本發(fā)明屬于腫瘤治療領(lǐng)域，更具體地講，涉及靶向muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路的抑制劑在制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤治療往往伴隨著耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞中atp結(jié)合蛋白家族成員(atpbindingcassette，abcs)的過(guò)表達(dá)是腫瘤細(xì)胞獲得多藥耐藥能力而導(dǎo)致藥物抵抗的主要原因。abcs是一類依賴于atp的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可選擇性將底物包括藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外。其中abcb1又稱p-糖蛋白或多藥耐藥蛋白1(mdr1)常被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中過(guò)表達(dá)。用于腫瘤治療中的許多藥物如紫杉醇(paclitaxel)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、阿霉素(doxorubicin)和依托泊苷(etoposide)都是abcb1的底物。因此，abcb1過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生耐藥的重要原因。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)是一種酪氨酸激酶受體蛋白，屬于erbb家族。egfr過(guò)表達(dá)或突變引起下游信號(hào)通路異常激活將導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并通過(guò)調(diào)控atp結(jié)合蛋白家族成員abcb1和abcg2導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。egfr抑制劑已廣泛用于egfr陽(yáng)性腫瘤的靶向治療，尤其是應(yīng)用于由于egfr異常激活的非小細(xì)胞肺癌(non-small-celllungcancer，nsclc)的靶向治療。egfr的抑制劑的治療是基于egfr基因的過(guò)表達(dá)或者突變激活，但是在宮頸癌和肺原發(fā)黏液表皮樣癌中，egfr的突變并不常見(jiàn)，因此egfr的抑制劑尚未應(yīng)用到宮頸癌和肺原發(fā)黏液表皮樣癌的治療中。

黏蛋白1(muc1)是一種約120-225kda的高分子量糖蛋白，muc1基因全長(zhǎng)約4kb，編碼產(chǎn)物最初為單一的肽鏈形式，繼而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被剪切為n端亞基和c端亞基，二亞基在細(xì)胞膜上形成穩(wěn)定的異源二聚體。n端亞基約含1000-2200個(gè)氨基酸，由20個(gè)氨基酸為單位的重復(fù)序列組成，c端亞基包括58個(gè)氨基酸的胞外功能域、28個(gè)氨基酸的跨膜功能域和72個(gè)氨基酸的胞內(nèi)功能域(muc1-cd)。muc1廣泛表達(dá)于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等分泌型上皮細(xì)胞管腔表面，以防止細(xì)胞脫水、受外界ph變化、細(xì)菌、病毒及粉塵顆粒或污染等損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)在70％以上的nsclc中，muc1異常高表達(dá)(其表達(dá)水平達(dá)正常細(xì)胞的50-100倍)與nsclc的惡性程度及治療預(yù)后不良呈正相關(guān)。更有臨床研究報(bào)道m(xù)uc1表達(dá)在nsclc早期就有相關(guān)性。此外，muc1在細(xì)胞中的異常分布即去極性表達(dá)模式亦與nsclc的發(fā)展程度、腫瘤的大小及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一項(xiàng)基于細(xì)胞系和臨床樣本的基因表達(dá)芯片研究表明，muc1調(diào)控的基因表達(dá)模式可能作為判斷nsclc患者預(yù)后的標(biāo)志物。近期有研究報(bào)道m(xù)uc1在肺腺癌中過(guò)表達(dá)與paclitaxel耐藥相關(guān)。在宮頸癌中muc1可獨(dú)立或者聯(lián)合其他標(biāo)志蛋白作為組織學(xué)及惡性程度的鑒定指標(biāo)，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道在正常的宮頸鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)muc1不表達(dá)，在具有炎癥的宮頸鱗癌上皮和宮頸鱗狀癌中表達(dá)，且在宮頸鱗狀癌組織中muc1的表達(dá)與浸潤(rùn)程度成正相關(guān)。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)uc1與muc16一起可以共同作為宮頸腺癌預(yù)后的指標(biāo)。

世界范圍內(nèi)，宮頸癌對(duì)女性而言是重要的健康問(wèn)題，在女性中是第四常見(jiàn)腫瘤。最新統(tǒng)計(jì)全球每年新增53萬(wàn)宮頸癌患者，每年有26.6萬(wàn)患者死亡。85％的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，在中國(guó)，宮頸癌情況不容樂(lè)觀，全國(guó)每年新增13.15萬(wàn)的患者，死亡人數(shù)有3.3萬(wàn)人。

宮頸癌起源于子宮頸，主要分為(1)鱗狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma)：包括非角化鱗癌，角化鱗癌，疣狀鱗癌等；(2)腺癌(adenocarcinoma)：包括內(nèi)膜樣腺癌、粘液腺癌、透明細(xì)胞癌、漿液性腺癌；(3)其他類型：腺樣囊腺癌、腺鱗癌、小細(xì)胞未分化癌、類癌等。其中鱗狀細(xì)胞癌約為80-85％，腺癌約占15％，但是腺癌的發(fā)生比例在逐步增加。

早期宮頸癌以化療為主，進(jìn)展期以放化療為主，一線化療藥物以順鉑，卡鉑，紫杉醇為或順鉑/紫杉醇，卡鉑/紫杉醇聯(lián)合治療。但是傳統(tǒng)治療策略無(wú)靶向治療且副作用特別大，且進(jìn)展期及復(fù)發(fā)的后的宮頸癌對(duì)化療藥物具有耐藥性，1年存活率僅為20％或者更低。

