圖表。

圖8示出給予pbs、內含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細胞、或者攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經馬松三色染色所得的結果，是將纖維化部分放大的照片。

圖9(a)是示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞60日后，心肌梗死模型小鼠心臟的照片，(b)～(e)是示出沿(a)所示的(b)～(e)各線切出的切片經馬松三色染色所得結果的照片。

圖10是示出給予pbs、內含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細胞、或者攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經同工凝集素b4或抗smα肌動蛋白抗體(anti-smαactinantibody)進行免疫染色所得結果的照片。

圖11示出給予pbs、內含抑制素納米粒子、攝取了不含抑制素的納米粒子的脂肪源性干細胞、或者攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經同工凝集素b4染色，測量血管密度所得的結果，(a)示出將切片染色后的顯微鏡照片，(b)是示出測出的血管密度的圖表。

圖12是示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經同工凝集素b4和抗ki67抗體進行免疫染色所得結果的照片。

圖13是示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經抗smα-肌動蛋白抗體和抗ki67抗體進行免疫染色所得結果的照片。

圖14是示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞14日后，上述心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經抗wt1抗體和上述抗ki67抗體進行免疫染色所得結果的照片。

圖15是示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經抗gata4抗體和抗αmhc抗體進行免疫染色所得結果的照片。

圖16是示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經抗nkx2.5抗體和抗αmhc抗體進行免疫染色所得結果的照片。

圖17是示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經抗ctn-1抗體或抗smα肌動蛋白抗體、以及抗人線粒體抗體(anti-humanmitochondriaantibody)進行免疫染色所得結果的照片。

圖18是示出對從tie2/lacz轉基因小鼠接受骨髓移植的心肌梗死小鼠給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞之后，該心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片經抗ctn-1抗體、抗smα肌動蛋白抗體或同工凝集素b4、以及抗β-gal(β-半乳糖苷酶)抗體進行免疫染色所得結果的照片。

具體實施方式

以下，根據附圖對本發(fā)明的實施方式進行說明。以下的優(yōu)選實施方式的說明本質上僅是示例，并不意圖限制本發(fā)明、本發(fā)明的適用方法、或者本發(fā)明的用途。

本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子制劑中所用的內含抑制素納米粒子，是將抑制素包覆在含有聚乳酸-羥基乙酸共聚物的納米粒子內而成的內含抑制素納米粒子，用于增強干細胞的功能。本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子制劑除了上述內含抑制素納米粒子以外，還可包含穩(wěn)定劑、保存劑、緩沖劑、ph調整劑、賦形劑等常用于制劑的添加劑。

本發(fā)明中，抑制素包括所有3-羥基-3-甲戊二酸單酰輔酶a(hmg-coa)還原酶抑制劑類化合物，例如可列舉出：辛伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、以及美伐他汀等。如上所述，已知抑制素具有降低膽固醇的作用，而除此之外通過大規(guī)模臨床試驗明確了抑制素可使心血管事件的發(fā)生及發(fā)展風險降低。另外，對于來源于血管內皮細胞或骨髓的血管內皮祖細胞介導的血管生成促進作用也多有報道。

本發(fā)明中，納米粒子只要是可包覆抑制素的生物吸收性聚合物則其材料沒有限定，優(yōu)選使用含有聚乳酸聚合物(polylacticacid：pla)或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)：plga)的納米粒子。pla在體內水解而分解成乳酸，plga在體內水解而分解成乳酸和乙二醇，最終分別成為水和二氧化碳，因此對體內無害而優(yōu)選。

本發(fā)明中，從干細胞的攝取效率的觀點出發(fā)，內含抑制素納米粒子的制備方法只要是能夠將其加工成用光散射法測定時粒徑小于1000nm、優(yōu)選為約100nm～400nm、更優(yōu)選為200nm～400nm的納米粒子的方法，則可以采用任意方法進行制備，優(yōu)選采用球晶制粒技術(sphericalcrystallizationtechnique)制備。球晶制粒技術作為可以通過對化合物合成的最終工序中結晶的生成、生長過程進行控制來設計球狀晶粒，從而直接控制其物性進行加工的方法而廣為人知。公知的乳化溶劑擴散法(esd法)為該球晶制粒技術中的一種。

乳化溶劑擴散法使用可將用于包覆抑制素的上述pla或plga等生物吸收性聚合物溶解的良溶劑、以及不能溶解該聚合物的不良溶劑這兩種有機溶劑來進行。首先，將pla或plga等聚合物溶解于良溶劑中，向良溶劑中添加抑制素溶液而不讓該聚合物析出，進行混合。若將所得混合液滴入攪拌下的不良溶劑中，則良溶劑與不良溶劑急速地相互擴散，因此有機溶劑相與水相的界面紊亂，良溶劑自乳化，形成亞微米尺寸的乳液滴。然后，良溶劑和不良溶劑的相互擴散進一步發(fā)展，乳液滴內的pla或plga等聚合物以及抑制素的溶解度下降，其結果，生成內含抑制素的球形晶粒聚合物納米粒子。

