本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及gp130抑制劑在制備干預(yù)和治療肥胖導(dǎo)致的血糖代謝疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著人民生活質(zhì)量的提高，肥胖已經(jīng)漸漸成為21世紀(jì)最嚴(yán)重的慢性疾病之一。有研究表明，肥胖與二型糖尿病、心血管疾病及癌癥等多種疾病都有直接的聯(lián)系。隨著科學(xué)的進(jìn)步，尤其是在近二十年的研究中，人們發(fā)現(xiàn)脂肪組織不僅僅是一種儲(chǔ)能組織，而且是一種多功能的活躍的分泌器官。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞可以分泌出包括白介素(interleukin、il)、干擾素(interferon、ifn)、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor、tnf)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，參與慢性炎癥應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等多種生理和病理過(guò)程。autotaxin(atx)是核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(nucleotidepyrophosphatase,npp)家族中的一員即npp2，是一個(gè)分泌型糖蛋白。它具有l(wèi)ysopld活性，其主要功能是催化溶血磷脂膽堿(lpc)水解生成溶血磷脂酸(lpa)。atx是催化lpa生成的關(guān)鍵酶，lpa是一種生物活性磷脂分子，可以通過(guò)細(xì)胞表面的lpa受體發(fā)揮生物學(xué)功能。atx是生成lpa的關(guān)鍵酶，atx在脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，條件性敲除脂肪細(xì)胞中的atx基因，小鼠血漿中atx含量降低50％,血漿中l(wèi)pa濃度下調(diào)38％，這表明脂肪組織是體內(nèi)atx的主要來(lái)源。當(dāng)飼喂高脂食物(high-fatdiet,hfd)導(dǎo)致肥胖發(fā)生時(shí)，小鼠脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)顯著升高，血漿中l(wèi)pa的含量顯著增加，同時(shí)表現(xiàn)出胰島素抵抗癥狀。與野生型小鼠比較，飼喂hfd的脂肪細(xì)胞atx特異敲除(fatx-ko)小鼠的胰島素抵抗癥狀顯著減弱。遺傳性肥胖的db/db糖尿病模型小鼠的脂肪細(xì)胞中，atx的表達(dá)也顯著升高，而且與胰島素抵抗程度密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比肥胖患者的內(nèi)臟脂肪中atx的表達(dá)顯著升高；與葡萄糖代謝正常的肥胖患者相比，在患有糖尿病或表現(xiàn)葡萄糖耐量受損癥狀的肥胖人群中，脂肪組織atx的表達(dá)水平更高。所有這些研究均表明，肥胖可以導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中atx表達(dá)的異常增加，由此引起的atx/lpa水平上調(diào)與肥胖個(gè)體的葡萄糖代謝紊亂有密切的關(guān)系。il-6家族細(xì)胞因子是多個(gè)細(xì)胞因子的統(tǒng)稱，包含il-6、lif、il-11、ct-1、cntf、osm等，它們通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)功能。gp130是il-6家族細(xì)胞因子受體中共有的一個(gè)亞基，當(dāng)受到外界il-6家族細(xì)胞因子刺激時(shí)，gp130自我形成二聚體或與另一個(gè)細(xì)胞因子特異性跨膜受體形成二聚體后，結(jié)合細(xì)胞外膜特異受體(例如il6receptor-α)形成受體復(fù)合物，介導(dǎo)激活jak-stat、pi3k-akt和mapk等下游信號(hào)通路。il-6家族因子都需要gp130受體來(lái)參與介導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)功能，因此il-6家族細(xì)胞因子又被稱為gp130細(xì)胞因子。脂肪細(xì)胞可以表達(dá)分泌il-6、il-11、lif、cntf和ct-1等多個(gè)il-6家族細(xì)胞因子。脂肪是產(chǎn)生il-6的主要組織，健康人體中1/3的il-6由脂肪組織產(chǎn)生。