本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類細胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細胞色素p450(cytochromep450,p450)酶，又稱混合功能氧化酶或微粒體單加氧酶，是機體內(nèi)最重要的藥物代謝酶。p450參與了人體膽固醇，激素，脂肪酸，維生素等內(nèi)源性物質(zhì)的合成和代謝，對維持人體正常生理功能起到重要作用，同時也參與了多數(shù)外來物的生物轉(zhuǎn)化，大約70％的藥物(包括絕大部分臨床藥物和殺蟲劑)的主要清除是由p450介導(dǎo)的。細胞色素p450酶催化的i相反應(yīng)是化合物在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵步驟，因為這一步反應(yīng)通常是藥物從體內(nèi)清除的限速步驟，可影響化合物的半衰期、清除率等動力學特征，且p450酶活性常隨遺傳因素、年齡、疾病狀態(tài)或其它藥物相互作用的影響而發(fā)生改變。藥物對機體p450酶的影響，能造成臨床上顯著的藥物相互作用。
cyp1a1是重要的i相代謝酶，主要在人肝外組織中表達，例如人肺、皮膚、小腸中表達。cyp1a1參與多種環(huán)境毒素和內(nèi)源性底物的代謝，并在多種前致癌物被激活成具有遺傳毒性中間體或最終致癌物的過程中起到了重要作用,例如在一定程度上激活咖啡因誘使肝硬化的發(fā)生(molaspectsmed.1999.20：1‐137)。除此之外，cyp1a1的分布存在很大的個體差異，cyp1a1酶的表達受遺傳、年齡、疾病、性別、環(huán)境和共服藥物等多種因素的影響。因此，cyp1a1在不同個體中的肝臟含量也有很大差別，其含量范圍分別為：cyp1a1:0‐3pmol/mg(pharmacology&therapeutics2013；138:103)。因此，開展cyp1a1酶活的個體差異研究對于臨床個性化安全用藥有著重要意義。目前國內(nèi)外制藥巨頭在藥物開 發(fā)過程中，需要在體外評估各候選新藥抑制cyp1a1的能力。因此，開發(fā)高效、靈敏的特異性cyp1a1探針底物對于高效篩選cyp1a1抑制劑，及定量測定生物體系內(nèi)cyp1a1的活性至關(guān)重要。
由于cyp1a1亞家族中的各亞型具有相似的氨基酸序列，其底物通常相互交疊，因此各亞型酶鮮有特異性的底物。目前，已報道的cyp1a1的熒光探針底物有3個，分別是乙氧基試鹵靈，熒光素-cee和熒光素-me-ege。這些已知的熒光底物均屬于off-on型探針，單酶選擇性并不高且易受生物基質(zhì)的干擾，定量誤差較大。而比率型探針發(fā)射光譜的藍移/紅移則可用于比率檢測，且此時探針分子原型可作為內(nèi)部校準來減小光照強度、探針濃度、樣品不均勻、儀器參數(shù)等對定量分析的影響。因此，開發(fā)高選擇性的cyp1a1比率型熒光探針反應(yīng)及其配套的高通量檢測方法具有重要的實用價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一類細胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針底物及其應(yīng)用，該熒光探針底物和去氯乙基化產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長具有明顯差異，且產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率更高更易檢測。利用該探針反應(yīng)可對多種生物體系中cyp1a1的分布和功能進行定量評價。
本發(fā)明提供了一類細胞色素氧化酶cyp1a1特異性的熒光探針，該探針可被cyp1a1特異性催化生成相應(yīng)的o-去氯乙基化產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)通式如式式(ⅰ)所示，該底物具有1,8-萘酰亞胺類結(jié)構(gòu)，
其中r為-ch3、苯基、-oh等基團中的一種，n為1～10。
一種cyp1a1特異性熒光探針的制備方法，該方法包括下列步驟：
步驟一：4-溴-1,8-萘二甲酸酐與氨基化合物在醇中反應(yīng)得到4-溴-1,8-萘酰亞胺；
步驟二：式(ⅲ)所示化合物與碳酸鉀在有機溶劑中反應(yīng)得到式(ⅱ)所示4-甲氧基-1,8-萘酰亞胺；
步驟三：在氬氣保護下，約200-500mg式(ⅱ)所示化合物與約5-20ml50-60％氫碘酸水溶液反應(yīng),120-130℃攪拌12-24h后，加大量水稀釋，過濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到式(ⅲ)所示4-羥基-1,8-萘酰亞胺；
步驟四：將約式(ⅲ)所示化合物與碘代氯乙烷，碳酸鉀，在乙腈中80-90℃反應(yīng)12h-24h后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，真空干燥得到式(ⅰ)所示化合物；
所述反應(yīng)中化合物ⅲ與碘代氯乙烷及碳酸鉀摩爾比例為1:1.25-1.75:1.5-2.5。
本發(fā)明還提供了所述細胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針的應(yīng)用，采用上述式(ⅰ)化合物作為cyp1a1亞酶的特異性底物，進行o-去氯乙基化結(jié)合反應(yīng)，通過定量檢測單位時間內(nèi)的底物消除率或其o-去氯乙基化產(chǎn)物的生成率來定量測定不同生物體系(包括重組表達cyp1a1單酶、人或動物組織制備液、各類組織細胞等生物體系)中cyp1a1的活性；具體測定方法為：
——體系中以1,8-萘酰亞胺類化合物作為比率型探針底物；底物濃度選擇1/10～10km；單點測定時底物濃度優(yōu)選km。
——在pbs緩沖液中，反應(yīng)溫度為20℃至60℃之間，優(yōu)選37℃為最優(yōu)反應(yīng)時間；孵育體系ph介于5.5～10.5之間，優(yōu)選ph7.4為最優(yōu)反應(yīng)ph值；