本發(fā)明中，干細胞是具有全能性、多潛能性(multipotency)或多能性(pluripotency)的細胞，例如可列舉出胚胎干細胞(es細胞)、誘導多能干細胞(ips細胞)和間充質干細胞等成體干細胞。本發(fā)明中，從更簡便且大量地獲得很多干細胞的觀點出發(fā)，優(yōu)選使用從骨髓組織、脂肪組織等得到的間充質干細胞。其中，特別優(yōu)選使用脂肪源性干細胞。已知脂肪源性干細胞已在臨床進行細胞單獨給藥，分化成脂肪、骨、肝臟、心臟等。脂肪源性干細胞可從脂肪組織中獲得，該脂肪組織可使用吸脂等微創(chuàng)技術從皮下脂肪等而容易地獲得。脂肪源性干細胞可以通過使用celution系統(tǒng)(cytoritherapeutics，inc.制、)等從上述所得的脂肪組織中提取和分離而大量采集。因此，用作本發(fā)明涉及的干細胞極為有利。

本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子對干細胞的處理可通過例如添加到培養(yǎng)有該干細胞的培養(yǎng)基中而進行。由此，干細胞通過吞噬作用而將內含抑制素納米粒子攝入細胞內，因此無需使用特別的試劑等即可簡便地使干細胞中含有內含抑制素納米粒子。

經本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子處理后的干細胞，遷移能力、增殖能力和血管生成因子產生能力特別增強，從而對心肌梗死等缺血性心臟病的治療效果特別增強。具體而言，如果對缺血性心臟病患者靜脈給予經本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子處理后的上述脂肪源性干細胞，則由于遷移性和增殖性增強，脂肪源性干細胞通過血流及其遷移性而到達心臟，在缺血性損傷心肌部分集聚并增殖，分化成心血管系統(tǒng)細胞。另外，所集聚的包含內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞可促進血管生成因子的產生和釋放，從而通過大量血管生成因子促進心肌組織的再生。

另外，如上所述，脂肪源性干細胞通過在細胞內對所攝取的內含抑制素納米粒子進行水解，將其所包覆的抑制素緩慢釋放，因此對體內給予脂肪源性干細胞的情況下，給藥后在缺血性損傷心肌緩釋出抑制素，通過釋放出的抑制素促進骨髓干細胞、骨髓源性血管內皮祖細胞(epc：endothelialprogenitorcell)的集聚，也促進骨髓干細胞向心血管系統(tǒng)細胞的分化，從而促進組織的再生。已知epc是存在于骨髓內的血細胞類造血干細胞中的一個細胞分離部分(fraction)，而且雖然數(shù)量少但也存在于末梢循環(huán)血液中，集聚于缺血組織而分化成構成毛細血管的內皮細胞，對新生血管的形成也起作用，作為缺血性疾病中用于血管生成的細胞治療資源還廣泛進行了臨床試驗。進而，還報道了epc不但會分化成血管內皮細胞，還會分化成心肌細胞。本發(fā)明涉及的含有內含抑制素納米粒子的干細胞，可將具有上述功能的epc集聚于缺血性損傷心肌部分，因此對其治療極為有利。進而，通過本發(fā)明涉及的含有內含抑制素納米粒子的干細胞的給藥，存在于心外膜附近的細胞在心肌梗死部分一邊分裂增殖一邊生成肉芽，從而促進心肌的再生。其結果，有利于心肌梗死的治療。應予說明，本發(fā)明涉及的含有內含抑制素納米粒子的干細胞不但能夠治療缺血性心臟病，在干細胞可分化的心臟以外的其他臟器的損傷中，也可獲得抑制素的效果、以及干細胞和epc的再生功能所產生的治療效果。

[實施例]

以下，示出為了對本發(fā)明涉及的用于增強干細胞功能的內含抑制素納米粒子制劑、以及含有該納米粒子制劑的功能增強干細胞及其制備方法進行詳細說明的實施例。

首先，對內含抑制素納米粒子的制備方法進行說明。此處，特別使用辛伐他汀作為抑制素，使用含有聚乳酸聚合物(pla)的納米粒子作為納米粒子。

將pla(wakopurechemicalindustriesltd.，pla0020，重均分子量20000)50mg和辛伐他汀2.5mg溶解于丙酮2ml、乙醇0.5ml的混合溶解中，制成聚合物溶液。將該聚合物溶液滴入室溫下、以500rpm攪拌的2wt％pva溶液10ml中，得到內含辛伐他汀的pla納米粒子懸浮液。接著，在室溫下、一邊以500rpm繼續(xù)攪拌一邊蒸餾除去有機溶劑(丙酮、乙醇)。經過約5小時將溶劑蒸餾除去后，將懸浮液在4℃下、以60000g離心分離30分鐘，將沉淀物回收并再懸浮于蒸餾水中。該離心分離和再懸浮于蒸餾水中的操作共進行3次。然后，將懸浮液冷凍干燥一夜，得到內含辛伐他汀的pla納米粒子。1mg納米粒子中包覆有24.94μg辛伐他汀。以下試驗中，使用該內含辛伐他汀的pla納米粒子。