肥胖個(gè)體的脂肪組織處于一種慢性炎癥狀態(tài)，發(fā)生免疫細(xì)胞的大量侵潤(rùn)，引起脂肪組織中il-6、tnf-α等促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平顯著升高，是造成肥胖脂肪組織功能失調(diào)、導(dǎo)致肥胖相關(guān)疾病發(fā)生的重要因素之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制gp130表達(dá)和/或活性的物質(zhì)或阻斷gp130介導(dǎo)的jak-stat3信號(hào)通路的物質(zhì)的用途。本發(fā)明提供的抑制gp130表達(dá)和/或活性的物質(zhì)或阻斷gp130介導(dǎo)的jak-stat3信號(hào)通路的物質(zhì)在如下1)-4)中至少一種中的應(yīng)用：1)制備干預(yù)和/或治療肥胖導(dǎo)致的血糖代謝疾病產(chǎn)品；適合于人和任何非人動(dòng)物2)制備抑制脂肪組織或脂肪細(xì)胞中atx表達(dá)的產(chǎn)品；3)制備降低血漿中l(wèi)pa和/或atx水平的產(chǎn)品；4)制備抑制脂肪細(xì)胞中stat3活化的產(chǎn)品。上述應(yīng)用中，所述血糖代謝疾病為二型糖尿病。上述應(yīng)用中，所述抑制脂肪組織或脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)是通過(guò)抑制gp130介導(dǎo)的jak-stat3信號(hào)通路中的stat3的活化，即降低stat3磷酸化水平(p-stat3水平)實(shí)現(xiàn)的。上述應(yīng)用中，抑制gp130表達(dá)和/或活性的物質(zhì)或阻斷gp130介導(dǎo)的jak-stat3信號(hào)通路的物質(zhì)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)所知道的任何能夠抑制gp130的物質(zhì)，如小分子化合物、抑制基因的干擾rna、抗體。所述抑制gp130表達(dá)和/或活性的物質(zhì)或阻斷gp130介導(dǎo)的jak-stat3信號(hào)通路的物質(zhì)為gp130抑制劑或干擾gp130表達(dá)的sirna。上述應(yīng)用中，所述gp130抑制劑為sc144；或所述干擾gp130表達(dá)的sirna的核苷酸序列為序列1。gp130或其配體在制備提高脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述gp130配體為il-6家族細(xì)胞因子；或，所述il6家族細(xì)胞因子為il-6、lif、ct-1或cnt。上述應(yīng)用中，所述il-6家族細(xì)胞因子通過(guò)激活脂肪細(xì)胞中g(shù)p130-stat3信號(hào)通路提高脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物。gp130作為靶點(diǎn)在設(shè)計(jì)或制備干預(yù)和治療肥胖導(dǎo)致的二型糖尿病產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或抑制stat3的表達(dá)的物質(zhì)在制備抑制atx的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。研究工作發(fā)現(xiàn)，gp130介導(dǎo)的jaks-stat3信號(hào)通路對(duì)脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)具有重要的作用。il-6家族細(xì)胞因子(如il-6、lif、ct-1或cntf)可以通過(guò)gp130信號(hào)通路顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)；使用gp130特異性抑制劑sc144抑制gp130信號(hào)通路，可以顯著下調(diào)脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)；使用gp130特異的sirna在脂肪細(xì)胞中敲低gp130同樣可以顯著下調(diào)脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，與正常飲食(nd)小鼠相比較，高脂食物飼喂(hfd)獲得肥胖小鼠的脂肪組織中atx的表達(dá)水平顯著升高，肥胖小鼠血漿中atx和lpa的含量也顯著的增加，并產(chǎn)生胰島素拮抗和高血糖耐受等二型糖尿病特征。使用gp130特異抑制劑sc144處理高脂食物飼喂(hfd)獲得肥胖小鼠，可以顯著下調(diào)脂肪組織中atx表達(dá)，降低血漿中atx和lpa含量，顯著改善肥胖導(dǎo)致的胰島素拮抗和葡萄糖耐量受損等二型糖尿病癥狀。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)揭示了脂肪細(xì)胞中atx高表達(dá)的分子機(jī)制，即il-6家族細(xì)胞因子通過(guò)gp130介導(dǎo)的信號(hào)通路自反饋激活脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)gp130抑制劑處理可以下調(diào)脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)，顯著改善肥胖相關(guān)的血糖代謝異常。