2015年世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization,who)公布的腫瘤的死亡率是880萬(wàn)，其中肺癌占169萬(wàn)，肺癌是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，是導(dǎo)致死亡人數(shù)最高的腫瘤。且伴隨著工業(yè)化進(jìn)程導(dǎo)致環(huán)境改變以及生活方式的改變，肺癌的發(fā)病率每年都在增加，且由于肺癌早期診斷較難，且治療手段有限導(dǎo)致死亡率也不斷上升。

絕大部分肺癌起源于支氣管粘膜上皮，又稱支氣管肺癌。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌(smallcelllungcancer,sclc)和非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)兩大類，非小細(xì)胞肺癌又分為鱗癌(squamous-cellcarcinoma)，腺癌(adenocarcinoma)和大細(xì)胞肺癌(large-cellcarcinoma)等不同類型。

肺黏液表皮樣癌是一種比較罕見(jiàn)的涎腺型惡性腫瘤，主要發(fā)生在支氣管，分為低分化和高分化，以手術(shù)治療為主。有研究可用卡鉑聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱或卡鉑聯(lián)合紫杉醇治療高分化的肺黏液表皮樣癌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供靶向muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路的抑制劑與abcb1底物化療藥物聯(lián)合用藥在制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供muc1抑制劑在制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：靶向muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路的抑制劑與abcb1底物化療藥物聯(lián)合用藥在制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述靶向muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路的抑制劑是指muc1抑制劑、egfr抑制劑和abcb1抑制劑中的一種或幾種，所述muc1陽(yáng)性腫瘤是指化療藥物能夠激活muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路的腫瘤。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述腫瘤是指宮頸癌、肺黏液表皮樣癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述muc1抑制劑是指抑制muc1表達(dá)的方法shrna或抑制muc1功能的muc1抑制劑go203。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述egfr抑制劑是指吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺?、凡德他尼、拉帕替尼、來(lái)那替尼、阿法替尼、培利替尼、達(dá)克替尼、卡納替尼、西妥昔單抗和帕尼單抗，或它們的藥學(xué)上可接受的鹽。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述abcb1抑制劑是指抑制abcb1表達(dá)的方法shrna或抑制abcb1功能的abcb1抑制劑維拉帕米。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述abcb1底物化療藥物是指紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、阿霉素或依托泊苷。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：muc1抑制劑在制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述muc1陽(yáng)性腫瘤是指化療藥物能夠激活muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路的腫瘤。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述muc1抑制劑是指抑制muc1表達(dá)的方法shrna或抑制muc1功能的muc1抑制劑go203。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述腫瘤是指宮頸癌、肺黏液表皮樣癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明揭示了在muc1陽(yáng)性腫瘤中，化療藥物誘導(dǎo)muc1表達(dá)并激活muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞將藥物泵出膜外而產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)化療的同時(shí)靶向抑制egfr可有效抑制muc1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞增殖、控制移植瘤的生長(zhǎng)，并有效阻止了移植瘤的復(fù)發(fā)。提示靶向muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路的抑制劑與abcb1底物化療藥物聯(lián)合用藥在制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤藥物中的應(yīng)用具有廣闊的前景。

附圖說(shuō)明

圖1.hela229細(xì)胞內(nèi)沉默muc1后耐藥性檢測(cè)。(a)通過(guò)轉(zhuǎn)入不同的shmuc1片段進(jìn)行muc1基因沉默；通過(guò)westernblot檢測(cè)基因沉默效果。(b-e)hela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞在不同濃度的paclitaxel(b),vincristine(c),doxorubicin(d),etoposide(e)處理48小時(shí),通過(guò)cck8檢測(cè)細(xì)胞的活率。(f)hela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞經(jīng)paclitaxel處理48小時(shí)后，流式檢測(cè)凋亡情況。(g)hela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞用vincristine處理48小時(shí)后，流式檢測(cè)凋亡情況。

圖2.muc1在腫瘤細(xì)胞內(nèi)形成獲得性耐藥的過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。(a)q-pcr檢測(cè)hela229細(xì)胞在不同濃度paclitaxel處理48小時(shí)后muc1的mrna表達(dá)水平。(b)westernblot檢測(cè)hela229細(xì)胞在不同濃度paclitaxel處理48小時(shí)后muc1的蛋白表達(dá)水平。(c)q-pcr和westernblot檢測(cè)hela229和hela229/tr細(xì)胞內(nèi)muc1的mrna(左圖)和蛋白水平(右圖)。(d)q-pcr和westernblot檢測(cè)nci-h292和nci-h292/tr細(xì)胞內(nèi)muc1的mrna(左圖)和蛋白水平(右圖)。(e)westernblot檢測(cè)hela229/tr細(xì)胞muc1沉默效果。(f)hela229/shctl、hela229/shmuc1細(xì)胞按照6000/孔接種于96孔板內(nèi)，第二天給予不同濃度的紫杉醇處理，48小時(shí)后通過(guò)cck8assay檢測(cè)細(xì)胞活率。(g)westernblot檢測(cè)nci-h292/tr細(xì)胞muc1沉默效果。(h)nci-h292shctl、nci-h292shmuc1細(xì)胞按照10000/孔接種于96孔板內(nèi)，第二天給予不同濃度的紫杉醇處理，48小時(shí)后通過(guò)cck8assay檢測(cè)細(xì)胞活率。