接著，為了討論用如上所得的內含抑制素納米粒子對干細胞進行處理時的最適處理濃度，進行以下試驗。

為了進行該試驗，首先，采用利用膠原酶處理和離心比重法的公知方法，從人脂肪組織獲得人脂肪源性干細胞(adiposederivedstemcell：adsc)。該方法詳細說明如下。首先，配制含有dnasei(0.1mg/ml，roche，1284932)和3mmcacl2的膠原酶1型(1mg/ml，wako035-17604)/1％bsahbss溶液作為膠原酶溶液。然后，用手術刀將人脂肪組織(約1g～2g)切碎，與約3倍于其組織體積的上述膠原酶溶液一起加入15ml試管中，37℃下振蕩培養(yǎng)60分鐘。然后，向培養(yǎng)后的15ml試管內加入室溫的5mmedta/pbs(將edta(0.5medta，ph8.0，lifetechnologies，am9260g)，10xdpbs，ca(-)，mg(-)(gibco，14200-166)稀釋而制成)，取約15ml的細胞懸浮液進行300g×5min的離心后，吸去上清(包含脂肪層)，添加5mmedta/pbs至20ml。將所得的細胞懸浮液一邊過細胞篩(70μm，bd)一邊回收到新的50ml試管中。向兩根15ml試管中加入室溫的histopaque10774ml，每個試管中平穩(wěn)地加入10ml上述回收的細胞溶液，使該細胞溶液分層而不混合。將兩根試管在室溫下以800g×20min(無間歇(breakless))進行離心，離心后用帶有18g針的2.5ml注射器僅將單核細胞層回收，移入新的15ml試管中，添加冷卻的5mmedta/pbs至14ml。然后，以200g×10min進行離心(有間歇(withabreak))，棄去上清。然后，用1ml冷卻的5mmedta/pbs將細胞懸浮，定容至14ml后，以200g×10min進行離心，棄去上清。將所得的細胞團塊(cellpellet)用初代培養(yǎng)用培養(yǎng)基(10％fbs/dmemf12，sigmad8042+antibiotic-antimycotic，gibco15240-062)懸浮后以約3×10⁴/cm²～4×10⁴/cm²的細胞密度接種于培養(yǎng)皿中。然后，用5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5日，將粘附細胞作為人細胞源性干細胞用于實驗中。

如此得到人細胞源性干細胞后，采用上述乳化溶劑擴散法，通過代替抑制素而將羅丹明紅熒光染料包覆在pla納米粒子中，得到內含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子。將所得的內含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子添加到上述脂肪源性干細胞的培養(yǎng)基中，使該pla納米粒子的終濃度達到20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml或100μg/ml。1小時后(1h)或2小時后(2h)，使用激光共聚焦熒光顯微鏡，對內含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子的攝取進行觀察。應予說明，核的染色使用dapi按照常法進行。其結果示于圖1。

如圖1所示，可知內含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子在所有濃度下均能被脂肪源性干細胞攝取。但是，脂肪源性干細胞對內含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子的攝取量呈處理濃度依賴性增大。而且還可知，與處理時間為1小時的情況相比，在處理時間為2小時的情況下脂肪源性干細胞對內含辛伐他汀的pla納米粒子的攝取量較多。特別確認了，在以100μg/ml的濃度用內含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子對脂肪源性干細胞進行處理的情況下，干細胞攝取了大量內含羅丹明紅熒光染料的pla納米粒子。

接著，為了討論攝取了內含辛伐他汀的pla納米粒子的脂肪源性干細胞在此后要花費多長時間從細胞內釋放出抑制素，對釋放到培養(yǎng)基中的抑制素的量進行測定。此處，與上述試驗相同，以100μg/ml的濃度用內含辛伐他汀的pla納米粒子對脂肪源性干細胞進行1小時處理后，更換培養(yǎng)基，測定從更換培養(yǎng)基起6小時后、18小時后、以及24小時、48小時、72小時、120小時、168小時和336小時后釋放到培養(yǎng)基中的辛伐他汀的量。具體而言，該測定采用hplc(high-pressureliquidchromatography)法進行。其測定結果示于圖2。

如圖2所示，自測定開始24小時后從脂肪源性干細胞中釋放出約60％左右的抑制素，釋放出所有抑制素需要花費約336小時的時間。從此結果可知，被脂肪源性干細胞攝取的抑制素不是從脂肪源性干細胞中急速釋放，而是緩慢釋放。因此，脂肪源性干細胞在到達缺血心肌之前不會將大部分的抑制素釋放，而是能夠在到達患部之后經過長時間釋放出抑制素，因此可期待良好的治療效果。