在這些研究成果的基礎(chǔ)上，提出了以gp130為靶點(diǎn)干預(yù)和治療肥胖導(dǎo)致的二型糖尿病的新策略。附圖說(shuō)明圖1為脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)依賴于gp130-jak-stat3信號(hào)通路。圖2為il-6家族細(xì)胞因子通過(guò)gp130信號(hào)通路上調(diào)脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)。圖3為口服gp130抑制劑sc144下調(diào)hfd肥胖小鼠脂肪組織中atx的表達(dá)水平和血漿中的atx含量。圖4為口服gp130抑制劑sc144下調(diào)hfd肥胖小鼠血漿中l(wèi)pa的含量。圖5為口服gp130抑制劑sc144顯著改善hfd肥胖小鼠的胰島素拮抗與葡萄糖耐量受損癥狀。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。部分材料如下：表1為試劑與抗體下述實(shí)施例中采用的方法部分如下：一、mrna水平檢測(cè)1、rna提取1)細(xì)胞rna提?。篴)收集細(xì)胞樣品，用pbs溶液洗滌2遍，然后離心去上清。b)在沉淀中加入1ml的trizol溶液，吹打混勻，室溫靜置5分鐘。c)加入氯仿(0.2ml/1mltrizol)，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩15秒。d)室溫靜置5分鐘，12000g，4℃離心15分鐘。e)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，混勻后放置10分鐘。f)12000g，4℃離心10分鐘，棄上清。g)加入1ml的75％乙醇洗滌一次，7500g，4℃離心5分鐘，棄上清，沉淀烘干10分鐘。h)加入20μldepc水溶解沉淀，放置于60℃水浴鍋溶解10分鐘。i)通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量rna濃度，將制備好的樣品凍于-80℃冰箱儲(chǔ)存。2)組織rna提?。篴)將組織使用滅菌小剪刀剪碎，加入1mltrizol，使用勻漿器打勻b)加入氯仿(0.4ml/1mltrizol)，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩15秒。c)室溫靜置5分鐘，12000g，4℃離心15分鐘。d)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，混勻后放置10分鐘。e)12000g，4℃離心10分鐘，棄上清。f)加入1ml的75％乙醇洗滌一次，7500g，4℃離心5分鐘，棄上清，沉淀烘干10分鐘。g)加入40μldepc水溶解沉淀，放置于60℃水浴鍋溶解10分鐘。h)通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量rna濃度，將制備好的樣品凍于-80℃冰箱儲(chǔ)存。2、rt-qpcr取2μgrna，加入2μl引物，70℃處理10分鐘，立即放在冰上冷卻。按照以下體系進(jìn)行混合：加入m-mlv5×緩沖液5μl，dntps(10mm)1μl，rnaseinhibitor0.5μl，m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，補(bǔ)入depc水至終體積25μl，將混合溶液放于42℃水浴中反應(yīng)1小時(shí)，72℃滅活10分鐘，凍存于-20℃冰箱儲(chǔ)存。根據(jù)iqsybrgreensupermix(bio-rad)的操作手冊(cè)，利用bio-rad的icycleiqreal-timepcr儀器對(duì)目的基因檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)bio-radiq5分析軟件進(jìn)行檢測(cè)。3、引物序列如表2。表2二、檢測(cè)蛋白表達(dá)水平1、蛋白提取1)細(xì)胞蛋白提取：a)收集細(xì)胞，1500rpm離心5分鐘，棄除上清，用預(yù)冷的pbs清洗細(xì)胞沉淀兩次；b)吸干殘余的pbs，加入適量的細(xì)胞裂解液ripa，吹打混勻，冰浴裂解30分鐘；c)12000rpm，4℃離心20分鐘，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中；2)組織蛋白提取：a)收集組織，使用pbs洗干凈，用滅菌小剪刀剪碎，加入適量ripa(含蛋白酶抑制劑)后使用勻漿器打碎。b)冰浴裂解30分鐘；c)12000rpm，4℃離心20分鐘，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。