發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及光動(dòng)力學(xué)方法及由其獲得的產(chǎn)物。尤其地，本發(fā)明涉及用于耗盡來(lái)自細(xì)胞群的某些細(xì)胞的光動(dòng)力學(xué)方法及由其獲得的產(chǎn)物。發(fā)明背景移植或同種異體移植涉及從一個(gè)個(gè)體或多個(gè)個(gè)體(供體)向另一個(gè)體(受體)捐贈(zèng)材料。在同種異體移植期間，供體細(xì)胞可與受體細(xì)胞和組織發(fā)生反應(yīng)(移植物抗宿主病)，這是由于hla抗原中的錯(cuò)配引起的不必要的反應(yīng)。有若干種方法來(lái)鑒定和消除與受體細(xì)胞反應(yīng)并被受體細(xì)胞激活的供體細(xì)胞，通常是t淋巴細(xì)胞?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)是離體方法，其可用于研究宿主和供體細(xì)胞之間的反應(yīng)性。結(jié)合光動(dòng)力學(xué)治療，它可用于選擇性消除被宿主細(xì)胞激活的供體細(xì)胞。這種同種異體反應(yīng)性t細(xì)胞的組合鑒定和消除用于制造選擇性耗盡針對(duì)宿主的同種異體反應(yīng)性t細(xì)胞的富含t細(xì)胞的供體淋巴細(xì)胞制劑。這是例如在wo01/24824中所描述的，其中這些制劑是通過(guò)在il-2存在下將供體細(xì)胞與γ輻照的受體細(xì)胞混合來(lái)制備的，以在受體的錯(cuò)配的主要hla抗原的方向上誘導(dǎo)供體細(xì)胞的單向mlr。培養(yǎng)期后，收獲細(xì)胞并暴露于積聚在所有細(xì)胞中的熒光光敏羅丹明化合物th9402。在不存在th9402的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞的后續(xù)期之后，優(yōu)選將染料保留在以單向mlr激活的那些細(xì)胞中，即那些與受體的錯(cuò)配的hla抗原反應(yīng)的供體細(xì)胞。接下來(lái)，將細(xì)胞暴露于可見(jiàn)波長(zhǎng)的光，導(dǎo)致th9402的活化和高細(xì)胞毒性活性氧自由基的產(chǎn)生，從而消除那些與受體的錯(cuò)配的hla-抗原反應(yīng)的供體細(xì)胞，但避開(kāi)其它供體細(xì)胞。mielke等(2008)blood111:4392-4402描述了一種mlr，其中使用抗cd3和il-2產(chǎn)生的擴(kuò)增t細(xì)胞與來(lái)自hla匹配或錯(cuò)配的供體的應(yīng)答細(xì)胞共培養(yǎng)。在該研究中，用7.5微摩爾th9402的孵育比用5微摩爾的孵育得到顯著更好的結(jié)果。perrucio等(2007)bloodcellsmoleculesanddiseases40:76-83描述了一種mlr方法，隨后進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)處理，無(wú)需擠出步驟。細(xì)胞群死亡百分之九十至百分之九十五。該方法的主要限制是在單次處理中可以處理的細(xì)胞數(shù)量。待處理細(xì)胞的濃度在擠出相中不能超過(guò)一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml，而不損害最終產(chǎn)物的質(zhì)量。因此，為了處理更多的細(xì)胞，需要增加在該方法中待處理的體積。然而，操縱大體積，例如一升甚至更大，是困難的，并影響處理的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。對(duì)一名患者的足夠的細(xì)胞進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)處理將需要約十個(gè)照射裝置或若干輪處理。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及光動(dòng)力學(xué)方法，其包括：(i)將細(xì)胞制劑在包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中孵育；(ii)用擠出培養(yǎng)基(extrusionmedium)代替(i)中的培養(yǎng)基以除去光敏化合物，和(iii)照射擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑以選擇性地殺傷已經(jīng)保留光敏化合物的那些細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)于在使用多于5微摩爾、例如10微摩爾的光敏化合物的參考方法中所常規(guī)使用的，在擠出相中可使用更小的體積和更高的細(xì)胞濃度，而不損害最終產(chǎn)物的質(zhì)量。令人驚奇的是，與通過(guò)使用多于5微摩爾光敏化合物、例如10微摩爾光敏化合物的參考方法可獲得或獲得的參考細(xì)胞產(chǎn)物相比，通過(guò)該方法可獲得的細(xì)胞產(chǎn)物得到改善。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以在相同時(shí)間和相同條件下光動(dòng)力學(xué)處理更多的細(xì)胞。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可使用較少的光敏化合物，同時(shí)獲得與參考細(xì)胞產(chǎn)物相比改善的細(xì)胞產(chǎn)物。所有這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化和效率和處理的容易性都有很大的影響?，F(xiàn)有技術(shù)方法僅允許低濃度、例如1×106細(xì)胞/ml的光動(dòng)力學(xué)處理。如果使用每個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛱幚砝?00×106個(gè)細(xì)胞的照射裝置，總共處理1×109個(gè)細(xì)胞，其為一個(gè)人的平均細(xì)胞數(shù)量，將需要10輪100×106個(gè)細(xì)胞或同時(shí)使用10個(gè)照射裝置。各輪處理之間的處理?xiàng)l件可能略有差異，因此優(yōu)選避免若干輪處理。對(duì)于一次處理使用十個(gè)照射裝置也是昂貴的并且占用空間，因此也優(yōu)選避免。使用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以以更高的濃度和更小的體積來(lái)處理1x109個(gè)細(xì)胞。因此，照射裝置的數(shù)量可以減少80％至一個(gè)或兩個(gè)，并且所有的細(xì)胞可以在相同時(shí)間和相同條件下進(jìn)行處理。根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致擠出相中的細(xì)胞濃度高于染色相中的細(xì)胞濃度。這允許重要的培養(yǎng)基減少，促進(jìn)可擴(kuò)展性(scalability)，并允許用相等的設(shè)備處理更多的細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法中，光敏劑可用于選擇性殺傷某些細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這被實(shí)現(xiàn)是因?yàn)楣饷艋衔镌谒屑?xì)胞中積聚，但在洗滌步驟后優(yōu)先保留在某些細(xì)胞中，這允許選擇性殺傷特定細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，光敏化合物僅在某些細(xì)胞中積聚，這允許僅殺傷這些細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“光動(dòng)力學(xué)方法”是指將光敏化合物暴露于光，從而轉(zhuǎn)化成一種或多種具有細(xì)胞毒性的產(chǎn)物的方法。任何合適的光敏化合物可用于根據(jù)本發(fā)明的方法中，包括羅丹明和羅丹明衍生物。尤其感興趣的是wo02/079183中公開(kāi)的羅丹明衍生物，其由式(i)涵蓋：其中：-r1、r2、r3、r4和r10中的一個(gè)代表鹵原子，其余的r1、r2、r3、r4中的每一個(gè)和其余的r10基團(tuán)的每一個(gè)獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、鹵原子、氨基、酰氨基、二烷基氨基、環(huán)烷基氨基、氮雜環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基氨基、芳?；被⒍蓟被?、芳基烷基氨基、芳烷基氨基、烷基芳烷基氨基、芳基芳烷基氨基、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨基甲?；?、烷基氨基甲?；?、二烷基氨基甲?；?、氰基、羥基磺?；?、氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基烷基氨基磺酰基、甲?；?