接著，為了討論由上述內含辛伐他汀的納米粒子引起的脂肪源性干細胞的遷移能力、增殖能力和血管生成因子產生能力這些功能的增強，進行以下試驗。

首先，使用遷移性試驗試劑盒(transwell(注冊商標))對脂肪源性干細胞的遷移能力進行討論。具體而言，在transwell板(transwellplate)各孔的多孔膜上以5×10⁴細胞/孔(cells/well)接種脂肪源性干細胞，向培養(yǎng)基中添加不含抑制素的pla納米粒子使其濃度達到20μg/ml，或者添加內含辛伐他汀的pla納米粒子使其濃度達到20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml，16～18小時后對通過transwell的膜的細胞數(shù)進行計數(shù)。其結果示于圖3(a)。

如圖3(a)所示，在用20μg/ml不含抑制素的pla納米粒子進行處理的情況(pla20)、以及用20μg/ml內含辛伐他汀的pla納米粒子進行處理的情況(pla-st20)下，與未處理的對照組(control)相比，脂肪源性干細胞的遷移性無變化，而在用50μg/ml內含辛伐他汀的pla納米粒子進行處理的情況(statin50)下，脂肪源性干細胞的遷移性增大。另外，在用100μg/ml內含辛伐他汀的pla納米粒子進行處理的情況(statin100)下，結果導致脂肪源性干細胞的遷移性降低。此結果表明，雖然為最適處理濃度，但內含辛伐他汀的pla納米粒子可使脂肪源性干細胞的遷移能力亢進。

接著，使用mtt比色(mttassay)討論內含辛伐他汀的納米粒子對脂肪源性干細胞增殖性的提高，對其結果進行說明。

首先，將脂肪源性干細胞以5000細胞/孔的細胞數(shù)接種在96孔板中，添加內含辛伐他汀的pla納米粒子使其濃度達到20μg/ml、50μg/ml或100μg/ml，48小時后更換培養(yǎng)基，向各孔中添加mtt溶液，2小時后使用分光光度計測定450nm的吸光度。其結果示于圖3(b)。

如圖3(b)所示，在用內含辛伐他汀的納米粒子以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的濃度進行處理的情況下，與未處理的對照組(control)相比，均出現(xiàn)脂肪源性干細胞的增殖，特別在以50μg/ml的濃度進行處理的情況下，與對照組相比，可見增殖性的顯著增加。此結果表明，通過內含辛伐他汀的pla納米粒子，能夠使脂肪源性干細胞的增殖能力亢進。

接著，為了討論內含辛伐他汀的納米粒子對脂肪源性干細胞的血管生成因子產生能力的效果，使用定量pcr法對脂肪源性干細胞內的血管生成因子的mrna表達量進行解析。此處，作為血管生成因子測定vegf-a、vegf-c和fgf-2的細胞內mrna表達量。

首先，向培養(yǎng)有脂肪源性干細胞的培養(yǎng)基中添加內含辛伐他汀的pla納米粒子使其濃度達到20μg/ml、50μg/ml或100μg/ml，24小時后將以各濃度進行處理的細胞回收，使用nucleospinrna試劑盒(takarabioinc.)提取這些細胞的rna。然后，使用與vegf-a、vegf-c和fgf-2的dna序列相關的引物，通過定量pcr法對各細胞內vegf-a、vegf-c和fgf-2的mrna表達量進行測定。測定如下進行：使用revertraaceqpcrrt試劑盒(toyobo)提取rna，由提取出的rna合成cdna，將所合成的cdna與ssofastevagreenmastermix試劑(bio-rad)和引物(vegf-a：f-ttactctcacctgcttct，r-ctgcttcttccaacaatg，vegf-c：f-tcaaggacagaagagacta，r-ccacatctatacacacctc，fgf-2：f-ttcttccaatgtctgctaa，r-gaccaattatccaaactgag)一起用熱循環(huán)儀(cfxconnectbio-rad)進行反應(95℃30秒進行1循環(huán)、95℃5秒/56℃5秒進行40循環(huán))。

其測定結果示于圖4。應予說明，結果示出以gapdh的mrna表達量為基準的上述各因子的表達量的比率(上述各因子的表達量/gapdh的mrna表達量)。

如圖4(a)所示，在以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的任意濃度用內含辛伐他汀的納米粒子進行處理的情況下，vegf-a的mrna表達量與未處理的對照組(control)相比增大，特別在以100μg/ml的濃度用內含辛伐他汀的納米粒子進行處理時呈現(xiàn)顯著增大。

另外，如圖4(b)所示，在以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的任意濃度用內含辛伐他汀的納米粒子進行處理的情況下，vegf-c的mrna表達量與未處理的對照組(control)相比也增大，特別在以50μg/ml或100μg/ml的濃度用內含辛伐他汀的納米粒子進行處理時呈現(xiàn)顯著增大。