2、bca蛋白濃度定量試劑盒說(shuō)明1)將溶液a和溶液b根據(jù)體積比50：1配置成bca工作液，充分混勻；2)將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋至不同的濃度梯度3)在200μlbca工作液中加入20μl測(cè)量樣品，充分混勻，37℃反應(yīng)30分鐘；4)用分光光度計(jì)選用bca測(cè)量模式進(jìn)行測(cè)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、免疫印跡雜交(westernblot)1)電泳配置sds-page蛋白膠，取40μg樣品蛋白加入上樣緩沖液中，沸水浴5分鐘，12000rpm離心2分鐘，冷卻后離心取上清上樣。先用80v恒壓電泳，等溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后換成120v電壓進(jìn)行電泳。2)轉(zhuǎn)膜將pvdf膜用甲醇活化15秒，然后放入蒸餾水中浸泡5分鐘，再放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。按照bio-rad濕轉(zhuǎn)儀方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，120v，300ma60分鐘。3)封閉與抗體孵育(1)取出pvdf膜，用ttbs洗滌一次，放入封閉液(5％bsa)中室溫孵育1小時(shí)；(2)用ttbs洗滌3次，每次5分鐘，放入一抗稀釋液中4℃孵育過(guò)夜(8小時(shí)左右)；(3)用ttbs洗滌3次，每次5分鐘，放入二抗稀釋液中室溫孵育1小時(shí)；4)取出膜，用ttbs洗滌3次，ecl發(fā)光顯色。三、sirna轉(zhuǎn)染1、轉(zhuǎn)染1)根據(jù)吉瑪公司說(shuō)明書，將合成的sirna加入150μl無(wú)rnase水溶解至濃度(20μm)，分裝凍存于-80℃。2)根據(jù)lipofectamine2000說(shuō)明書進(jìn)行sirna轉(zhuǎn)染，具體步驟如下(以35mm培養(yǎng)皿為例)：(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前用更換新鮮培養(yǎng)基；(2)用250μlopti-mem培養(yǎng)基稀釋sirna至終濃度為25nm或50nm；同時(shí)用250μlopti-mem培養(yǎng)基稀釋5μllipofectamine2000，輕輕混合，室溫放置5分鐘；(3)將sirna和lipofectamine2000輕輕混合，室溫放置20分鐘，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。3)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞的rna或者總蛋白，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、sirna序列sirna由上海吉馬公司按照表3中序列進(jìn)行合成。表3為sirna序列g(shù)p130sirna5′-acgacuuaggacuaucuuaaa-3′(序列1)stat1sirna5′-gccaaggaggagaucuccgaagaua-3′stat3sirna5′-cuggauaacuucauuagca-3′ncsirna5’-uucuccgaacgugucacgu-3’四、脂質(zhì)的抽提和質(zhì)譜檢測(cè)脂質(zhì)抽提：玻璃離心管中加入0.5mlpbs，加入100μl14:0lpa(5μm)作為內(nèi)標(biāo)，之后加入3ml甲醇/氯仿(2：1)。向上述溶液中加入50μl血漿和15μl6nhcl，漩渦混勻后冰上放置10分鐘。加入1ml氯仿，1.3ml蒸餾水，混勻，室溫1750g離心10分鐘，取下層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，?50μl甲醇/水(9：1)溶解，取樣上機(jī)檢測(cè)。脂質(zhì)的分離和檢測(cè)：使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(lc-ms)法，通過(guò)液相色譜法分離脂質(zhì)分子，利用質(zhì)譜進(jìn)行定量檢測(cè)。具體方法：使用c18hplc柱(5μm，2.1mmidx20mm，tr-0121-c185)進(jìn)行脂質(zhì)分離，體系含有兩種流相，流相a：含有10mm甲酸銨的異丙醇/乙腈/甲酸(90:10:0.1，v/v/v)；流相b：甲醇/h2o/nh4oh(90:10:0.1，v/v/v)。流程包括：(1)以100μl/min-100％流相b灌流3min；(2)在1min內(nèi)將流速由100μl/min增至300μl/min，同時(shí)流相由100％流相b變?yōu)?0％流相b；(3)以300μl/min-50％流相b的灌流6min；(4)在1min內(nèi)將流速由300μl/min降至100μl/min，同時(shí)流相由50％流相b變?yōu)?00％流相b；(5)以100μl/min-100％流相b灌流1min。