——反應(yīng)時間為5～60分鐘，確保以上底物相應(yīng)的o-去氯乙基化產(chǎn)物達到定量限且底物轉(zhuǎn)化率不超過20％時終止反應(yīng)；
——測定單位時間內(nèi)底物減少量或o-去氯乙基化產(chǎn)物生成量作為cyp1a1活性的評價指標。
該探針底物及其去氯乙基化產(chǎn)物的熒光信號需采用不同檢測波長去檢測，特異性底物的熒光檢測條件為：激發(fā)波長372nm，最大發(fā)射波長452nm；去氯乙基化產(chǎn)物的熒光檢測條件為：激發(fā)波長450nm最大發(fā)射波長分別為562nm。
一種細胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針的應(yīng)用，該探針底物還可用于cyp1a1抑制劑和誘導(dǎo)劑的快速篩選及抑制和誘導(dǎo)能力的定量評價。
一種細胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光底物的應(yīng)用，該探針底物還可用 于活細胞及活組織中cyp1a1功能的實時動態(tài)監(jiān)測。
本發(fā)明提供的細胞色素氧化酶cyp1a1特異性比率型熒光探針的應(yīng)用，該探針底物及其o-去氯乙基化產(chǎn)物均具有熒光屬性，且兩者具有不同的光學屬性，可采用熒光檢測器同時實現(xiàn)底物及產(chǎn)物的快速、靈敏檢測；o-去氯乙基化產(chǎn)物及底物熒光檢測條件分別為：激發(fā)波長372，450nm，最大發(fā)射波長為452，562nm(如圖3所示)。
該特異性探針底物為比率型熒光探針，其在cyp1a1活性檢測過程不易受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各種重組cyp1a1、人及動物組織制備液及各類組織細胞中cyp1a1酶活的定量測定；同時也可作為在體及動物整體cyp1a1的探針底物，評估代謝酶cyp1a1的個體及種屬差異。該探針底物及o-去氯乙基化代謝產(chǎn)物的熒光檢測方法還可用于cyp1a1誘導(dǎo)劑和抑制劑的快速篩選及誘導(dǎo)和抑制能力的定量評價。
采用重組細胞色素氧化酶cyp1a1單酶，肝微粒體孵育體系進行考察，通過相關(guān)性分析(如圖5所示)，重組單酶代謝反應(yīng)(如圖6所示)，以及酶反應(yīng)動力學幾方面的證據(jù)，證明1,8-萘酰亞胺類化合物可特異性的經(jīng)細胞色素氧化酶cyp1a1代謝，生成o-去氯乙基化氧化產(chǎn)物。進一步采用各種哺乳動物的新鮮提取的肝細胞﹑原代培養(yǎng)肝細胞、肝切片﹑肝灌流等代謝評價體系進行考察，發(fā)現(xiàn)該代謝反應(yīng)具有非常良好的特異性。
作為高特異性的細胞色素氧化酶cyp1a1單酶的熒光探針底物，該化合物可以用來檢測cyp1a1的活性，尤其適合用于對細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母菌克隆表達體系生產(chǎn)的cyp1a1的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、s-9等制備物中cyp1a1的活性標定。
本發(fā)明中1,8-萘酰亞胺類化合物具有代謝產(chǎn)物單一(僅生成一個o-去氯乙 基化產(chǎn)物)、代謝酶高選擇性(主要由cyp1a1代謝)、底物及代謝產(chǎn)物易于檢測且靈敏度高等特點。
選用本發(fā)明所述細胞色素氧化酶cyp1a1單酶的比率型熒光探針反應(yīng)檢細胞色素氧化酶cyp1a1單酶體外活性具有以下突出優(yōu)勢：
(1)高特異性：1,8-萘酰亞胺類化合物可被細胞色素氧化酶cyp1a1單酶高特異性地代謝成一個代謝產(chǎn)物，即o-去氯乙基化產(chǎn)物。
(2)廉價易得：1,8-萘酰亞胺類化合物可經(jīng)化學合成獲得，合成工藝簡單易行，熒光方法檢測成本低。(3)高靈敏度：具有1,8-萘酰亞胺母核結(jié)構(gòu)的化合物均具有良好的熒光發(fā)射光譜特性(450～700nm)，且該底物及其o-去氯乙基化代謝產(chǎn)物具有不同的熒光發(fā)射光譜特征，能較好的進行區(qū)分檢測，同時可通過比率型標準曲線的建立進行定量測定cyp1a1單酶的檢測下限為0.005nm/ml(熒光發(fā)射/激發(fā)光譜是由synergyh1全功能微孔板檢測儀或島津高效液相色譜-熒光檢測儀lc-fd-30a檢測完成完成)。
附圖說明
圖1.cyp1a1特異性探針底物的結(jié)構(gòu)通式；
圖2.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的1h-nmr譜圖；
圖3.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺及其o-去氯乙基化代謝產(chǎn)物的歸一化紫外吸收光譜圖(分別在372nm和450nm有最大吸收)；
圖4.12例hlm對n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的代謝圖；
圖5.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺及其o-去氯乙基化代謝速率與乙氧基試鹵靈的o-脫乙基代謝速率的相關(guān)性分析實驗；
圖6.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的人cyp重組單酶篩選試驗結(jié)果；
圖7.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成路線。
具體實施方式
下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。cyp1a1特異性探針底物的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。
實施例1.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成
(1)化合物n-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亞胺的合成