同樣地，如圖4(c)所示，在以20μg/ml(statin20)、50μg/ml(statin50)和100μg/ml(statin100)的任意濃度用內含辛伐他汀的納米粒子進行處理的情況下，fgf-2的mrna表達量與未處理的對照組(control)相比也增大，特別在以50μg/ml或100μg/ml的濃度用內含辛伐他汀的納米粒子進行處理時呈現(xiàn)顯著增大。以上結果表明，通過內含辛伐他汀的pla納米粒子使脂肪源性干細胞的血管生成因子產生能力亢進。

如上所述，由內含抑制素納米粒子引起的脂肪源性干細胞的遷移能力、增殖能力和血管生成因子產生能力這些功能的增強的討論結果為，通過內含抑制素納米粒子可增強脂肪源性干細胞的功能。這些功能是在脂肪源性干細胞在生物體內給藥后集聚于缺血心肌部分，有利于該部分的再生的功能，通過使這些功能增強，脂肪源性干細胞對心肌梗死等缺血性心臟病的治療極為有利。

接著，使用心肌梗死模型小鼠，對本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子以及含有該納米粒子的干細胞的心肌梗死治療效果進行討論。

首先，對12周齡雄balb/c裸鼠進行缺血誘發(fā)(冠狀動脈前降支結扎模型)，同時進行心臟超聲圖像診斷(第0日)，3日后(第3日)，尾靜胍給予pbs(磷酸緩沖生理鹽水)、如上所述分別得到的攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞、攝取了內含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞、或者內含抑制素pla納米粒子。應予說明，作為攝取了內含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞，使用以100μg/ml的濃度用內含抑制素納米粒子對脂肪源性干細胞進行1小時處理所得的干細胞。脂肪源性干細胞的給藥量為1×10⁴細胞/小鼠，內含抑制素pla納米粒子的給藥量為50μg/小鼠。另外，在同一日(第3日)內還進行心臟超聲圖像診斷。經過11日后(第14日)，再次進行心臟超聲圖像診斷。經過14日后(第28日)，再次進行心臟超聲圖像診斷，然后解剖進行心臟的組織學解析。在心臟超聲圖像診斷中，測定左室射血分數(shù)(ef)、左室縮短分數(shù)(fs)、左室舒張末期內徑(lvdd)和左室收縮末期內徑(lvds)。作為組織學解析，對毛細血管密度、纖維化面積率、脂肪源性干細胞的存活率(takingrate)和脂肪源性干細胞的分化頻率進行解析。心臟超聲圖像診斷的結果示于圖5，第28日從上述小鼠中摘出的心臟示于圖6，組織學解析的結果示于圖7、圖8、圖10～17。另外，從給予上述攝取了內含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞后第60日的小鼠中摘出的心臟、及其不同部分的切片示于圖9。

如圖5(a)和(b)所示，第3日在所有組中ef和fs降低，心臟功能惡化，然后在第14日和第28日，未處理的對照組(pbs：●)中未見改善，但在攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(pla+adsc：▲)、以及內含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla：)中略有改善。另外，攝取了內含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(statin/pla+adsc：■)中，出現(xiàn)顯著改善。另外，如圖5(c)和(d)所示，對于lvdd和lvds，將未處理的對照組(pbs：●)、攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(pla+adsc：▲)、以及內含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla：)進行比較，攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(statin/pla+adsc：■)中，可抑制lvdd和lvds尺寸的增大，可確認心功能的改善。

另外，如圖6所述，從外觀也可確認，攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(右側的照片)與對照組(左側的照片)相比，心臟的擴大受到抑制。

另外，按照常法制作各組摘出心臟中梗死部分的切片，進行馬松三色染色，對心肌壁切面面積進行評價，結果示于圖7。圖7(a)表示染色后切片的照片，箭頭表示纖維化而染成藍色的瘢痕部分。圖7(b)表示以整周長度為100％時染成藍色的纖維化部分的長度(圖7(a)箭頭方向的長度)所占的比例，圖7(c)表示以正常心肌壁厚為100％時染成藍色的纖維化部分的心肌壁厚所占的比例。

如圖7(a)和(b)所示，與未處理的對照組(control)、攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(pla+adsc)、以及內含抑制素pla納米粒子的給藥組(stain/pla)相比，在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(adsc+statin/pla)中，纖維化而染成藍色的瘢痕部分的長度較短。進而，如圖7(a)和(c)所示，攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組與其他組相比，心肌壁厚也較厚，意味著促進了心肌部分的再生。

圖8示出各組切片中纖維化部分的放大照片。如圖8所示，對照組(control)中呈現(xiàn)出幾乎全染成藍色的平滑外觀，另外，攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(pla+adsc)、以及內含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla)雖然微有染成紅色的部分，但與對照組相比未見大差異。另一方面，攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(adsc+statin/pla)中，纖維化的心肌壁向外側膨出，出現(xiàn)染成紅色的部分。該部分在其他組中未見，推測該部分處于通過攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞而再生為新心肌的過程中。