使用qtrap4500質(zhì)譜檢測(cè)儀(api4500qtrapmassspectrometer)進(jìn)行l(wèi)pa定量檢測(cè)。五、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖測(cè)定斷糧不斷水饑餓小鼠過(guò)夜，之后進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，具體流程如下：1)胰島素耐量試驗(yàn)：剪鼠尾取血檢測(cè)記錄0h時(shí)間點(diǎn)血糖水平，腹腔注射胰島素(0.75u/kg)，之后每15分鐘檢測(cè)一次小鼠血糖含量，記錄120分鐘內(nèi)的血糖變化；2)葡萄糖耐量試驗(yàn)：剪鼠尾取血檢測(cè)記錄0h時(shí)間點(diǎn)血糖水平，腹腔注射葡萄糖(1g/kg)，之后每15分鐘檢測(cè)一次小鼠血糖含量，記錄120分鐘內(nèi)的血糖變化。購(gòu)買羅氏(roche)血糖檢測(cè)儀和血糖檢測(cè)試紙進(jìn)行血糖檢測(cè)。實(shí)施例1、脂肪細(xì)胞的獲得和檢測(cè)一、脂肪細(xì)胞的獲得3t3-l1鼠源前脂肪細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。誘導(dǎo)3t3-l1前脂肪細(xì)胞分化生成脂肪細(xì)胞的方法參考文獻(xiàn)提供的cocktail法，具體過(guò)程如下：3t3-l1前脂肪細(xì)胞使用含有10％新牛血清(hyclone)的dmen(macgene)培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入2mml-谷氨酰胺(lifetechnologies)，100μg/ml鏈霉素(lifetechnologies)和100u/ml青霉素(lifetechnologies)。當(dāng)3t3-l1前脂肪細(xì)胞分裂生長(zhǎng)至接觸抑制劑為0天，開始分化過(guò)程。使用10％胎牛血清(hyclone)dmem+胰島素(insulin,1μg/ml)+地塞敏松(dex,0.25μm)+3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ibmx,0.5mm)復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，更換為10％胎牛血清(hyclone)dmem+胰島素(insulin,1μg/ml)復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)，每48小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基直到3t3-l1細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生甘油三酯脂滴,誘導(dǎo)分化8天后獲得成熟的脂肪細(xì)胞。二、脂肪細(xì)胞的檢測(cè)1、脂滴積累檢測(cè)體外誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3t3-l1分化成熟，誘導(dǎo)8天后油紅染色觀察到細(xì)胞中有明顯的脂滴積累(圖1a)，證明體外誘導(dǎo)獲得了成熟脂肪細(xì)胞。2、ppar-γ表達(dá)檢測(cè)提取成熟的脂肪細(xì)胞的蛋白，免疫印跡雜交，一抗為ppar-γ(作為脂肪細(xì)胞細(xì)胞分化的標(biāo)志基因)抗體，結(jié)果如圖1b右圖所示，可以看出，脂肪細(xì)胞表達(dá)ppar-γ，證明得到成熟脂肪細(xì)胞。3、脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞中atx的mrna和蛋白表達(dá)水平以及p-stat3和stat3水平的檢測(cè)。分別提取上述成熟的脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞的總rna作為模板，用atx引物(表2)進(jìn)行rt-pcr(方法為前面所述)，檢測(cè)細(xì)胞中atxmrna的表達(dá)水平。通過(guò)免疫印跡檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的atx蛋白水平；分別制備成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞的裂解液，通過(guò)免疫印跡雜交檢測(cè)細(xì)胞中p-stat3和stat3的水平。免疫印跡檢測(cè)一抗分別為抗atx、p-stat3、或stat3抗體。結(jié)果如圖1b所示，與前脂肪細(xì)胞相比，成熟脂肪細(xì)胞中p-stat3水平升高，atx的mrna和蛋白表達(dá)水平也都顯著提高。