、酰基、芳酰基、烷基，亞烷基、烯基、芳基、芳烷基、乙烯基、炔基和相應(yīng)的取代基；-m＝0-1；-n＝1-4；-a為無(wú)、o或nh；-r9代表亞烷基；-z為h、氨基、二烷基氨基或三烷基氨基鹽；-x-為陰離子；且-r5、r6、r7和r8獨(dú)立地為h或c1-c6烷基，或r1與r5或r6結(jié)合、或r2與r5或r6結(jié)合、或r3與r7或r8結(jié)合、或r4與r7或r8結(jié)合代表亞烷基；和在ep073794中公開(kāi)的羅丹明衍生物。尤其感興趣的是二溴羅丹明衍生物。合適的光敏化合物包括光敏羅丹明衍生物，其是以下化合物的鹽：2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸甲酯；2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸乙酯；2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸辛酯；2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸正丁酯；2-(6-乙基氨基-3-乙基亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸正丁酯；2,7-二溴羅丹明b甲酯；2,7-二溴羅丹明b己酯；4,5-二溴羅丹明6g；2'-(6-二甲基氨基-3-二甲基亞氨基-3h-呫噸-9-基)4'，5'-二氯-苯甲酸甲酯；4,5-二溴羅丹明1102-(2-甲氧基乙氧基)乙酯或羅丹明b3-溴丙酯；諸如例如選自由以下組成的組的光敏羅丹明衍生物：2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸甲酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸乙酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸辛酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸正丁酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；2-(6-二乙基氨基-3-乙基亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸正丁基二酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；2,7-二溴羅丹明b甲酯的醋酸鹽；2,7-二溴羅丹明b己酯的醋酸鹽；4,5-二溴羅丹明6g的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；2'-(6-二甲基氨基-3-二甲基亞氨基-3h-呫噸-9-基)4',5'-二氯-苯甲酸甲酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；4,5-二溴羅丹明1102-(2-甲氧基乙氧基)乙酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽和羅丹明b3-溴丙酯的氫溴酸鹽或鹽酸鹽；和這些光敏化合物的光敏衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸甲酯(也稱(chēng)為4,5-二溴羅丹明123甲酯)的鹽，如2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸甲酯(也稱(chēng)作th9402)的氫溴酸鹽或鹽酸鹽或3,6-二氨基-4,5-二溴-9-(2-(甲氧基羰基)苯基)呫噸鎓氯化物(casno.174230-05-8)。上述光敏羅丹明或羅丹明衍生物的光敏化允許選擇性殺傷細(xì)胞，因?yàn)楣饷袅_丹明或羅丹明衍生物優(yōu)先被某些細(xì)胞諸如腫瘤細(xì)胞和活化細(xì)胞保留。其他細(xì)胞，如非腫瘤細(xì)胞或非活化細(xì)胞，不保留這些光敏羅丹明或羅丹明衍生物，并因此不受影響。包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑可以是細(xì)胞的任何制劑。細(xì)胞通常來(lái)自哺乳動(dòng)物來(lái)源的器官或組織，優(yōu)選來(lái)自人類(lèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞由實(shí)體或軟組織如肝臟或骨髓制備。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞由非實(shí)體組織如血液或尤其是外周血制備。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“外周血”是指不在骨髓或器官中的血液，即循環(huán)中的血液。包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑可以包含干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞制劑中至少60％的細(xì)胞、至少70％的細(xì)胞、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的細(xì)胞是干細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指全能或多能的且主要存在于骨髓中的未分化細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞制劑包含100％干細(xì)胞。干細(xì)胞可以是任何種類(lèi)的干細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞的制劑包含至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的造血干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞的制劑由造血干細(xì)胞組成。包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑可包含t淋巴細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞制劑中至少10％的細(xì)胞、至少20％的細(xì)胞、至少30％的細(xì)胞、至少40％或至少50％的細(xì)胞、至少60％的細(xì)胞、至少70％的細(xì)胞、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的細(xì)胞是t淋巴細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞制劑包含100％的t淋巴細(xì)胞。t淋巴細(xì)胞可被確定為cd3+和cd45+兩者的細(xì)胞，也稱(chēng)為t細(xì)胞。包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑通常是希望從中耗盡某些細(xì)胞的細(xì)胞制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞制劑將從中耗盡腫瘤細(xì)胞，以確保那些處理過(guò)的細(xì)胞的移植不會(huì)在受體中引起腫瘤形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑將從中耗盡活化的細(xì)胞、尤其是從中耗盡活化的白細(xì)胞、更尤其是從中耗盡活化的t淋巴細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞制劑是供體和受體細(xì)胞的混合物，其需要從中耗盡受體激活的供體細(xì)胞、尤其是從中耗盡受體激活的供體t淋巴細(xì)胞。t淋巴細(xì)胞的活化可通過(guò)某些表面標(biāo)志物的上調(diào)，例如，il-2受體或其亞基如il-2受體α鏈，也稱(chēng)為cd25的上調(diào)，或通過(guò)增殖，即分裂和增殖，而顯而易見(jiàn)。增殖可需要增殖因子，諸如，例如白介素，如白介素2或其他生長(zhǎng)因子，并且可在如下所述的增殖測(cè)定中測(cè)量?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)激活細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，激活是由混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)引起。在本文中，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)指離體反應(yīng)，其中將來(lái)自兩個(gè)個(gè)體(其中至少一個(gè)含有t淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞制劑混合以允許來(lái)自一個(gè)個(gè)體(應(yīng)答者)的t淋巴細(xì)胞與來(lái)自另一個(gè)個(gè)體(刺激者)的細(xì)胞的增殖反應(yīng)。mlr優(yōu)選是單向mlr，其中處理刺激者細(xì)胞使其不增殖。使細(xì)胞不增殖的合適方式是通過(guò)干擾其dna功能，例如，通過(guò)γ輻照或通過(guò)用絲裂霉素c處理它們。使細(xì)胞不增殖的另一種合適方式是固定細(xì)胞，例如通過(guò)甲醛或多聚甲醛。