圖3.muc1通過(guò)調(diào)控abcb1而導(dǎo)致耐藥。(a)q-pcr和westernblot檢測(cè)hela229和hela229/tr細(xì)胞內(nèi)abcb1的mrna和蛋白水平。(b)q-pcr和westernblot檢測(cè)nci-h292和nci-h292/tr細(xì)胞內(nèi)abcb1的mrna和蛋白水平。(c)左圖q-pcr檢測(cè)hela229/tr/shctl和hela229/tr/shmuc1細(xì)胞內(nèi)abcb1mrna的表達(dá)。β-actin為內(nèi)參。右圖westernblot檢測(cè)hela229/tr/shctl和hela229/tr/shmuc1細(xì)胞abcb1蛋白表達(dá)。(d)左圖q-pcr檢測(cè)nci-h292/tr/shctl和nci-h292/tr/shmuc1細(xì)胞內(nèi)abcb1mrna的表達(dá)。β-actin為內(nèi)參。右圖westernblot檢測(cè)nci-h292/tr/shctl和nci-h292/tr/shmuc1細(xì)胞中abcb1蛋白表達(dá)。(e)cck8檢測(cè)聯(lián)合使用abcb1抑制劑verapamil和paclitaxel對(duì)hela229/tr細(xì)胞的細(xì)增殖的影響。(f)cck8檢測(cè)聯(lián)合使用abcb1抑制劑zosuquidar和paclitaxel對(duì)hela229/tr細(xì)胞的細(xì)增殖的影響。(g)cck8檢測(cè)聯(lián)合使用abcb1抑制劑verapamil和paclitaxel對(duì)nci-h292/tr細(xì)胞的細(xì)增殖的影響。(h)cck8檢測(cè)聯(lián)合使用abcb1抑制劑zosuquidar和paclitaxel對(duì)nci-h292/tr細(xì)胞的細(xì)增殖的影響。

圖4.muc1激活egfr并誘導(dǎo)其入核調(diào)控abcb1。(a)hela229/shctl及hela229/shmuc1細(xì)胞用paclitaxel(10nm)和erlotinib(5μm)處理72小時(shí)。westernblot檢測(cè)abcb1、egfr磷酸化、egfr以及muc1表達(dá)水平。(b)hela229/tr用erlotinib(20μm)處理48小時(shí)，westernblot檢測(cè)abcb1、egfr磷酸化、egfr以及muc1表達(dá)水平。(c)nci-h292/tr用erlotinib(10μm)處理48小時(shí)，westernblot檢測(cè)abcb1、egfr磷酸化、egfr以及muc1表達(dá)水平。(d上)hela229/tr用erlotinib(20μm)處理48小時(shí)，q-pcr檢測(cè)abcb1mrna表達(dá)水平。(d下)nci-h292/tr用erlotinib(10μm)處理48小時(shí)，q-pcr檢測(cè)abcb1mrna表達(dá)水平。(e)hela229細(xì)胞用5μmerlotinib和10nmpaclitaxel處理12小時(shí)后，免疫熒光檢測(cè)egfr和muc1-c的定位情況。dapi用于細(xì)胞核的染色。

圖5.egfr抑制劑erlotinib抑制耐藥株對(duì)藥物的耐藥性。(a)聯(lián)合使用erlotinib和paclitaxel處理hela229和hela229/tr細(xì)胞48小時(shí)，cck8檢測(cè)細(xì)胞活率。(b)聯(lián)合使用erlotinib和paclitaxel處理nci-h292和nci-h292/tr細(xì)胞48小時(shí)，cck8檢測(cè)細(xì)胞活率。

圖6.erlotinib與paclitaxel聯(lián)用阻止移植瘤的生長(zhǎng)與復(fù)發(fā)。(a)在6周的雌性裸鼠腋下皮下接種2.5x10⁶個(gè)hela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞，等到腫瘤體積大于4mmx4mm時(shí)將小鼠隨機(jī)分成2組，一組為對(duì)照組給pbs，一組給予40mg/kgpaclitaxel治療，每三天給藥一次，并記錄腫瘤大小，給藥15天，然后觀察30天。腫瘤體積v＝length*width²/2,bar值為每組6只s.e.m值。(b)第45天小鼠腫瘤拍照。(c)小鼠組織tunel染色檢測(cè)凋亡。(d)在雌性裸鼠皮下接種2.5x10⁶個(gè)hela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞，等到腫瘤長(zhǎng)到4mmx4mm后，將hela229/shctl細(xì)胞分為6組，hela229/shmuc1細(xì)胞則分為2組，分別給予相應(yīng)治療。每三天給藥，并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小。給藥15天后，繼續(xù)觀察21天，取出腫瘤拍照。

圖7.聯(lián)合使用egfr的抑制劑geftinib,erlotinib增加化療藥物的對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。(a)聯(lián)合使用geftinib和paclitaxel,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(b)聯(lián)合使用geftinib和vincristine,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(c)聯(lián)合使用geftinib和etoposide,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(d)聯(lián)合使用geftinib和doxrubucin,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(e)聯(lián)合使用erlotinib和paclitaxel,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(f)聯(lián)合使用erlotinib和vincristine,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(g)聯(lián)合使用erlotinib和etoposide,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(h)聯(lián)合使用erlotinib和doxrubucin,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。

圖8.聯(lián)合使用muc1的抑制劑g203增加化療藥物的對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。(a)聯(lián)合使用g203和paclitaxel,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(b)聯(lián)合使用g203和vincristine,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(c)聯(lián)合使用g203和etoposide,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(d)聯(lián)合使用g203和doxrubucin,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。