實(shí)施例2、阻斷gp130-stat3信號(hào)通路在抑制脂肪細(xì)胞atx表達(dá)中的應(yīng)用一、gp130抑制劑處理和使用特異性sirna敲低gp130可以降低脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)1、gp130抑制劑處理gp130抑制劑sc144處理組：將溶解在dmso中sc144加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，以終濃度為10μm的sc144處理成熟脂肪細(xì)胞24小時(shí)；dmso對(duì)照組：使用與實(shí)驗(yàn)組相同體積的dmso，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中處理成熟脂肪細(xì)胞24小時(shí)。分別提取上述gp130抑制劑sc144處理組和dmso對(duì)照組細(xì)胞的rna作為模板，用atx引物(表2)進(jìn)行rt-pcr(方法為前面所述)，檢測(cè)細(xì)胞中atxmrna的表達(dá)水平。通過(guò)免疫印跡檢測(cè)gp130抑制劑sc144處理組和dmso對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的atx蛋白水平；分別制備兩組細(xì)胞的裂解液，通過(guò)免疫印跡雜交檢測(cè)細(xì)胞中p-stat3和stat3的水平。免疫印跡檢測(cè)一抗分別為抗atx、p-stat3、或stat3抗體。結(jié)果如圖1c所示，與dmso對(duì)照組相比較，gp130抑制劑sc144處理組細(xì)胞中的gp130下游stat3活化程度(即p-stat3的水平)顯著降低，atx的mrna和蛋白表達(dá)水平被顯著抑制。2、gp130sirna處理ncsirna對(duì)照組：使用lipofectamine2000將ncsirna按照前面的方法轉(zhuǎn)染入成熟脂肪細(xì)胞，sirna轉(zhuǎn)染濃度100nm，sirna處理成熟脂肪細(xì)胞48小時(shí)。gp130sirna處理組:使用lipofectamine2000將gp130sirna轉(zhuǎn)染入成熟脂肪細(xì)胞，sirna轉(zhuǎn)染濃度100nm，sirna處理成熟脂肪細(xì)胞48小時(shí)。分別提取上述gp130sirna處理組和ncsirna對(duì)照組細(xì)胞的rna作為模板，用atx引物(表2)進(jìn)行rt-pcr(方法為前面所述)，檢測(cè)細(xì)胞中atxmrna的表達(dá)水平。通過(guò)免疫印跡檢測(cè)gp130sirna處理組和ncsirna對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的atx蛋白水平；分別制備兩組細(xì)胞的裂解液，通過(guò)免疫印跡雜交檢測(cè)細(xì)胞中g(shù)p-130、p-stat3和stat3的水平。免疫印跡檢測(cè)一抗分別為抗atx、gp130、p-stat3、或stat3抗體。結(jié)果如圖1d所示，與ncsirna對(duì)照組細(xì)胞相比較，gp130sirna處理組細(xì)胞中的gp130下游stat3活化程度(即p-stat3的水平)顯著降低，atx的mrna和蛋白表達(dá)水平都被顯著抑制。二、stat3抑制劑處理和使用特異性sirna敲低stat3可以降低脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)jaks-stat3是被gp130激活的重要下游的信號(hào)通路。1、stat3sirna處理ncsirna對(duì)照組：使用lipofectamine2000將ncsirna轉(zhuǎn)染入成熟脂肪細(xì)胞，sirna轉(zhuǎn)染濃度100nm，sirna處理成熟脂肪細(xì)胞48小時(shí)。stat1sirna處理組:使用lipofectamine2000將stat1sirna轉(zhuǎn)染入成熟脂肪細(xì)胞，sirna轉(zhuǎn)染濃度100nm，sirna處理成熟脂肪細(xì)胞48小時(shí)。stat3sirna處理組:使用lipofectamine2000將stat3sirna轉(zhuǎn)染入成熟脂肪細(xì)胞，sirna轉(zhuǎn)染濃度100nm，sirna處理成熟脂肪細(xì)胞48小時(shí)。按照前面sirna轉(zhuǎn)染的方法，分別用ncsirna、stat1sirna和stat3sirna轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，得到ncrnai組、stat1sirna組和stat3sirna組細(xì)胞。分別提取上述ncrnai組、stat1sirna組和stat3sirna組細(xì)胞的總rna作為模板，用atx引物(表2)進(jìn)行rt-pcr(方法為前面所述)，檢測(cè)細(xì)胞中atxmrna的表達(dá)水平。