用于mlr的t細(xì)胞可以是分離的，或者可以存在于還含有其它類(lèi)型的細(xì)胞的制劑中。在一個(gè)實(shí)施方案中，mlr中使用的t細(xì)胞存在于外周血單核細(xì)胞(pbmc)部分中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何制備pbmc部分，例如，通過(guò)梯度密度離心。mlr中使用的t細(xì)胞優(yōu)選不是例如通過(guò)抗cd3抗體或白介素-2預(yù)活化的。使用預(yù)活化的t細(xì)胞作為應(yīng)答者可導(dǎo)致在光動(dòng)力學(xué)處理期間細(xì)胞的非選擇性消耗或光消耗之后剩余的t細(xì)胞耗盡，其是不優(yōu)選的。在mlr中使用預(yù)活化的t細(xì)胞作為刺激者也不是優(yōu)選的，因?yàn)檫@些細(xì)胞產(chǎn)生引起非選擇性消耗的激活的細(xì)胞因子的混合物。在mlr中，通常將細(xì)胞孵育2至7天，優(yōu)選4至5天。在一個(gè)實(shí)施方案中，供體和受體細(xì)胞在單向mlr中孵育四天。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑是通過(guò)單向mlr獲得的來(lái)自健康供體的淋巴細(xì)胞和來(lái)自受體的非增殖性淋巴細(xì)胞的供體和受體細(xì)胞的mlr混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑是通過(guò)單向mlr獲得的來(lái)自健康供體的淋巴細(xì)胞和來(lái)自受體的非增殖性淋巴細(xì)胞的供體和受體細(xì)胞的mlr混合物，其中一些供體細(xì)胞由于供體和受體是不相同的hla單倍型而被激活，并且供體細(xì)胞被受體細(xì)胞上錯(cuò)配的hla抗原激活。受體可以是患者，例如，從供體已經(jīng)接受或?qū)⒔邮芤浦参锏幕颊摺Ｒ浦参锟梢允墙M織、器官或細(xì)胞，并且可以是實(shí)體或非實(shí)體的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，患者是已經(jīng)接受或?qū)⒔邮芨杉?xì)胞移植的患者，例如血癌患者或鐮狀細(xì)胞性貧血患者、或肉芽腫病患者、或地中海貧血患者或?qū)嶓w器官移植的受體。供體和受體可以是任何物種，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，受體是人類(lèi)，更優(yōu)選地，供體和受體都是人類(lèi)。包含供體和受體細(xì)胞的細(xì)胞制劑可以方便地用于根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法中，其通過(guò)特異性消除由受體細(xì)胞激活的供體細(xì)胞來(lái)預(yù)防移植物抗宿主病(gvhd)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)移植物抗宿主病(gvhd)是指一種疾病，其中在同種異體移植的情況下，供體細(xì)胞、尤其是t淋巴細(xì)胞攻擊受體細(xì)胞。根據(jù)疾病的癥狀和表現(xiàn)，gvhd可以是急性或慢性的。將細(xì)胞制劑在包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中孵育。在一個(gè)實(shí)施方案中，其包含4微摩爾或更少、3微摩爾或更少、2微摩爾或更少或1微摩爾或更少的光敏化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含0.1至5微摩爾的光敏化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含0.5至5微摩爾的光敏化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含1至5微摩爾或2至5微摩爾的光敏化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含0.5至4微摩爾、1至4微摩爾或2至4微摩爾的光敏化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含0.1至3微摩爾的光敏化合物。上面已經(jīng)提到了合適的光敏化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，光敏化合物是如上所述的羅丹明或羅丹明衍生物。包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基的體積必須足以使光敏化合物有效地染色細(xì)胞，并且將取決于患者的體重。合適的染色體積通常在900至1500ml的范圍內(nèi)。對(duì)于50kg患者，染色可適當(dāng)?shù)卦?00至1100ml中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于50kg患者，在約1000ml中進(jìn)行染色。對(duì)于100kg患者，染色可以適當(dāng)?shù)卦?300至1400ml中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于100kg患者，其在約1375ml中進(jìn)行。包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含一般的細(xì)胞培養(yǎng)成分，如血漿、血清或抗生素。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含供體血漿?？梢允褂玫暮线m的培養(yǎng)基組合物是不含慶大霉素且不含酚紅(lonza,usa)的x-vivotm15培養(yǎng)基和2.5％(v/v)熱滅活的(hi)供體血漿。染色可以在20℃至40℃范圍內(nèi)的溫度下、優(yōu)選在25至38℃范圍內(nèi)的溫度、更優(yōu)選在36.5至37.5℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。co2濃度合適地為約5％，即4.5％至5.5％。在一個(gè)實(shí)施方案中，染色在36.5至37.5℃范圍內(nèi)的溫度和約5％的co2濃度下進(jìn)行。將細(xì)胞制劑在包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中孵育長(zhǎng)達(dá)為染色所必要的時(shí)間，即制劑中至少90％的細(xì)胞吸收光敏化合物。優(yōu)選地，制劑中至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的細(xì)胞被染色。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，制劑中的所有細(xì)胞都被染色。這通常需要30至90分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果使用1×106個(gè)細(xì)胞/ml，則在30至90分鐘內(nèi)、優(yōu)選30至50分鐘內(nèi)至少90％的細(xì)胞被染色。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果使用1×106個(gè)細(xì)胞/ml，則在30至90分鐘內(nèi)、優(yōu)選30至50分鐘內(nèi)至少95％的細(xì)胞被染色。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果使用1×106個(gè)細(xì)胞/ml，則在30至90分鐘內(nèi)、優(yōu)選30至50分鐘內(nèi)至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的細(xì)胞被染色。在一個(gè)實(shí)施方案中，將1×106個(gè)細(xì)胞/ml與5微摩爾或更少的光敏化合物一起孵育40分鐘以染色制劑中至少99％的細(xì)胞、并優(yōu)選所有細(xì)胞。染色后，包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基被擠出培養(yǎng)基代替，這導(dǎo)致通過(guò)從非活化細(xì)胞擠出光敏化合物而導(dǎo)致細(xì)胞的選擇性染色。因此，擠出培養(yǎng)基基本上不含光敏化合物，優(yōu)選不含光敏化合物。代替優(yōu)選通過(guò)使用分離方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。可以使用本領(lǐng)域已知的適合與細(xì)胞一起使用的任何分離方法，如離心、過(guò)濾和透析。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基在染色后通過(guò)離心細(xì)胞制劑而被擠出培養(yǎng)基代替以獲得沉淀物和上清液。在染色后含有細(xì)胞的沉淀物重新懸浮在優(yōu)選不含光敏化合物的擠出培養(yǎng)基中。通過(guò)擠出，可以除去任何殘留的、過(guò)量的或未結(jié)合的光敏化合物，通常是細(xì)胞外的光敏化合物。擠出培養(yǎng)基還可以包含一般的細(xì)胞培養(yǎng)成分，如血漿、血清或抗生素。在一個(gè)實(shí)施方案中，擠出培養(yǎng)基包含供體血漿?？