圖9.聯(lián)合使用abcb1的抑制劑verapamil增加化療藥物的對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。(a)聯(lián)合使用verapamil和paclitaxel,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(b)聯(lián)合使用verapamil和vincristine,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(c)聯(lián)合使用verapamil和etoposide,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。(d)聯(lián)合使用verapamil和doxrubucin,通過(guò)cck8檢測(cè)不同天hela229細(xì)胞的增殖情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

(1)細(xì)胞株的培養(yǎng)：宮頸癌hela229細(xì)胞系和肺黏液表皮樣癌細(xì)胞系nci-h292分別由中科院上海細(xì)胞庫(kù)和上海富衡生物技術(shù)公司提供。hela229和nci-h292培養(yǎng)于rpmi1640(corning，ny，usa)中，含10％胎牛血清(fetalbovineserum，gibco，grandisland，ny，usa)，同時(shí)添加100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。

(2)耐藥株的構(gòu)建：為了構(gòu)建paclitaxel耐藥株細(xì)胞，將hela229細(xì)胞株培養(yǎng)于含5nmpaclitaxel(paclitaxel,sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)3代后，將paclitaxel濃度提高至10nm，繼續(xù)培養(yǎng)3代。之后提高paclitaxel濃度至15nm、20nm、25nm培養(yǎng)，最后維持在含25nm的paclitaxel的培養(yǎng)基中，形成耐藥株hela229/tr。nci-h292細(xì)胞通過(guò)不同濃度的paclitaxel(2.5nm、5nm、10nm)分別處理3代后，維持在10nm的paclitaxel濃度中，形成耐藥株nci-h292/tr。

(3)hela229/shctl及hela229/shmuc1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建：將細(xì)胞接種至6cm培養(yǎng)皿中(5×10⁵/盤),約24小時(shí)后當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(50-60％匯合)時(shí)，按x-tremegenehpdnatransfectionreagent(rocheappliedscience,basel,switzerland)說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體如下：分別轉(zhuǎn)染prnau6-ctl-shrna、prnau6-muc1-shrna-a及prnau6-muc1-shrna-b質(zhì)粒各2μg加x-tremegenehp5ul。靶向muc1序列，prnau6-muc1-shrna-a:5’-aaggtaccatcaatgtccacg-3’，prnau6-muc1-shrna-b:5’-aagttcagtgcccagctctac-3。ctl-shrna序列為5’-cgcttaccgattcagaatgg-3’。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后用胰酶消化重懸，離心并將細(xì)胞沉淀接種于15cm培養(yǎng)皿中，用含500μg/mlg418的選擇性rpmi1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，視細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況更換培養(yǎng)基，直到兩周左右。待出現(xiàn)明顯克隆后，將單克隆挑出移至24孔板中培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿后擴(kuò)盤，取一部分細(xì)胞保種培養(yǎng)，另一部分細(xì)胞收集蛋白行westernblot檢測(cè)表達(dá)。篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株用含500μg/mlg418的rpmi1640培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

(4)hela229tr/shmuc1及nci-h292tr/shmuc1細(xì)胞株構(gòu)建：pgiz-puromycinlentiviralplasmids質(zhì)粒來(lái)自thermoscientificopenbiosystemsgipzlentiviralshrnamirlibrary。目標(biāo)序列為：shmuc1-1:5’-ccagcaccgactactacca-3’；shmuc1-2:5’-gaaatgtttttgcagattt-3’；shctl:5’-ctcgcttgggcgagagtaa-3’。shrna質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒(pm2gandpspax2)共同轉(zhuǎn)染于292t細(xì)胞內(nèi)，48小時(shí)后收集含病毒顆粒的上清，加入1μg/mlpolybrene(santacruzbiotechnology，santacruz，ca，usa)，感染hela229/tr，nci-h292/tr細(xì)胞。48小時(shí)后，hela229/tr細(xì)胞通過(guò)3μg/mlpuromycin，nci-h292/tr細(xì)胞通過(guò)1.5μg/mlpuromycin進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選1周。

(5)細(xì)胞增殖曲線：使用cellcountingkit(dojindo)簡(jiǎn)稱cck8(cck-8/wst-8)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目。wst-8(化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2h-四唑單鈉鹽)在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物(formazan)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值，od值與細(xì)胞的增殖數(shù)目及藥物處理后細(xì)胞活力成正比。通過(guò)cck8實(shí)驗(yàn)，可以通過(guò)相對(duì)od值間接反映活細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力。將細(xì)胞用胰酶消化、重懸后計(jì)數(shù)，96孔每孔接種1000個(gè)hela229，待細(xì)胞貼壁后，按照cck8說(shuō)明書操作，每孔添加10ulcck8，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，使用酶標(biāo)儀(synergyh4hybridreader，biotek)檢測(cè)450nm的od值，每天相同時(shí)間檢測(cè)od值，計(jì)算相對(duì)od值，代表相對(duì)生長(zhǎng)速度。

(6)細(xì)胞藥物活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞用胰酶消化后，重懸計(jì)數(shù)。hela229及hela229/tr細(xì)胞每孔接種6000個(gè)，nci-h292細(xì)胞每孔接種10000個(gè)，第二天貼壁后，輕輕吸取上清，加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，按時(shí)間點(diǎn)終止細(xì)胞生長(zhǎng)，加入10μlcck8，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的od值。細(xì)胞存活率計(jì)算方法如下：藥物處理組od值/無(wú)藥物對(duì)照組od值。第n天細(xì)胞藥物中增殖率＝第n天藥物處理組od值/第0天藥物處理組的od值。