另外，圖6～8中示出給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞28日后小鼠的心臟，為了確認此后是否有進一步的治療效果，對給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞60日后小鼠心臟的外觀進行觀察，并對該心臟不同部分的切片進行上述同樣的染色、觀察。其結果示于圖9。應予說明，圖9(a)是示出該小鼠的心臟的照片，圖9(b)～圖9(e)是沿圖9(a)所示的(b)～(e)各線切出的切片經馬松三色染色所得結果的照片。應予說明，圖9(b)的曲線箭頭表示通過上述染色而染成藍色的區(qū)域。

如圖9(a)所示，給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞60日后，在28日后出現(xiàn)的梗死(纖維化)部分有進一步縮小的趨勢。另外，如圖9(b)～(e)所示，梗死部分的各切片中心肌壁增厚，另外，除了圖9(b)所示的結扎部分以外大部分染成紅色，因此可判斷為促進了心肌部分的再生。此結果表明，給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞60日后，可見功能性心肌的再生治療效果。

接著，為了對梗死部分的心肌組織內的血管生成進行討論，使用與在血管內皮細胞中表達的糖蛋白、以及在血管平滑肌細胞中表達的蛋白分別結合的抗體等對上述切片進行免疫染色，結果示于圖10。具體而言，使用與在血管內皮細胞中表達的糖蛋白結合的植物源性蛋白即fitc(fluoresceinisothiocyanate)標記的同工凝集素b4、以及與在血管平滑肌細胞中表達的蛋白即smα肌動蛋白結合的兔源性igg抗體作為上述抗體等，使用alexa488-羊源性抗兔igg抗體作為兔源性igg的二次抗體，進行染色。

如圖10所示，在對照組(control(pbs))中，使用fitc-同工凝集素b4(isolectinb4)、以及抗smα肌動蛋白抗體(smα-actin)時均幾乎未見染色，即幾乎未檢測出血管內皮細胞和血管平滑肌細胞，可判斷為血管幾乎不存在。另外，在內含抑制素納米粒子的給藥組(statin/plga)中，也幾乎未檢測出血管內皮細胞和血管平滑肌細胞，在攝取了不含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(pla-adsc)中，略微檢測出血管內皮細胞和血管平滑肌細胞。于之相對，在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(statinpla-adsc)中，非常多的區(qū)域內可見染色，可判斷是由血管生成所引起的。即，通過給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞，可促進心肌內血管組織的再生。

接著，對缺血邊界區(qū)域內的血管密度進行討論。具體而言，對于各組的纖維化部分，與上述解析同樣用fitc-同工凝集素b4進行熒光染色，測定顯微鏡視野內染色區(qū)域的大小。另外，將該測定結果以血管密度制成圖表。其結果示于圖11。

如圖11(a)和(b)所示，與對照組(control(pbs))相比，在攝取了不含抑制素pla納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(pla+adsc)、以及內含抑制素pla納米粒子的給藥組(statin/pla)中，血管密度略有增大，另外與這些給藥組相比，在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(stain/pla+adsc)中，可進一步確認血管密度增大。由其結果也可判斷出，通過給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞，在梗死周圍部分(缺血部分)促進了血管生成而有助于心肌組織再生。

接著，為了討論缺血心肌組織的細胞增殖活性，使用與細胞增殖期內表達的ki67蛋白結合的抗體，對上述切片進行免疫染色，結果示于圖12。具體而言，對于照組和攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組的纖維化部分，使用fitc-同工凝集素b4、兔源性抗ki67抗體、以及作為二次抗體的alexa594-羊源性抗兔igg抗體，對血管內皮細胞和增殖期的細胞進行免疫染色。

如圖12所示，在未處理的對照組(control)中，無論使用何種抗體均未見染色，但在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(stain+adsc)中，不但與上述試驗同樣被fitc-同工凝集素b4染色，而且還出現(xiàn)被抗ki67抗體染色。此結果意味著，通過給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞，可促進缺血心肌組織的細胞增殖活性。另外，同工凝集素b4的染色部分與ki67的染色部分不同，所增殖的細胞與形成毛細血管的血管內皮細胞不同(間質的成纖維細胞等)。

另外，圖13示出使用抗smα-肌動蛋白抗體和抗ki67抗體，與上述同樣對切片進行免疫染色所得的結果。如圖13所示，在此情況下，對照組(control)中無論使用何種抗體均幾乎未見染色。另一方面，在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(statin+adsc)中，不但與上述試驗同樣被抗smα-肌動蛋白抗體染色，而且還出現(xiàn)被抗ki67抗體染色。另外，抗smα-肌動蛋白抗體的染色部分與抗ki67抗體的染色部分不同，所增殖的細胞與平滑肌細胞不同(間質的成纖維細胞等)。