梢允褂玫暮线m的擠出培養(yǎng)基組合物是不含慶大霉素且不含酚紅(lonza,usa)的x-vivotm15培養(yǎng)基和10％(v/v)hi供體血漿。擠出可以在20℃至40℃范圍內(nèi)的溫度、優(yōu)選在25至38℃范圍內(nèi)的溫度、更優(yōu)選在36.5至37.5℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。co2濃度合適地為約5％，即4.5％至5.5％。在一個(gè)實(shí)施方案中，擠出在36.5至37.5℃范圍內(nèi)的溫度和約5％的co2濃度下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以方便的體積進(jìn)行擠出，所述體積易于處理，并且比現(xiàn)有技術(shù)方法中的小。因此，擠出體積在330至600ml的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，擠出體積最大為500ml，例如330-500ml。優(yōu)選地，擠出體積最大為450ml，例如，330-400ml。這樣的體積促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化，因?yàn)樗屑?xì)胞可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中、相同時(shí)間和相同條件下進(jìn)行處理，而不必在可能稍微不同的條件下進(jìn)行若干輪實(shí)驗(yàn)。擠出相中的細(xì)胞濃度通常高于染色相中的細(xì)胞濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，染色相中細(xì)胞濃度與擠出中的細(xì)胞濃度的比例等于至少1:2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，染色相中細(xì)胞濃度與擠出中的細(xì)胞濃度的比例等于至少1:3。擠出相中的細(xì)胞濃度比染色相中的高，這允許重要的培養(yǎng)基減少，用相同的裝置處理更多的細(xì)胞，并且促進(jìn)可擴(kuò)展性。將細(xì)胞制劑在擠出培養(yǎng)基中孵育長(zhǎng)達(dá)必要時(shí)間以除去任何殘留的、過(guò)量的或未結(jié)合的、通常為細(xì)胞外的光敏化合物。這通常需要60到100分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，將至少1×106個(gè)細(xì)胞/ml在總體積最大為600ml，例如330-600ml，或最大為500ml、優(yōu)選最大為400ml，例如330-400ml的擠出培養(yǎng)基中孵育60至90分鐘、優(yōu)選80至90分鐘，有效擠出任何殘留的、過(guò)量的或未結(jié)合的，通常為細(xì)胞外的光敏化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將至少2×106個(gè)細(xì)胞/ml在總體積最大為500ml，例如330-500ml，優(yōu)選330-400ml的擠出培養(yǎng)基中孵育60至90分鐘、優(yōu)選80至90分鐘，有效擠出任何殘留的、過(guò)量的或未結(jié)合的，通常為細(xì)胞外的光敏化合物。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，將至少3×106個(gè)細(xì)胞/ml在總體積最大為600ml或最大為500ml，例如330-500ml，優(yōu)選最大為400ml的擠出培養(yǎng)基中孵育60至90分鐘、優(yōu)選80至90分鐘，有效擠出任何殘留的、過(guò)量的或未結(jié)合的，通常為細(xì)胞外的光敏化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將用5微摩爾光敏化合物染色后的2×106個(gè)細(xì)胞/ml在最大為400ml，例如330-400ml的擠出培養(yǎng)基中擠出。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將用5微摩爾光敏化合物染色后的3×106個(gè)細(xì)胞/ml在最大為400ml，例如330-400ml的擠出培養(yǎng)基中擠出。如果從非活化細(xì)胞比從活化的細(xì)胞擠出更多的染料，那么擠出是有效的，導(dǎo)致活化的與非活化的細(xì)胞中的染料濃度不同。擠出后，照射擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞以選擇性殺傷保留光敏化合物的細(xì)胞。用于光動(dòng)力學(xué)處理的光優(yōu)選通過(guò)提供跨越大表面的均勻光傳輸?shù)恼丈溲b置來(lái)傳輸。細(xì)胞優(yōu)選以使得細(xì)胞最佳暴露于來(lái)自照射裝置的光的方式放置。因此，細(xì)胞優(yōu)選以薄層或作為薄層來(lái)呈現(xiàn)。細(xì)胞薄層優(yōu)選為20mm或更小、更優(yōu)選為15mm或更小或10mm或更小、最優(yōu)選為5mm或更小、4.5mm或更小、3mm或更小、3.5mm或更小或3.0mm或更小。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞薄層在1.0mm和20mm之間、在1.0mm和15mm之間、在1.0mm和10mm之間或在1.0mm和5mm之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞薄層在1.0mm和4.5mm之間、在1.0mm和4.0mm之間、在1.0mm和3.5mm之間、在1mm和3mm之間、在1mm和2.5mm之間或在1和2mm之間。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞薄層在2.0mm和4.5mm之間、在2.0mm和4.0mm之間、在2.0mm和3.5mm之間。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞薄層在2.5mm和4.5mm之間、在2.5mm和4.0mm之間、在2.5mm和3.5mm之間或在2.5mm和3mm之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以以若干種方式實(shí)現(xiàn)均勻光傳輸和細(xì)胞對(duì)光的最佳暴露。在一個(gè)實(shí)施方案中，這通過(guò)使用在細(xì)胞處于薄層時(shí)掃描細(xì)胞的照射裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這通過(guò)使用掃描照射裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述掃描照射裝置在兩個(gè)相反的方向上移動(dòng)，并且當(dāng)細(xì)胞處于薄層時(shí)照射細(xì)胞。合適的裝置的一個(gè)實(shí)例是掃描照射裝置，其可以在兩個(gè)相反的方向上移動(dòng)，并且當(dāng)細(xì)胞處于薄層時(shí)，可以從下方照射包含光敏化合物的細(xì)胞。薄層可例如通過(guò)將細(xì)胞放置于平坦的位置來(lái)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，由掃描裝置覆蓋的區(qū)域優(yōu)選地為1200-1800cm2，例如約40×40cm或36×34cm。合適的照射裝置描述在wo98/03224中，或者是theraluxtm照射裝置(kiadiaspharma,canada)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輕輕搖動(dòng)包含光敏化合物的細(xì)胞薄層。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含光敏化合物的細(xì)胞薄層是靜止的或靜態(tài)的，即不移動(dòng)。當(dāng)4～5j/cm2范圍內(nèi)的能量劑量傳輸?shù)綌D出培養(yǎng)基中的細(xì)胞時(shí)，停止光動(dòng)力學(xué)處理。在將4至5j/cm2傳輸?shù)綌D出培養(yǎng)基中的細(xì)胞之前，它將取決于光源需要多長(zhǎng)時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了向擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑傳輸5j/cm2，持續(xù)曝光35至45分鐘。曝光后，收集細(xì)胞并離心以除去擠出培養(yǎng)基。在根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法中使用的光是具有可見(jiàn)波長(zhǎng)的波長(zhǎng)的電磁輻射。電磁輻射具有在400至700nm范圍內(nèi)的波長(zhǎng)，優(yōu)選在綠光譜中，即在500至580nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在510至550nm的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在510至520nm的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用波長(zhǎng)在512至514nm范圍內(nèi)的電磁輻射來(lái)激活光敏化合物以產(chǎn)生細(xì)胞毒性產(chǎn)物，如細(xì)胞毒性單線態(tài)氧。