(7)流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將細(xì)胞接種至6cm培養(yǎng)皿中(3×10⁵/盤)，每種細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別種3盤。37℃，5％co2培養(yǎng)24小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入含有10nmpaclitaxel的完全培養(yǎng)基，于5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)，分別于24小時(shí)、48小時(shí)收集上清，并用不含edta的胰酶消化細(xì)胞，合并上清和消化所得細(xì)胞，1000rpm離心5min，重懸至流式管中，1ml冰浴pbs洗一次，離心同前。分別加入annexinv和pi進(jìn)行染色，室溫避光10分鐘，用facscalibar(美國(guó)becktondickinson公司)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析annexinv陽(yáng)性、pi陰性細(xì)胞。

(8)免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作：將蓋玻片用酒精浸泡5min后，然后置于6孔板內(nèi)，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)紫外照射30min以上，直至玻片上酒精完全風(fēng)干。將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，第二天貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理，加入藥物處理或者轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒。48小時(shí)后，輕輕吸去上清，用室溫pbs2ml洗細(xì)胞一遍；用1ml4％多聚甲室溫固定細(xì)胞30min，用室溫pbs在搖床上洗5min；用4℃冰甲醇透化細(xì)胞10-20min；用室溫pbs在搖床洗細(xì)胞三次，每次5分鐘。在片子上加50ul的2％bsa室溫處理1小時(shí)進(jìn)行封閉，為防止蒸發(fā)，片子放于濕盒內(nèi)。將封閉液吸干凈后，孵育抗體?？贵w按照說(shuō)明書提供的稀釋比例用2％bsa稀釋。每張片子50ul，4℃濕盒孵育過(guò)夜。第二天將一抗吸干，pbs2ml在搖床上洗3次，每次5min；按照二抗說(shuō)明書，一般1:5用2％bsa稀釋，37℃濕盒內(nèi)1-2小時(shí)，避光操作；將二抗吸干，pbs2ml搖床上洗3次，每次5min。在洗細(xì)胞期間，將所需使用的載玻片用酒精浸泡、擦干；在載玻片上滴上10μl的封片劑(含dapi染料vectashieldmountingmediumwithdapi，h-1200)，然后將6孔板內(nèi)的玻片倒置于玻片封片劑上。待其晾干后，用指甲油封片，可進(jìn)行免疫熒光顯微鏡下觀察。

(9)裸鼠荷瘤治療實(shí)驗(yàn)：在2組4-6周雌性balb/c裸鼠皮下分別接種hela229/shctl-b和hela229/shmuc1-b細(xì)胞。細(xì)胞用pbs重懸、計(jì)數(shù)。每只ep管裝1ml的細(xì)胞懸浮液，濃度為12.5x10⁶的細(xì)胞，將ep管用封口膜封上，放入固體冰袋上，準(zhǔn)備足夠的1ml注射器。兩組小鼠分別接種35只裸鼠，每只裸鼠接種200ul懸液含2.5x10⁶個(gè)細(xì)胞。在每組裸鼠中有24只左右的腫瘤達(dá)到4mmx4mm的時(shí)候，隨機(jī)分組，并進(jìn)行編號(hào)，每組6只。稱量每只裸鼠重量(裸鼠重量約在15-20g)，記錄，計(jì)算出給藥體積。對(duì)照：pbs；治療組：paclitaxel40mg/kg。paclitaxel為醫(yī)用紫杉醇(四川太極制藥有限公司)。每三天給藥一次，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量最長(zhǎng)直徑(長(zhǎng))，和最短直徑(寬)，并記錄重量。體積為寬*寬*長(zhǎng)/2。連續(xù)給藥兩周，制作生長(zhǎng)曲線，停止給藥后的兩周取組織標(biāo)本。

(10)裸鼠荷瘤聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)：在2組4-6周雌性balb/c裸鼠皮下分別接種hela229/shctl-b和hela229/shmuc1-b細(xì)胞。等到腫瘤體積達(dá)到4mmx4mm后，隨機(jī)分組，hela229/shctl-b組分為6組，每組6只，hela229/shmuc1-b組分為兩組，每組6只。hela229/shctl-b組6組：組1：pbs；組2：paclitaxel40mg/kg；組3:verapamil20mg/kg；組4:verapamil20mg/kg聯(lián)合paclitaxel40mg/kg；組5:erlotinib50mg/kg；組6:erlotinib50mg/kg聯(lián)合paclitaxel40mg/kg。hela229/shmuc1-b組分為2組：組1：pbs；組2：paclitaxel40mg/kg。paclitaxel為醫(yī)用紫杉醇(四川太極制藥有限公司)，erlotinib購(gòu)于selleckchemicals公司。每三天給藥一次，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量最長(zhǎng)直徑(長(zhǎng))，和最短直徑(寬)，并記錄重量。體積為寬*寬*長(zhǎng)/2。連續(xù)給藥兩周，制作生長(zhǎng)曲線，停止給藥后的三周取組織標(biāo)本。

(11)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：文章所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用t-test,當(dāng)p<0.05時(shí)定義為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