另外，圖14示出使用對心外膜細胞所具有的wt1蛋白進行染色的抗wt1抗體和上述抗ki67抗體，與上述同樣對給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞14日后上述心肌梗死模型小鼠的心臟梗死部分的切片進行免疫染色所得的結果。如圖14所示，心肌梗死部分中多見被抗wt抗體染色的心外膜細胞，另外，其最外部多見被抗wt1抗體和抗ki67抗體共同染色的增殖期細胞(箭頭部分)。此結果意味著，在梗死部分，心外膜細胞一邊向外側增殖分裂一邊生成肉芽，從而使心肌壁再次增厚而再生。因此，可推測出即使在例如從心肌梗死發(fā)病起經過1個月以上，梗死部分大多處于瘢痕狀態(tài)的情況下，通過給予本發(fā)明所述的攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞，可使殘留在瘢痕部分的心外膜細胞增殖，促進心肌的再生，從而治療心肌梗死。

接著，為了討論攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞對心肌的再生，使用與在心肌細胞中表達的蛋白結合的抗體進行免疫染色，結果示于圖15。此處，作為與在心肌細胞中表達的蛋白結合的抗體，使用與也在未成熟心肌細胞中表達的gata4結合的兔源性igg抗體、作為二次抗體的alexa488羊源性抗兔igg抗體、與不在未成熟心肌細胞中表達而僅在成熟心肌細胞中表達的αmhc結合的小鼠源性igg抗體、以及作為二次抗體的alexa594羊源性抗小鼠igg抗體。

如圖15所示，對上述gata4進行免疫染色的結果，在未處理的對照組(control)中幾乎未被染色，而在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(statin+adsc)中檢測出很多染色區(qū)域。另一方面，對上述αmhc進行免疫染色的結果為，在對照組幾乎未見染色，而在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組中微有染色，但與抗gata4抗體的染色結果相比染色區(qū)域明顯較少。

圖16示出使用與gata4同樣在未成熟心肌細胞中表達的nkx2.5的兔源性igg抗體、作為二次抗體的alexa488羊源性抗兔igg抗體、以及上述αmhc的抗體，與上述同樣進行免疫染色的結果。如圖16所示，與圖15的結果相同，使用在未成熟心肌細胞中表達的nkx2.5進行免疫染色的結果為，在對照組(control)中幾乎未見染色，而在攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞的給藥組(statin+adsc)中檢測出很多染色區(qū)域。

圖15和圖16所示的結果表明，給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞時，缺血心肌組織中出現(xiàn)未成熟心肌細胞。即，意味著通過攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞促進了心肌組織的再生。

在以上實驗中，如上所述示出了以1×10⁴細胞/小鼠對心肌梗死模型小鼠給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞時的結果，接著，對以5×10⁴細胞/小鼠的量給藥時心肌組織的再生進行討論。為此，對與上述同樣制成的心肌梗死模型小鼠進行缺血處理3日后，以5×10⁴細胞/小鼠尾靜胍給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞，25日后與上述同樣進行解剖，制成心肌梗死部分的切片。使用與在心肌骨格肌細胞中表達的ctn-1(心肌型肌鈣蛋白)結合的兔源性igg抗體和作為二次抗體的alexa488羊源性抗兔igg抗體、或者在平滑肌細胞中表達的與上述相同的抗smα肌動蛋白抗體、以及與人線粒體(hmtcd)結合的兔源性igg抗體和作為二次抗體的alexa594羊源性抗兔igg抗體，對該切片進行免疫染色。其結果示于圖17。

如圖17所示，在心肌梗死模型小鼠中，以5×10⁴細胞/小鼠給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞時，在心肌組織的纖維化部分可見抗ctn-1抗體的染色(箭頭部分)，確認了心肌細胞的表達。另外，還可見hmtcd抗體的染色(箭頭部分)，即表明給予的人脂肪組織源性干細胞殘留在心肌組織內。另外，將這些圖像重合時，出現(xiàn)染色區(qū)域重疊的部分(箭頭部分)。因此，意味著給予的人脂肪源性干細胞分化成心肌。應予說明，雖然也被smα肌動蛋白抗體染色，但該染色區(qū)域與hmtcd抗體的染色區(qū)域幾乎不重疊。

以上結果意味著，以5×10⁴細胞/小鼠的容量給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞時，在缺血心肌組織內發(fā)生給藥細胞的集聚和殘存，進而特別發(fā)生該細胞向心肌細胞的分化。

接著，對由攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞所釋放出的抑制素而使骨髓源性血管內皮祖細胞(epc)向梗死部分集聚的效果進行討論。如上所述，已知epc是存在于骨髓中的血細胞類造血干細胞中的一個細胞分離部分，可分化成構成毛細血管的內皮細胞、心肌細胞。另外，還已知epc是血管穩(wěn)定化因子中的一種即血管生成素-1的受體，在被識別為內皮系細胞標記的tie2陽性細胞中含有大量epc。因此，將可通過基因重組利用β-gal(β-半乳糖苷酶)的免疫染色鑒定tie2陽性細胞的tie2/lacz轉基因小鼠作為供體，從其骨髓中提取骨髓單核細胞。