暴露于光可以以任何合適的方式，并且可以是體內(nèi)的或離體的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，暴露于光是離體的。在根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)處理方法中，尤其是在擠出和照射期間，可以在相同時(shí)間和相同條件下處理的細(xì)胞總數(shù)為1.5億個(gè)細(xì)胞至1.8×109個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在同一時(shí)間和相同條件下處理至少1×108個(gè)細(xì)胞或至少1×109個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在同一時(shí)間和相同條件下處理1.2×109個(gè)細(xì)胞。這比現(xiàn)有技術(shù)方法所可能的更高。這些細(xì)胞可以以至少1×106個(gè)細(xì)胞/ml或至少2×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞以至少3×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度存在。因此，涉及的體積易于處理。如果至少80％保留光敏化合物的細(xì)胞被殺傷，則光動(dòng)力學(xué)處理是有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少85％保留光敏化合物的細(xì)胞被殺傷。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的保留光敏化合物的細(xì)胞被殺傷。優(yōu)選地，保留光敏化合物的所有細(xì)胞被殺傷。與使用10微摩爾光敏化合物的參考方法可獲得的細(xì)胞產(chǎn)物相比，使用根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法獲得的細(xì)胞產(chǎn)物在相關(guān)特征方面得到改善。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法獲得的細(xì)胞產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞產(chǎn)物是癌細(xì)胞被消耗的細(xì)胞群，尤其是癌細(xì)胞耗盡的細(xì)胞群，由此將細(xì)胞群移植到受體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞產(chǎn)物是耗盡受體應(yīng)答性t淋巴細(xì)胞的宿主-受體淋巴細(xì)胞制劑。如果起始細(xì)胞制劑是通過(guò)單向mlr獲得的來(lái)自健康供體的淋巴細(xì)胞和來(lái)自受體的非增殖性淋巴細(xì)胞的供體和受體細(xì)胞的mlr混合物，其中一些供體細(xì)胞由于供體和受體是不相同的hla單倍型而被激活，并且供體細(xì)胞被受體細(xì)胞上錯(cuò)配的hla抗原激活，則這類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)物可例如在同種異體移植的情況下獲得。這樣的細(xì)胞產(chǎn)物也可以稱(chēng)為選擇性耗盡同種異體反應(yīng)性t細(xì)胞的富含t細(xì)胞的供體淋巴細(xì)胞制劑。與通過(guò)使用10微摩爾光敏化合物的參考方法制備的細(xì)胞制劑相比，這樣的細(xì)胞產(chǎn)物在wbc回收率、wbc活力、活的t細(xì)胞含量、冷凍和解凍后2天t細(xì)胞存活或增殖中的一種或多種方面得到改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，與通過(guò)使用10微摩爾光敏化合物的參考方法制備的細(xì)胞制劑相比，通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法制備的受體應(yīng)答性t淋巴細(xì)胞耗盡的淋巴細(xì)胞制劑在wbc回收率、wbc活力、活的t細(xì)胞含量、冷凍和解凍后2天t細(xì)胞存活或增殖方面有所改善。合適的光敏化合物包括羅丹明和羅丹明衍生物，尤其是二溴羅丹明衍生物，如2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸甲酯(也稱(chēng)為4,5-二溴羅丹明123甲酯，也稱(chēng)為th9402)的鹽。用于光動(dòng)力學(xué)方法的其它合適的光敏化合物如上所述。改善的wbc回收率反映為較高百分比的wbc被回收，冷凍前的wbc濃度為100％。改善的wbc活力反映為細(xì)胞產(chǎn)物中以細(xì)胞/ml計(jì)的較高的活性wbc濃度。改善的活的t細(xì)胞含量反映為細(xì)胞產(chǎn)物中以細(xì)胞/ml計(jì)的較高的活的t淋巴細(xì)胞濃度。改善的2天t細(xì)胞存活反映解凍后2天，在細(xì)胞產(chǎn)物中較高百分比的t淋巴細(xì)胞是活的，解凍后以細(xì)胞/ml計(jì)的活的t細(xì)胞濃度為100％。改善的增殖分布反映在對(duì)自體細(xì)胞相似或較低的增殖中，連同對(duì)受體細(xì)胞的相似或較低的增殖或?qū)Φ谌?3rdparty)細(xì)胞相似或較高的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，改善的增殖分布反映在對(duì)自體細(xì)胞的相似增殖中，連同對(duì)受體細(xì)胞的相似增殖以及對(duì)第三方細(xì)胞的較高增殖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改善的增殖分布反映對(duì)自體細(xì)胞的較低增殖和對(duì)受體細(xì)胞的較低增殖以及對(duì)第三方細(xì)胞的較高增殖。通過(guò)本發(fā)明的方法可獲得的改善的細(xì)胞產(chǎn)物可用于預(yù)防或治療癌癥的方法中或用于預(yù)防或治療移植物抗宿主病的方法中。優(yōu)選地，其被配制用于藥物用途。它可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的形式來(lái)配制。在一個(gè)實(shí)施方案中，其被配制為液體，優(yōu)選作為液體通過(guò)輸注用于單劑量給藥。獲得的細(xì)胞產(chǎn)物的增殖分布可以在增殖試驗(yàn)中測(cè)定?？梢允褂萌魏魏线m的增殖試驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用負(fù)載有羧基熒光素雙乙酸琥珀酰亞胺酯(cfse)的細(xì)胞進(jìn)行增殖試驗(yàn)，其中在具有10％(v/v)合并的人類(lèi)熱滅活血漿的x-vivotm15培養(yǎng)基中存在1iu/ml人白介素-2的情況下，通過(guò)加入不同的增殖誘導(dǎo)刺激物5天來(lái)引發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)物?？梢允褂胢odfitlttm軟件分析細(xì)胞的增殖(即cfse的稀釋)，該軟件測(cè)回增殖指數(shù)(pi)，其在測(cè)定過(guò)程中反映細(xì)胞數(shù)量的增加。pi為1.0表示沒(méi)有增殖。合適的增殖誘導(dǎo)刺激物依賴(lài)于待耗盡的細(xì)胞，但可包括：1.輻照的自體供體細(xì)胞，以通過(guò)添加可提供“飼養(yǎng)效應(yīng)”的細(xì)胞來(lái)確定基線增殖。飼養(yǎng)細(xì)胞釋放營(yíng)養(yǎng)物并提供基質(zhì)支持；2.輻照的受體細(xì)胞，以確定對(duì)受體的(保留的)反應(yīng)性，所述反應(yīng)性優(yōu)選不存在或接近基線；3.輻照的第三方細(xì)胞，以確定對(duì)不相關(guān)的hla抗原的(保留的)反應(yīng)性，所述反應(yīng)性優(yōu)選保留，并且以任何方式至少兩倍于對(duì)受體的保留的反應(yīng)性，如上文2中所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，該比例為至少3或至少4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其在4和5之間?；畹膚bc濃度可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，例如通過(guò)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，例如通過(guò)將與0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液混合3-30分鐘的適當(dāng)稀釋的細(xì)胞制劑應(yīng)用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，并通過(guò)分別確定臺(tái)盼藍(lán)陰性細(xì)胞和臺(tái)盼藍(lán)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量來(lái)顯微計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和非活細(xì)胞數(shù)?？