將4.2mmol正丁胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反應(yīng)過夜后，加入200ml水，析出大量固體，過濾，真空干燥得到米黃色固體n-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(2)化合物n-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將800mgn-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亞胺與2.54g碳酸鉀置于100ml單口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反應(yīng)過夜后，冷卻，析出大量黃色固體，過濾，大量水洗，真空干燥得到黃色固體n-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(3)n-正丁基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺的合成
將300mgn-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺置于25ml兩口瓶中，氬氣保護下加入10ml55-58％氫碘酸水溶液，120-130℃攪拌過夜后，加大量水稀釋，過濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到黃色固體，產(chǎn)率60-70％。
(4)化合物n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將1mmoln-正丁基-4-羥基-1，8-萘酰亞胺與1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸鉀置于50ml單口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反應(yīng)過夜后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，展開劑為乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(體積比)，真空干燥得到黃色固體n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率40-50％。n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成路線如圖7所示。
注：化合物1、2的結(jié)構(gòu)如圖7所示，且其1h-nmr譜圖如圖2所示，1h-nmr譜圖和13c-nmr譜圖是由核磁共振波譜儀(avanceii400mhz)檢測完成。
實施例2.n-乙基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成
(1)化合物n-乙基-4-溴-1，8-萘酰亞胺的合成
將4.2mmol乙胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反應(yīng)過夜后，加入200ml水，析出大量固體，過濾，真空干燥得到米黃色固體n-乙基-4-溴-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(2)化合物n-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將800mgn-乙基-4-溴-1，8-萘酰亞胺與2.54g碳酸鉀置于100ml單口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反應(yīng)過夜后，冷卻，析出大量黃色固體，過濾，大量水洗，真空干燥得到黃色固體n-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(3)n-乙基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺的合成
將300mgn-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺置于25ml兩口瓶中，氬氣保護下加入10ml55-58％氫碘酸水溶液，120-130℃攪拌過夜后，加大量水稀釋，過濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到黃色固體，產(chǎn)率60-70％。
(4)化合物n-乙基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將1mmoln-乙基-4-羥基-1，8-萘酰亞胺與1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸鉀置于50ml單口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反應(yīng)過夜后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，展開劑為乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(體積比)，真空干燥得到黃色固體n-乙基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率40-50％。
實施例3.n-己基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成
(1)化合物n-己基-4-溴-1，8-萘酰亞胺的合成