實(shí)施例1.muc1調(diào)控腫瘤細(xì)胞的化療藥物敏感性。

為了研究muc1在宮頸癌和肺黏液表皮樣癌發(fā)生中的作用，我們首先在宮頸癌和肺黏液表皮樣癌系hela229中轉(zhuǎn)入prnau6.1-ctlshrna和兩個(gè)prnau6.1-muc1shrna-a,prnau6.1-muc1shrna-b質(zhì)粒，通過(guò)g418抗性篩選出陽(yáng)性克隆，并通過(guò)westernblot檢測(cè)muc1的表達(dá)。westernblot結(jié)果顯示我們獲得hela229/shctl和hela229/shmuc1各兩株(圖1a)。利用這四株細(xì)胞，我們分別檢測(cè)了muc1在小細(xì)胞化療常用藥耐受性中的作用。結(jié)果顯示，在paclitaxel(圖1b)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)(圖1c)、阿霉素(doxorubicin)(圖1d)及依托泊苷(etoposide)(圖1e)4種藥物中，沉默muc1后hela229/shmuc1與hela229/shctl細(xì)胞相比細(xì)胞活率顯著降低，即沉默muc1后上述化療藥物的敏感性增加。進(jìn)一步對(duì)paclitaxel(圖1f)和vincristine(圖1g)兩種藥物誘導(dǎo)凋亡的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，處理不同時(shí)間后，沉默muc1的細(xì)胞凋亡增加。所述結(jié)果說(shuō)明沉默muc1導(dǎo)致hela229細(xì)胞對(duì)上述4種藥物耐藥性下降，敏感性增加。

實(shí)施例2.muc1在腫瘤細(xì)胞形成獲得性耐藥的過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。

為了證明muc1在腫瘤細(xì)胞中對(duì)化療敏感性的調(diào)控作用，我們檢測(cè)了在paclitaxel作用下，muc1的表達(dá)。結(jié)果顯示，hela229細(xì)胞在短時(shí)間的paclitaxel作用下，muc1的mrna(圖2a)和蛋白水平(圖2b)都明顯增加。我們進(jìn)一步構(gòu)建了paclitaxel耐藥細(xì)胞株：hela229/tr和nci-h292/tr。對(duì)兩株細(xì)胞的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與母本細(xì)胞株相比hela229/tr(圖2c)和nci-h292/tr(圖2d)細(xì)胞中muc1mrna和蛋白水平都明顯增加。一方面說(shuō)明化療藥物paclitaxel上調(diào)muc1mrna水平、進(jìn)而增加muc1的蛋白表達(dá)，另一方面說(shuō)明muc1可能是細(xì)胞耐藥所必需的。為了證明這一推測(cè)，用含shmuc1的pgiz-puromycin慢病毒感染hela229/tr和nci-h292/tr細(xì)胞以沉默muc1基因，通過(guò)westernblot檢測(cè)muc1蛋白水平(圖2e、2g)，加入不同濃度的paclitaxel處理48小時(shí)后，通過(guò)cellcountingkit(cck8)檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示不論是hela229/tr(圖2e、2f)還是nci-h292/tr(圖2g、2h)細(xì)胞沉默muc1后，細(xì)胞株對(duì)paclitaxel作用下的活率均出現(xiàn)下降。進(jìn)一步證明muc1在腫瘤細(xì)胞中對(duì)paclitaxel敏感性的調(diào)控作用。

實(shí)施例3.muc1通過(guò)調(diào)控abcb1而導(dǎo)致耐藥。

為了進(jìn)一步研究muc1的耐藥性機(jī)制，我們檢測(cè)了與耐藥性密切相關(guān)的abc家族蛋白成員abcb1的表達(dá)。結(jié)果顯示，在hela229(圖3a)和nci-h292(圖3b)耐藥株abcb1的mrna和蛋白表達(dá)水平都明顯增加。用含shmuc1的pgiz-puromycin慢病毒感染hela229/tr和nci-h292/tr細(xì)胞以沉默muc1基因，通過(guò)q-pcr和westernblot檢測(cè)了abcb1的mrna和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，沉默muc1后hela229/tr(圖3c)和nci-h292/tr(圖3d)的abcb1的mrna和蛋白表達(dá)下降，說(shuō)明muc1直接調(diào)控abcb1的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證abcb1在細(xì)胞耐藥中的作用，我們利用abcb1的抑制劑verapamil或zosuquidar與紫杉醇聯(lián)合使用，檢測(cè)對(duì)hela229/tr和nci-h292/tr細(xì)胞的抑制情況。結(jié)果表明，不論是verapamil(圖3e、3g)或zosuquidar(圖3f、3h)抑制abcb1后，耐藥株hela229/tr(圖3e、3f)和nci-h292/tr(圖3g、3h)對(duì)紫杉醇的耐藥性明顯下降。