商娲兀梢酝ㄟ^(guò)流式細(xì)胞術(shù)、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或遵循制造商的說(shuō)明書(shū)的其他方法來(lái)確定活的wbc濃度。細(xì)胞產(chǎn)物中活的t細(xì)胞的濃度可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定wbc部分中活的t細(xì)胞的比例來(lái)計(jì)算。這可以通過(guò)在補(bǔ)充有1iu/ml重組人白介素-2的血漿中以3×106/ml的活的wbc濃度引發(fā)三份培養(yǎng)物來(lái)計(jì)算。培養(yǎng)開(kāi)始后24小時(shí)時(shí)，使用血液分析儀、例如通過(guò)使用microses60(horibaltd.，日本)或任何其它血液分析儀測(cè)定wbc濃度，且活的t細(xì)胞百分比在具有合適的抗體組(panel)的部分中通過(guò)細(xì)胞染色來(lái)測(cè)定。合適的抗體組可包括抗-cd3、抗-cd45和7-氨基放線菌素d(7aad)，分別用于t細(xì)胞、白細(xì)胞的檢測(cè)和用于非活細(xì)胞的排除。可以通過(guò)分析cd45陽(yáng)性細(xì)胞中cd3陽(yáng)性但7aad陰性細(xì)胞的百分比來(lái)測(cè)定活的t細(xì)胞的百分比。通過(guò)使用血液分析儀測(cè)定的wbc濃度乘以該t細(xì)胞的百分比將得到以細(xì)胞/ml計(jì)的活的t細(xì)胞濃度。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法在治療方法中的用途。上述用于光動(dòng)力學(xué)方法的所有實(shí)施方案也適用于該方面。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法在通過(guò)特異性消除由受體細(xì)胞激活的供體細(xì)胞來(lái)減少或預(yù)防移植物抗宿主病，尤其是與同種異體干細(xì)胞移植相關(guān)的移植物抗宿主病的方法中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法用于減少或預(yù)防移植物抗宿主病的方法中，其包括離體步驟：(i)通過(guò)將來(lái)自健康供體的供體細(xì)胞與來(lái)自患者的非增殖性受體細(xì)胞混合足以激活供體細(xì)胞的一段時(shí)間，來(lái)激活來(lái)自供體的淋巴細(xì)胞，(ii)采用使用5微摩爾或更少的光敏化合物的光動(dòng)力學(xué)療法選擇性殺傷步驟(i)的激活的淋巴細(xì)胞，和(iii)將(ii)中獲得的混合物輸注入患者中。淋巴細(xì)胞優(yōu)選為t淋巴細(xì)胞。這種輸注通常在干細(xì)胞移植后4-5周給予患者，以向患者快速提供成熟的t淋巴細(xì)胞，否則將花費(fèi)數(shù)月的時(shí)間才能形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法在殺傷還包含非癌細(xì)胞的細(xì)胞群內(nèi)、尤其是在待移植到受體的細(xì)胞群內(nèi)的癌細(xì)胞的方法中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法用于殺傷骨髓中、尤其是用于自體干細(xì)胞移植的骨髓中的癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法用于治療癌癥患者的方法中，其包括離體步驟：(i)采集患者骨髓；(ii)采用使用5微摩爾或更少的光敏化合物的光動(dòng)力學(xué)療法選擇性殺傷患者骨髓中的癌細(xì)胞，和(iii)使用(ii)的經(jīng)處理的骨髓進(jìn)行自體干細(xì)胞移植。在另一方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)物和藥物載體的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物用于預(yù)防或治療癌癥的方法中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物用于預(yù)防或治療急性移植物抗宿主病的方法中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是用于預(yù)防或治療慢性移植物抗宿主病的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及用于細(xì)胞離體處理的方法，其中所述方法包括激活來(lái)自供體的淋巴細(xì)胞的離體步驟，其通過(guò)(i)將含有來(lái)自健康供體的供體細(xì)胞的淋巴細(xì)胞與來(lái)自患者的非增殖性受體細(xì)胞混合足以激活供體細(xì)胞的一段時(shí)間，(ii)采用使用5微摩爾或更少的光敏化合物的光動(dòng)力學(xué)療法選擇性殺傷步驟(i)中激活的淋巴細(xì)胞，和(iii)將在(ii)中獲得的混合物輸注入患者。優(yōu)選地，(ii)中的選擇性殺傷包括在擠出培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞，其導(dǎo)致對(duì)活化的供體淋巴細(xì)胞的選擇性染色。淋巴細(xì)胞優(yōu)選為t淋巴細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及用于細(xì)胞離體處理的方法，其中該方法包括如下離體步驟：(i)在包含5微摩爾或更少的光敏化合物的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞制劑；(ii)用擠出培養(yǎng)基代替(i)的培養(yǎng)基以除去光敏化合物，和(iii)照射擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞制劑以選擇性殺傷保留光敏化合物的那些細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及適用于根據(jù)本發(fā)明的工序或方法的試劑盒，其中所述試劑盒包含(i)光敏化合物，其以5微摩爾或更低濃度用于通過(guò)照射離體處理細(xì)胞和(ii)擠出培養(yǎng)基，其用于除去導(dǎo)致細(xì)胞選擇性染色的光敏化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含照射裝置。合適的擠出培養(yǎng)基已經(jīng)如上在本發(fā)明的其它方面進(jìn)行了描述，并用于除去導(dǎo)致細(xì)胞選擇性染色的任何殘留的、過(guò)量的或未結(jié)合的，通常為細(xì)胞外的光敏化合物。優(yōu)選地，擠出培養(yǎng)基基本上不含光敏化合物。更優(yōu)選地，擠出培養(yǎng)基不含光敏化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，光敏化合物是光敏羅丹明或羅丹明衍生物。合適的羅丹明和羅丹明衍生物已經(jīng)在上面提到，并尤其包括二溴羅丹明衍生物，如2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸甲酯(也稱(chēng)為4,5-二溴羅丹明123甲酯，也稱(chēng)為th9402)的鹽。上面針對(duì)本發(fā)明的一個(gè)方面提到的所有實(shí)施方案也適用于本發(fā)明的其它方面。實(shí)施例材料和方法混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)對(duì)于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)(gehealthcare，英國(guó))梯度密度離心分離來(lái)自供體和來(lái)自受體的單核細(xì)胞。接下來(lái)，將來(lái)自健康供體的單核細(xì)胞與γ輻照的來(lái)自受體的單核細(xì)胞混合。在含有50iu/ml外源性il-2(novartis，德國(guó))的mlr培養(yǎng)基(不含慶大霉素且不含酚紅(lonza,usa)的x-vivotm15培養(yǎng)基加2％熱滅活的(hi)供體血漿)中制備成含有1×106個(gè)活的供體白細(xì)胞/ml和1×106個(gè)活的受體白細(xì)胞/ml的本體的mlr混合物。將mlr細(xì)胞分配在tc-175培養(yǎng)燒瓶(sarstedt，德國(guó))中，每個(gè)燒瓶中接收70mlmlr懸液。將燒瓶在37℃、5％co2、靜置條件下孵育4天。染色四天后，將mlr后細(xì)胞離心。將所得沉淀物合并并重懸浮于不含慶大霉素且不含酚紅(lonza,usa)的x-vivotm15培養(yǎng)基和2.5％hi供體血漿(染色培養(yǎng)基)中。通過(guò)血液分析儀(horibaltd.