將4.2mmol己胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反應(yīng)過夜后，加入200ml水，析出大量固體，過濾，真空干燥得到米黃色固體n-己基-4-溴-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(2)化合物n-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將800mgn-己基-4-溴-1，8-萘酰亞胺與2.54g碳酸鉀置于100ml單口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反應(yīng)過夜后，冷卻，析出大量黃色固體，過濾，大量水洗，真空干燥得到黃色固體n-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(3)n-己基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺的合成
將300mgn-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺置于25ml兩口瓶中，氬氣保護下加入10ml55-58％氫碘酸水溶液，120-130℃攪拌過夜后，加大量水稀釋，過濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到黃色固體，產(chǎn)率60-70％。
(4)化合物n-己基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將1mmoln-己基-4-羥基-1，8-萘酰亞胺與1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸鉀置于50ml單口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反應(yīng)過夜后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，展開劑為乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(體積比)，真空干燥得到黃色固體n-己基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率40-50％。
實施例4.體外測定人重組cyp單酶的選擇性
(1)預(yù)先準備90μlcyp代謝反應(yīng)體系，包括ph7.4的pbs緩沖液(100mm)、重組人cyp各單酶(0.075nm/ml)，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺終濃度為10μm，于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；
(2)向反應(yīng)體系中加入10μl濃度為10mm的nadp+起始反應(yīng)；
(3)30分鐘后，加入100μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；
(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后， 取上清，進行熒光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)；重組人cyp1a1酶的選擇性最高約是其它單酶的10倍左右(圖6)。
實施例5.不同個體來源肝微粒體中cyp1a1的活性定量評估
(1)選取12例人肝微粒體(hlm)稀釋至2.5mg/ml，準備cyp1a1代謝反應(yīng)體系，包括ph7.4的pbs緩沖液(100mm)、人肝微粒體(0.25mg/ml)、nadp+10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1unit/ml，mgcl240mm，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺終濃度為10μm，于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；
(2)向反應(yīng)體系中加入20μl濃度為10mm的nadp+起始反應(yīng)；
(3)30分鐘后，加入200μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；
(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進行熒光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)，將所獲熒光強度代入標準曲線后得到12例人肝微粒體(hlm)對n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘酰亞胺的代謝速率(圖4)。
實施例6.體外測定cyp1a1的檢測下限測定
實驗在酶標儀上使用96孔板進行測定，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺10μm，nadp+10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1unit/ml，mgcl240mm，cyp1a1單酶0.0025nm/ml～0.2nm/ml，ph7.4的pbs緩沖液50mm，總體積為100μl，37℃下孵育1h后通過酶標儀分析，每組的平均值與不加cyp1a1的對照組比較，結(jié)果表明0.005nm/ml的cyp1a具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，因此確定cyp1a1的檢測下限為0.005nm/ml。
實施例7.cyp1a1酶濃度標準曲線測定
在酶標儀上使用96孔板進行測定，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺10 μm，nadp+10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1unit/ml，mgcl240mm，cyp1a1單酶0.01nm/ml～0.2nm/ml，ph7.4的pbs緩沖液50mm，總體積為100μl，37℃下孵育30min，酶標儀分析，產(chǎn)物的熒光強度比底物的熒光強度的比值與酶濃度做標準曲線，每條標準曲線的r2＞0.99，表明標準曲線線性范圍寬廣，可準確定量cyp1a1的含量。