實(shí)施例4.muc1激活egfr并誘導(dǎo)egfr入核調(diào)控abcb1。

為了證明muc1對(duì)abcb1的調(diào)控作用與egfr的信號(hào)通路的關(guān)系，我們首先利用hela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞，觀察egfr的抑制劑erlotinib作用下，paclitaxel誘導(dǎo)的abcb1的變化。結(jié)果如圖4a所示：1)在hela229/shctl細(xì)胞中，erlotinib作用下，paclitaxel誘導(dǎo)的abcb1的上調(diào)被抑制；2)在muc1表達(dá)的hela229/shctl細(xì)胞中，egfr磷酸化在paclitaxel誘導(dǎo)下明顯上升，提示在paclitaxel處理后muc1激活egfr；3)erlotinib不僅抑制了egfr磷酸化，還抑制了muc1的表達(dá)。進(jìn)一步用erlotinib處理hela229/tr(圖4b)和nci-h292/tr(圖4c)細(xì)胞，可見(jiàn)erlotinib導(dǎo)致abcb1的蛋白水平顯著下降。同時(shí)，通過(guò)q-pcr證明hela229/tr(圖4d上)和nci-h292/tr(圖4d下)細(xì)胞中，erlotinib抑制了abcb1的mrna水平。這些結(jié)果提示muc1激活egfr并增強(qiáng)了abcb1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。muc1是否影響了egfr的核定位呢？我們利用hela229細(xì)胞檢測(cè)了paclitaxel對(duì)egfr細(xì)胞內(nèi)定位的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，paclitaxel誘導(dǎo)了muc1和egfr進(jìn)入細(xì)胞核，而抑制劑erlotinib有效地抑制了這一過(guò)程(圖4e)。

實(shí)施例5.利用egfr抑制劑erlotinib抑制muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路可有效抑制細(xì)胞增殖。

由于egfr抑制劑erlotinib能夠抑制muc1和abcb1的表達(dá)，我們進(jìn)一步研究erlotinib是否影響hela229和nci-h292細(xì)胞對(duì)paclitaxel的耐藥性。在hela229和nci-h292細(xì)胞內(nèi)，聯(lián)合使用erlotinib和paclitaxel能夠有效的抑制hela229/tr(圖5a)和nci-h292/tr(圖5b)耐藥株細(xì)胞的增殖，增加了細(xì)胞對(duì)paclitaxel的敏感性。

實(shí)施例6.利用erlotinib與paclitaxel聯(lián)用有效阻止移植瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。

為了驗(yàn)證muc1在體內(nèi)對(duì)宮頸癌和肺黏液表皮樣癌耐藥性的影響，我們?cè)?周的雌性nudemice腋下皮下接種hela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞，等到腫瘤體積大于4mmx4mm時(shí)將小鼠隨機(jī)分成2組，一組為對(duì)照組給pbs，一組給予40mg/kgpaclitaxel治療，每三天給藥一次，并記錄腫瘤大小，給藥15天，然后觀察30天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hela229/shctl腫瘤長(zhǎng)得比hela229/shmuc1腫瘤快。在給藥初期hela229/shctl腫瘤對(duì)paclitaxel敏感，表現(xiàn)為腫瘤生長(zhǎng)抑制，但是給藥停止后，腫瘤開(kāi)始復(fù)發(fā)，且腫瘤平均增殖速度明顯增加，而hela229/shmuc1腫瘤在paclitaxel處理后，體積明顯減小至消失，后續(xù)觀察中并未有腫瘤的復(fù)發(fā)(圖6a、6b)。說(shuō)明抑制muc1表達(dá)不僅抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而且抑制了腫瘤的復(fù)發(fā)。tunel染色檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，paclitaxel治療后hela229/shmuc1腫瘤凋亡明顯增加(圖6c)。

根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)，erltotinib能在體外抑制muc1導(dǎo)致的paclitaxel耐藥，為了進(jìn)一步研究抑制劑在體內(nèi)的情況，我們?cè)诼闶笃は陆臃Nhela229/shctl和hela229/shmuc1細(xì)胞，等到腫瘤長(zhǎng)到4x4mm后，將hela229/shctl細(xì)胞分為6組，分別給予組1：pbs,組2：paclitaxel(40mg/kg)，組3：verapamil(20mg/kg)，組4：verapamil(20mg/kg)和paclitaxel(40mg/kg)聯(lián)用,組5：erlotinib(50mg/kg)，組6：erlotinib(50mg/kg)和paclitaxel(40mg/kg)聯(lián)用。hela229/shmuc1細(xì)胞則分為2組，分別為組1：pbs,組2：paclitaxel(40mg/kg)。每三天給藥，并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小。給藥15天后，繼續(xù)觀察21天，將小鼠實(shí)行安樂(lè)死后，取出腫瘤并拍照。結(jié)果顯示，不論是paclitaxel、verapamil，還是erlotinib單獨(dú)使用均不能抑制hela229/shctl腫瘤，而抑制muc1-egfr-abcb1中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，同時(shí)聯(lián)用paclitaxel則能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)(圖6d)。說(shuō)明靶向抑制muc1-egfr-abcb1中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)聯(lián)合paclitaxel治療腫瘤細(xì)胞能夠提高muc1陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞對(duì)paclitaxel的敏感性。

實(shí)施例7.利用muc1的抑制劑go203分別與四種化療藥物聯(lián)用，有效抑制hela229細(xì)胞的增殖，效果優(yōu)于任何一種化療藥物單用。

go203(g203)能夠有效的抑制muc1-c端的二聚化，抑制muc1的功能，cp-2為對(duì)照肽段。我們通過(guò)藥物增殖實(shí)驗(yàn)研究了muc1的抑制劑g203能否增加hela229細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與聯(lián)合使用cp-2相比，聯(lián)合使用g203能夠增加paclitaxel(圖8a),vincristine(圖8b),etoposide(圖8c),doxrubucin(圖8d)的對(duì)宮頸癌和肺黏液表皮樣癌的生長(zhǎng)抑制作用。

實(shí)施例8.利用egfr的抑制劑erlotinib和geftinib分別與四種化療藥物聯(lián)用，有效抑制hela229細(xì)胞的增殖，效果優(yōu)于任何一種化療藥物單用。