日本)與手工臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)(0.4％臺(tái)盼藍(lán)；sigmaaldrich，英國(guó)；用臺(tái)盼藍(lán)混合細(xì)胞最少3分鐘，最長(zhǎng)30分鐘)測(cè)定該細(xì)胞懸液中活的白細(xì)胞(wbc)濃度。將mlr后細(xì)胞混合物在染色培養(yǎng)基中稀釋至活的wbc濃度為1.11×106個(gè)細(xì)胞/ml。接下來(lái)，在染色培養(yǎng)基中將具有1.11×106個(gè)細(xì)胞/ml的活的白細(xì)胞濃度的該稀釋的mlr混合物與二溴羅丹明衍生物th9402(kiadispharma，荷蘭)(其為2-(4,5-二溴-6-氨基-3-亞氨基-3h-呫噸-9-基)-苯甲酸甲酯)以1:10的比例混合，得到含有不含慶大霉素且不含酚紅(lonza,usa)的x-vivotm15培養(yǎng)基、2.5％hi供體血漿、1.0×106個(gè)活的wbc/ml和以所需濃度的th9402的染色混合物。將該染色混合物在37℃、5％co2的條件下在tc-175(sarstedt，德國(guó))燒瓶中靜置孵育。染色40分鐘后，收集細(xì)胞并離心除去含th9402的培養(yǎng)基。擠出接下來(lái)，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于擠出培養(yǎng)基(不含慶大霉素、不含酚紅(lonza,usa)的x-vivotm15培養(yǎng)基和10％hi供體血漿)中，達(dá)到期望的最終活的wbc濃度，基于對(duì)合并的mlr后細(xì)胞所進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)。將擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到tc-175燒瓶(bectondickinson,usa)中，每燒瓶10或50ml，并在37℃、5％co2的平坦位置靜置孵育。擠出90分鐘后，將含有擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞的燒瓶立即進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)治療。光動(dòng)力學(xué)處理(pdt)對(duì)于光動(dòng)力學(xué)處理，將含有擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞的燒瓶放置在用于光動(dòng)力學(xué)處理的照射裝置(theraluxtm裝置，kiadispharma，荷蘭)上，并排放置在平坦位置，并暴露于波長(zhǎng)為514nm(綠色光譜)的光，同時(shí)輕輕搖動(dòng)。當(dāng)裝置傳輸5j/cm2的能量劑量時(shí)，停止處理，時(shí)間為35分鐘。曝光后，收集細(xì)胞并離心除去擠出培養(yǎng)基。pdt后洗滌細(xì)胞接下來(lái)，將細(xì)胞沉淀物合并入洗滌培養(yǎng)基(0.9％nacl(baxter，英國(guó))，10％供體血漿)中，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(facsversetm,bectondickinson,usa)測(cè)定總wbc群中活的t細(xì)胞百分比。第二次洗滌后，通過(guò)血液分析儀(microses60,horibaltd.日本)測(cè)定wbc濃度。從兩個(gè)測(cè)量(活的t細(xì)胞百分比和wbc濃度)計(jì)算出該部分中的活的t細(xì)胞濃度。儲(chǔ)存將來(lái)自pdt后細(xì)胞部分的相當(dāng)于7.5×106/ml的活的t細(xì)胞的體積離心，并將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于冷凍培養(yǎng)基a(含有20％供體hi血漿的鹽水)中。接下來(lái)，向冷凍培養(yǎng)基a細(xì)胞懸液加入等體積的預(yù)冷(2-8℃)的含dmso的培養(yǎng)基(冷凍培養(yǎng)基b：具有40％供體hi血漿和20％dmso的鹽水)，并將混合物分配到樣品瓶上。在可控速率冷凍機(jī)中使用標(biāo)準(zhǔn)pbmc冷凍程序?qū)悠菲苛⒓蠢鋬?。將樣品?chǔ)存在液體n2氣相中，直到進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，如增殖分布。wbc部分中活的t細(xì)胞百分比的測(cè)定通過(guò)在補(bǔ)充有1iu/ml重組人白介素-2的血漿中以3×106/ml的活的wbc濃度引發(fā)三份培養(yǎng)物來(lái)確定wbc部分中活的t細(xì)胞的比例。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(laboroptik，英國(guó))確定活的wbc濃度。培養(yǎng)開(kāi)始后24小時(shí)或48小時(shí)，使用血液分析儀(microses60,horibaltd.，日本)測(cè)定wbc濃度，并通過(guò)染色具有抗體組的部分中的細(xì)胞來(lái)測(cè)定活的t細(xì)胞的百分比，所述抗體組包括抗cd3(v500綴合的小鼠igg1、克隆ucht1，bectondickinson，usa)、cd45(v450綴合的小鼠igg1，克隆hi30，bectondickinson，usa)和7aad(bectondickinson，usa)，分別用于t細(xì)胞、白細(xì)胞以及活力的檢測(cè)和測(cè)定。通過(guò)分析cd45陽(yáng)性細(xì)胞中cd3陽(yáng)性但7aad陰性的細(xì)胞的百分比來(lái)確定活的t細(xì)胞的百分比。將通過(guò)使用血液分析儀測(cè)定的wbc濃度乘以該t細(xì)胞的百分比得到在wbc部分內(nèi)的活的t細(xì)胞的濃度。t細(xì)胞存活百分比的測(cè)定將樣品解凍后的活的t細(xì)胞濃度設(shè)定為100％。在培養(yǎng)48小時(shí)后測(cè)量的活的t細(xì)胞濃度直接除以解凍后的活的t細(xì)胞濃度并乘以100％，得到t細(xì)胞存活率(％)?；畹膚bc濃度的測(cè)定根據(jù)各自的制造商的說(shuō)明書(shū)，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(laboroptik，英國(guó))或使用血液分析儀(microses60,horibaltd.，日本)在冷凍前和解凍后測(cè)定活的wbc濃度。細(xì)胞產(chǎn)物中活的t細(xì)胞濃度的計(jì)算通過(guò)將wbc部分中的活的t細(xì)胞的百分比乘以活的wbc濃度來(lái)計(jì)算樣品的活的t細(xì)胞濃度。wbc回收率的測(cè)定將樣品解凍后的wbc濃度除以樣品冷凍前的wbc濃度并乘以100％，得到wbc回收率(％)。對(duì)比實(shí)施例1在mlr培養(yǎng)基中用1×106個(gè)活的供體白細(xì)胞/ml和1×106個(gè)活的受體白細(xì)胞/ml進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。將mlr細(xì)胞分配在tc-175培養(yǎng)燒瓶(sarstedt，德國(guó))中，每瓶接受70mlmlr懸液。將燒瓶在37℃、5％co2條件下靜置孵育4天，然后收集來(lái)自tc-175燒瓶中的內(nèi)含物并離心。將沉淀物重新懸浮于染色培養(yǎng)基中，活的wbc濃度為1.11×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在染色培養(yǎng)基中與100μmth9402混合，得到包含100μmth9402和1.0×106個(gè)活的wbc/ml的染色混合物。將該染色混合物在37℃、5％co2下在tc-175(sarstedt，德國(guó))燒瓶中靜置孵育。染色40分鐘后，采集細(xì)胞并離心以除去含th9402的培養(yǎng)基。接下來(lái)，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于擠出培養(yǎng)基中，以在總體積為1200ml(每個(gè)燒瓶10ml)中達(dá)到最終活的wbc濃度為1×106個(gè)/ml。為了處理所有的1.2×109個(gè)細(xì)胞，需要120個(gè)燒瓶。由于使用的照射裝置(theraluxtm,kiadispharma，荷蘭)可以容納10個(gè)各自含有10ml細(xì)胞的燒瓶，需要三個(gè)裝置和四輪處理以處理所有細(xì)胞。擠出90分鐘后，使用位于平坦位置的theraluxtmpdt裝置(kiadispharma，荷蘭)將含有擠出培養(yǎng)基中的細(xì)胞的燒瓶立即在514nm處進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)治療。在35分鐘內(nèi)傳輸5j/cm2的總能量。曝光后，收集細(xì)胞并離心以除去擠出培養(yǎng)基。在第一次洗滌后，如上所述在facsversetm(bectondickinson,usa)上通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定總wbc群中活的t細(xì)胞的百分比。第二次洗滌后，使用血液分析儀(microses60,horibaltd.