本發(fā)明涉及干細(xì)胞分泌物，尤其是一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的灌腸液及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一組源于基質(zhì)的異質(zhì)細(xì)胞群，可以從人體大多數(shù)組織獲取。它們具有自我更新能力、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)能力，可以向中胚層譜系分化，例如：脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，此外還能夠向及其它胚層譜系細(xì)胞分化，例如向表皮細(xì)胞\血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中含有多種大量的活性成分，如：干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素(IL)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸等80余種活性物質(zhì)。目前，已經(jīng)有將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于腸炎、克隆氏病等腸道疾病的報(bào)道。但是由于活性細(xì)胞的存活條件比較苛刻，很容易死亡因此由活細(xì)胞所起的作用也會(huì)大打折扣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種活性穩(wěn)定的用于家庭小型寵物的含間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的灌腸液及其制備方法，利用干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子為治療各種急慢性腸炎的修復(fù)以及腸道清理提供了安全、有效、使用方便的治療藥物。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于家庭小型寵物的含間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的灌腸液的制備方法，包括以下步驟：

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)；

(2)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)；

(3)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％-95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清3000-4500g條件下離心5-8min，以0.22um濾膜過濾，分裝到灌腸管中，放到4℃冰箱中保存待用。

所述復(fù)方電解質(zhì)注射液為中國(guó)大冢制藥有限公司生產(chǎn)的復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖MG3注射液。

上述的用于家庭小型寵物的含間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的灌腸液的制備方法制得的灌腸液。

本發(fā)明的有益效果是：將細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，使得細(xì)胞分泌的各種活性成分的濃度都得到了提高，可促進(jìn)腸粘膜的修復(fù)，縮短粘膜傷口的愈合時(shí)間，并起到消除炎癥，促進(jìn)經(jīng)久不愈的潰瘍愈合等作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的方法培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞圖；

圖2為不同饑餓時(shí)間提取物中有效因子分泌量比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：

本發(fā)明的用于家庭小型寵物的含間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的灌腸液的制備方法，包括以下步驟：

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)；

(2)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)；

(3)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％-95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清3000-4500g條件下離心5-8min，以0.22um濾膜過濾，分裝到灌腸管中，放到4℃冰箱中保存待用。

所述復(fù)方電解質(zhì)注射液為中國(guó)大冢制藥有限公司生產(chǎn)的復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖MG3注射液。

制備的灌腸液用于家庭小型寵物(犬、貓)的各種急慢性腸炎的修復(fù)以及腸道清理。

實(shí)施例1

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)；

(2)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％(見圖1)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)8小時(shí)；

(3)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％--95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清3000g條件下離心5min，以0.22um濾膜過濾，分裝到灌腸管中，放到4℃冰箱中保存待用，檢測(cè)因子含量見(圖2)。

實(shí)施例2

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)；

(2)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)16小時(shí)，；

(3)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％--95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清4000g條件下離心6min，以0.22um濾膜過濾，分裝到灌腸管中，放到4℃冰箱中保存待用，檢測(cè)因子含量(圖2)。

實(shí)施例3

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)；

(2)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24小時(shí)，；

(3)待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％--95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清4500g條件下離心8min，以0.22um濾膜過濾，分裝到灌腸管中，放到4℃冰箱中保存待用，檢測(cè)因子含量(圖2)。

實(shí)施例4

(1)選取7周齡的SD大鼠12只，平均分為3組，①空白組；②陰性對(duì)照組；③實(shí)驗(yàn)組制備大鼠腸炎模型。

(2)造模成功后，按照①陰性對(duì)照組給予生理鹽水灌腸；②實(shí)驗(yàn)組用含間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的灌腸液進(jìn)行治療，分別在給藥后的第1、3、5、7、9天對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)。

(3)數(shù)據(jù)分析，分析各灌腸液對(duì)腸炎的修護(hù)作用。見表1,為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表。

表1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。