因?yàn)閙uc1通過(guò)egfr影響abcb1的表達(dá)降低hela229細(xì)胞對(duì)多種宮頸癌和肺黏液表皮樣癌治療藥物的耐藥性，我們進(jìn)一步研究egfr的抑制erlotinib和geftinib對(duì)hela229細(xì)胞耐藥性的影響。(圖7a-d)顯示在hela229細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合使用egfr的抑制劑geftinib能夠增加宮頸癌和肺黏液表皮樣癌治療藥物paclitaxel(a),vincristine(b),etoposide(c),doxrubucin(d)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。(圖7e-h)顯示在hela229細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合使用egfr的抑制劑erlotinib能夠增加宮頸癌和肺黏液表皮樣癌治療藥物paclitaxel(e),vincristine(f),etoposide(g),doxrubucin(h)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。說(shuō)明抑制egfr的活性，能夠有效抑制宮頸癌和肺黏液表皮樣癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的耐藥性。

實(shí)施例9.利用abcb1的抑制劑維拉帕米(verapamil)分別與四種化療藥物聯(lián)用，有效抑制hela229細(xì)胞的增殖，效果優(yōu)于任何一種化療藥物單用。

由于muc1通過(guò)影響abcb1的表達(dá)水平降低導(dǎo)致宮頸癌和肺黏液表皮樣癌的耐藥性降低，我們進(jìn)一步研究直接抑制abcb1是否能夠增加宮頸癌和肺黏液表皮樣癌對(duì)多種化療藥物的敏感性。實(shí)驗(yàn)顯示，聯(lián)合使用abcb1的抑制劑verapamil能夠增加宮頸癌和肺黏液表皮樣癌治療藥物paclitaxel(a),vincristine(b),etoposide(c),doxrubucin(d)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。

結(jié)論：

1、利用egfr抑制劑erlotinib與紫杉醇(paclitaxel)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的宮頸癌和肺黏液表皮樣癌。腫瘤細(xì)胞發(fā)生化療藥物耐受是導(dǎo)致宮頸癌和肺黏液表皮樣癌治療失敗的主要原因，本發(fā)明利用宮頸癌和肺黏液表皮樣癌細(xì)胞系研究耐藥細(xì)胞的變化特征，以揭示宮頸癌和肺黏液表皮樣癌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致耐藥發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，并尋找有效的、針對(duì)性治療方案。我們發(fā)現(xiàn)muc1在宮頸癌和肺黏液表皮樣癌中與藥物敏感性呈負(fù)相關(guān)，在宮頸癌和肺黏液表皮樣癌接受化療處理并形成獲得性耐藥的過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。muc1表達(dá)上調(diào)后進(jìn)一步激活egfr并與之相互作用，通過(guò)調(diào)控abcb1而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)藥物抵抗。利用egfr抑制劑erlotinib不僅抑制化療藥物誘導(dǎo)的muc1上調(diào)以及egfr磷酸化，并且抑制abcb1的表達(dá)水平(圖4)。利用erlotinib與化療藥物聯(lián)合處理腫瘤細(xì)胞，不僅能有效抑制細(xì)胞增殖(圖5)，控制移植瘤的生長(zhǎng)(圖6)，而且有效阻止了移植瘤的復(fù)發(fā)(圖6)。

2、利用egfr抑制劑erlotinib與四種abcb1底物化療藥物：紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的宮頸癌和肺黏液表皮樣癌(圖7e-h)。

3、利用egfr其他抑制劑例如gefitinib與abcb1底物化療藥物：紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的宮頸癌和肺黏液表皮樣癌(圖7a-d)。

4、利用抑制muc1表達(dá)的方法例如shrna與abcb1底物化療藥物：紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的宮頸癌和肺黏液表皮樣癌(圖1b-e)。

5、利用muc1抑制劑(例如go203)抑制muc1功能與abcb1底物化療藥物：紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的宮頸癌和肺黏液表皮樣癌(圖8a-d)。

6、利用muc1抑制劑(例如go203)抑制muc1功能單獨(dú)可治療muc1陽(yáng)性的宮頸癌和肺黏液表皮樣癌。

7、利用abcb1抑制劑與abcb1底物化療藥物：紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的宮頸癌和肺黏液表皮樣癌(圖9a-d)。

8、利用egfr抑制劑erlotinib、gefitinib與abcb1底物paclitaxel(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的其它腫瘤，如卵巢癌、胃癌、胰腺癌等。在這些腫瘤中，只要化療藥物能夠激活muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路，就可以用上述方法治療。

9、抑制muc1表達(dá)和功能的方法例如shrna或抑制劑與abcb1底物紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的其它腫瘤，如卵巢癌、胃癌、胰腺癌等。在這些腫瘤中，只要化療藥物能夠激活muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路，就可以用上述方法治療。

10、抑制abcb1表達(dá)和功能的方法例如shrna或抑制劑與abcb1底物紫杉醇(paclitaxel)或長(zhǎng)春新堿(vincristine)或阿霉素(doxorubicin)或依托泊苷(etoposide)聯(lián)用治療muc1陽(yáng)性的其它腫瘤，如卵巢癌、胃癌、胰腺癌等。在這些腫瘤中，只要化療藥物能夠激活muc1-egfr-abcb1信號(hào)通路，就可以用上述方法治療。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院

<120>egfr抑制劑在制備治療muc1陽(yáng)性腫瘤藥物中的應(yīng)用

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