tie2/lacz轉基因小鼠可采用常法制作，具體而言可通過以下方式制作：將lacz基因結合在小鼠tie2啟動子/增強子的內部，制成重組基因載體，然后從在細菌內擴增的上述重組基因載體中分離、純化出小鼠tie2/lacz基因表達載體，將該小鼠tie2/lacz基因表達載體微注射到小鼠受精卵中。另外，骨髓單核細胞的提取如下進行。首先，小鼠處死后將股骨、脛骨、脊骨、髂骨分離，切碎后放入乳缽中，加入室溫的5mmedta/pbs20ml，用研杵敲擊(tapping)骨片制成細胞懸浮液。將該細胞懸浮液一邊過細胞篩(40μm，bd)一邊回收到新的50ml試管中，向兩根15ml試管中加入室溫的histopaque10834ml(sigma，10831)，每個試管中平穩(wěn)地加入10ml細胞溶液，使該細胞溶液分層而不混合。然后，將兩根試管在室溫下以800g×20min(無間歇)進行離心，離心后用帶有18g針的2.5ml注射器僅將單核細胞層回收，移入新的15ml試管中，添加冷卻的5mmedta/pbs至14ml。然后，以200g×10min進行離心(有間歇)，棄去上清。之后，用1ml冷卻的5mmedta/pbs將細胞懸浮，定容至14ml后，以200g×10min進行離心，棄去上清，制成骨髓單核細胞團塊，用于以下所示的骨髓移植實驗中。

作為骨髓移植如下進行：首先，對6～8周齡雄balb/c裸鼠照射x射線(以5gy照射2次)，得到骨髓細胞完全破壞的小鼠作為受體小鼠，移植上述所得的供體小鼠的骨髓單核細胞。4周后，與上述試驗同樣對該受體小鼠進行缺血誘發(fā)(冠狀動脈前降支結扎模型)，該處理進行3日后，尾靜胍給予內含抑制素pla納米粒子。應予說明，脂肪源性干細胞的給藥量為1×10⁴細胞/小鼠。給藥25日后進行解剖，按照常法制作心臟梗死部分的切片。然后，使用上述抗ctn-1抗體、抗smα肌動蛋白抗體或fitc-同工凝集素b4、以及兔源性igg的抗β-gal抗體和作為二次抗體的alexa594羊源性抗兔igg抗體，對該切片進行免疫染色。其結果示于圖18。

如圖18所示，使用抗ctn-1抗體、抗smα肌動蛋白抗體和fitc-同工凝集素b4時，與上述結果相同，在缺血心肌組織內心肌細胞和平滑肌細胞被染色。另外，使用β-gal抗體的時，也在缺血心肌組織內出現(xiàn)染色區(qū)域。即，可見來源于骨髓的epc集聚于缺血心肌組織。另外，將用抗ctn-1抗體或fitc-同工凝集素b4染色所得的圖像與用抗β-gal抗體染色所得的圖像重疊時，染色部分相互重疊(箭頭部分)，意味著從骨髓集聚的epc分化成心肌細胞。另一方面，將用smα肌動蛋白抗體染色所得的圖像與用β-gal抗體染色所得的圖像重疊時，染色部分幾乎互不重疊。

該結果表明，對心肌梗死小鼠給予攝取了內含抑制素納米粒子的脂肪源性干細胞時，通過集聚于缺血性損傷心肌部分的脂肪源性干細胞釋放出抑制素，epc集聚到該缺血性損傷心肌部分，所集聚的epc促進血管生成，并且分化成心肌細胞促進缺血性損傷部分的治療。

綜上所述，本發(fā)明涉及的內含抑制素納米粒子可增強干細胞的遷移性、增殖性和血管生成因子產生能力等功能，該功能增強干細胞集聚于梗死部分，在增殖的同時釋放出血管生成因子，從而促進梗死部分的血管生成。進而，該集聚并增殖的干細胞分化成心肌，從而促進心肌的再生，其結果，顯示出優(yōu)異的心肌梗死等缺血性心臟病的治療效果。另外，該干細胞能夠將所攝取的抑制素緩慢釋放，由此可得到抑制素本身的血管生成效果等抑制素所特有的各種效果，因此有益于以缺血性心臟病為代表的各種疾病的治療。進而，通過從集聚于患部的干細胞釋放出的抑制素，可使體內的干細胞、骨髓源性血管內皮祖細胞(epc)的集聚亢進，其結果，在例如缺血性心臟病的情況下，能夠進一步促進梗死部分心肌的再生。另外，抑制素等化合物在單純給藥時，會隨著血流被運送至患部，但在心肌梗死等缺血性心臟病中，血流受阻，難以正常到達患部，而本發(fā)明所述的抑制素被遷移性增強的干細胞攝取并運送，因此即便血流受阻也能到達患部，即可形成良好的藥物傳遞系統(tǒng)，從而能夠減少應給藥的細胞數(shù)。通過上述作用，本發(fā)明對心肌梗死等缺血性心臟病的治療可發(fā)揮極好的效果。

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<110>伊井正明,公益財團法人先端醫(yī)療振興財團

<120>用于增強干細胞功能的內含抑制素納米粒子制劑、以及含有其的功能增強干細胞及其制備方法

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