，日本)測(cè)定wbc的濃度，并計(jì)算產(chǎn)物中的活的t細(xì)胞濃度。結(jié)果總結(jié)在表1中。對(duì)比實(shí)施例2為了減少在擠出相中待處理的體積，如實(shí)施例1中所述，在mlr培養(yǎng)基中進(jìn)行1×106個(gè)活的供體白細(xì)胞/ml和1×106個(gè)活的受體白細(xì)胞/ml的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。然后是如實(shí)施例1中所述的染色步驟。但是，將染色后的細(xì)胞沉淀物重新懸浮于擠出培養(yǎng)基中至最終活的wbc濃度，其為實(shí)施例1濃度的三倍，即3×106個(gè)/ml，并使用較大的燒瓶(每個(gè)燒瓶50ml)。待處理的總體積為400ml?，F(xiàn)在，為了處理所有的1.2×109個(gè)細(xì)胞，只需要八個(gè)燒瓶。擠出90分鐘后，按實(shí)施例1處理細(xì)胞，測(cè)定wbc的濃度，并計(jì)算產(chǎn)物中的活的t細(xì)胞濃度。為了臨床目的具有價(jià)值，重要的是產(chǎn)物中活的t細(xì)胞的濃度將與實(shí)施例1相似。然而，表1中總結(jié)的結(jié)果表明，減少體積影響該產(chǎn)物的質(zhì)量。產(chǎn)物中活的t細(xì)胞的濃度顯著降低，這使得它不適合最終的產(chǎn)物劑量制劑。實(shí)施例3在根據(jù)本發(fā)明的條件下的實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)施例1所述，在mlr培養(yǎng)基中進(jìn)行1×106個(gè)活的供體白細(xì)胞/ml和1×106個(gè)活的受體白細(xì)胞/ml的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。在37℃、5％co2下四天后，收集來(lái)自tc-175燒瓶的內(nèi)含物并離心。將沉淀物重新懸浮于染色培養(yǎng)基中，活的wbc濃度為1.11×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在染色培養(yǎng)基中與50μm、而不是100μm的th9402混合，得到含有5μmth9402和1.0x106個(gè)活的wbc/ml的染色混合物。將該染色混合物在37℃、5％co2下在tc-175(sarstedt，德國(guó))燒瓶中靜置孵育。染色40分鐘后，收集細(xì)胞并離心以除去含th9402的培養(yǎng)基。接下來(lái)，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于擠出培養(yǎng)基中，在總體積為400ml(每個(gè)燒瓶為50ml)中達(dá)到最終的活的wbc濃度為3×106個(gè)/ml。為了處理所有的1.2×109個(gè)細(xì)胞，只需要八個(gè)燒瓶。擠出90分鐘后，如實(shí)施例1所述處理細(xì)胞。測(cè)定wbc的濃度并計(jì)算產(chǎn)物中的活的t細(xì)胞濃度。表1在實(shí)驗(yàn)條件下獲得的活的t細(xì)胞的分?jǐn)?shù)和濃度通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞產(chǎn)物的特征，如活的t細(xì)胞濃度，呈現(xiàn)在表1中。令人驚奇的是，使用較少的光敏化合物允許更多的細(xì)胞在同一時(shí)間和在同樣條件下被處理。它允許減少體積，同時(shí)保持活的t細(xì)胞的濃度，其與實(shí)施例1中獲得的參考產(chǎn)物相當(dāng)，并且其適用于最終產(chǎn)物劑量制劑(1×106/ml；10μm)。這意味著使用較少的光敏化合物允許使用更小的體積，但會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。將細(xì)胞產(chǎn)物冷凍儲(chǔ)存直至進(jìn)行增殖分布測(cè)量。實(shí)施例4獲得的產(chǎn)物的增殖分布在本實(shí)施例中，將通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法獲得的產(chǎn)物的增殖特征與實(shí)施例1中獲得的參考產(chǎn)物的增殖特征進(jìn)行比較。將實(shí)施例3中制備的細(xì)胞產(chǎn)物解凍并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定活的wbc濃度。然后，細(xì)胞懸液以2×106/ml的固定的wbc濃度用1μm羧基熒光素雙乙酸琥珀酰亞胺酯(cfse,molecularprobes,usa)負(fù)載。對(duì)比實(shí)施例1中制備的細(xì)胞產(chǎn)物用作參考。在具有10％合并的人熱滅活的血漿的x-vivotm15培養(yǎng)基中在存在1iu/ml人白介素-2的情況下通過(guò)加入3種不同的增殖誘導(dǎo)刺激物5天來(lái)引發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)物。三種增殖誘導(dǎo)刺激物是：1.輻照的自體供體細(xì)胞，以通過(guò)添加可提供“飼養(yǎng)效應(yīng)”的細(xì)胞來(lái)確定基線增殖。2.輻照的受體細(xì)胞，以確定對(duì)受體的(保留的)反應(yīng)性，所述受體與gvhd相關(guān)；3.輻照的第三方細(xì)胞，以確定對(duì)不相關(guān)的hla抗原的(保留的)反應(yīng)性。使用modfitlttm軟件分析細(xì)胞的增殖(即cfse的稀釋)，其測(cè)回在測(cè)定過(guò)程中反映細(xì)胞數(shù)量增加的增殖指數(shù)(pi)；pi為1.0表示沒(méi)有增殖。已知最初的方法產(chǎn)生對(duì)受體細(xì)胞展現(xiàn)增殖指數(shù)(pi)的產(chǎn)物，用所述受體細(xì)胞，供體細(xì)胞在接近基線條件的制造過(guò)程中被刺激(即用自體供體細(xì)胞刺激)。然而，對(duì)第三方細(xì)胞的pi應(yīng)該是清楚地可檢測(cè)的。結(jié)果顯示在表2中。如表2所示，與實(shí)施例1中獲得的參考產(chǎn)物相比，根據(jù)本發(fā)明的光動(dòng)力學(xué)方法產(chǎn)生了對(duì)第三方細(xì)胞解凍后增殖指數(shù)改善的產(chǎn)物。表2在實(shí)驗(yàn)條件下獲得的增殖指數(shù)實(shí)施例5冷凍和解凍后的產(chǎn)物特征在單獨(dú)的一組實(shí)驗(yàn)中，將根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)物的特征與使用根據(jù)實(shí)施例1的方法獲得的參考產(chǎn)物在解凍后wbc回收率、wbc活力、活的t細(xì)胞含量、2天t細(xì)胞存活和增殖方面進(jìn)行比較。將來(lái)自兩種方法的樣品冷凍并解凍后分析wbc回收率、wbc活力、活的t細(xì)胞含量、2天t細(xì)胞存活和增殖。具有相同來(lái)源材料的三次實(shí)驗(yàn)的平均值示于表3中。表3解凍后細(xì)胞產(chǎn)物特征(三次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)參考產(chǎn)物發(fā)明細(xì)胞產(chǎn)物wbc回收率(％)43.0±4.053.7±2.1wbc活力(細(xì)胞/ml)54.2±13.557.8±14.4活的t細(xì)胞含量(％)46.9±11.150.5±10.42天t細(xì)胞存活(％)43.3±12.752.8±11.4自體增殖(pi)1.07±0.031.05±0.01受體增殖(pi)1.11±0.051.09±0.03第三方增殖(pi)1.41±0.111.50±0.16令人驚奇的是，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生了與參考產(chǎn)物相比得到改進(jìn)的產(chǎn)物。解凍后更多的wbc被回收，具有更高的活力和更高的活的t細(xì)胞含量，表明根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)物的解凍后劑量含有更高濃度的活性成分。另外，2天的t細(xì)胞存活更高，表明根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)物中的活性成分在體內(nèi)將持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。最后，本發(fā)明后的產(chǎn)物的增殖特征表現(xiàn)出優(yōu)異的模式：對(duì)自體細(xì)胞的增殖較低、對(duì)受體細(xì)胞的增殖較低并對(duì)第三方細(xì)胞的增殖更高。因此，本發(fā)明的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物更好地耗盡不想要的受體反應(yīng)性細(xì)胞，但是對(duì)不相關(guān)的第三方抗原保留更多的反應(yīng)性?？傊景l(fā)明的方法產(chǎn)生具有更長(zhǎng)持久性細(xì)胞的更有活力的產(chǎn)物，所述持久性細(xì)胞具有優(yōu)異的增殖能力。當(dāng)前第1頁(yè)12