通過(guò)免疫印跡分別檢測(cè)ncrnai組、stat1sirna組和stat3sirna組細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的atx蛋白水平；分別制備上述ncrnai組、stat1sirna組和stat3sirna組細(xì)胞的裂解液，通過(guò)免疫印跡雜交檢測(cè)細(xì)胞中stat1和stat3的水平。一抗分別為抗atx、stat1和stat3抗體。結(jié)果如圖1e所示，敲低stat3可以下調(diào)脂肪細(xì)胞中atx的mrna和蛋白表達(dá)水平，而敲低stat1則不能。2、stat3抑制劑s3i-201處理stat3抑制劑處理組:20μms3i-201，溶解在dmso中，處理成熟脂肪細(xì)胞24小時(shí))；dmso對(duì)照組：(使用與實(shí)驗(yàn)組相同體積的dmso，處理成熟脂肪細(xì)胞24小時(shí))分別提取上述stat3抑制劑處理組和dmso對(duì)照組細(xì)胞的總rna作為模板，用atx引物(表2)進(jìn)行rt-pcr(方法為前面所述)，檢測(cè)細(xì)胞中atxmrna的表達(dá)水平。通過(guò)免疫印跡檢測(cè)stat3抑制劑處理組和dmso對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的atx蛋白水平。一抗分別為抗atx抗體。結(jié)果如圖1f所示，與dmso對(duì)照組相比較，stat3抑制劑s3i-201處理組細(xì)胞中atx的mrna和蛋白表達(dá)水平都顯著降低。實(shí)施例3、il-6家族細(xì)胞因子上調(diào)脂肪細(xì)胞atx表達(dá)中的應(yīng)用il-6家族細(xì)胞因子包括il-6、lif、ct-1和cntf等。il-6家族細(xì)胞因子可以通過(guò)gp130受體，激活jak-stat、pi3k-akt和mapk等下游信號(hào)通路，調(diào)控目的基因的表達(dá)。對(duì)實(shí)施例1中體外誘導(dǎo)獲得的脂肪細(xì)胞進(jìn)行如下處理：il-6組細(xì)胞：血清饑餓脂肪細(xì)胞8小時(shí)，將重組鼠源il-6加入脂肪細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為10ng/ml，處理8小時(shí)。lif組細(xì)胞：血清饑餓脂肪細(xì)胞8小時(shí)，將重組鼠源lif加入脂肪細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為10ng/ml，處理8小時(shí)。ct-1組細(xì)胞：血清饑餓脂肪細(xì)胞8小時(shí)，將重組鼠源ct-1加入脂肪細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為10ng/ml，處理8小時(shí)cntf組細(xì)胞：血清饑餓脂肪細(xì)胞8小時(shí)，將重組鼠源cntf加入脂肪細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為10ng/ml，處理8小時(shí)il-6+sc144組細(xì)胞：血清饑餓脂肪細(xì)胞8小時(shí)，使用10μmsc144預(yù)處理脂肪細(xì)胞30分鐘，之后使用重組鼠源il-6(10ng/ml)和sc144(10μm)共同處理成熟脂肪細(xì)胞8小時(shí)。分別提取上述各組細(xì)胞的總rna作為模板，用atx引物(表2)進(jìn)行rt-pcr(方法為前面所述)，檢測(cè)細(xì)胞中atxmrna的表達(dá)水平。分別制備各組細(xì)胞的裂解液，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中p-stat3和stat3的蛋白水平，一抗分別為抗p-stat3和stat3的抗體。結(jié)果如圖2所示，il6家族細(xì)胞因子il-6、lif、ct-1或cntf處理脂肪細(xì)胞，均可以激活提高細(xì)胞中p-stat3蛋白水平，并顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞中atxmrna的表達(dá)(圖2a-d)。使用gp130抑制劑sc144預(yù)處理脂肪細(xì)胞30分鐘后，可以顯著抑制il-6處理組脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)(圖2e)。上述結(jié)果表明，il-6家族細(xì)胞因子可以通過(guò)激活gp130-stat3信號(hào)通路上調(diào)脂肪細(xì)胞中atx的表達(dá)。實(shí)施例4、gp130抑制劑在干預(yù)和治療肥胖導(dǎo)致的血糖代謝疾病中的應(yīng)用一、gp130抑制劑sc144抑制肥胖小鼠脂肪組織中atx的表達(dá)實(shí)驗(yàn)小鼠選取雄性c57bl/6小鼠，小鼠飼養(yǎng)遵循12小時(shí)晝夜飼養(yǎng)周期，小鼠實(shí)驗(yàn)獲得北京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查會(huì)的許可。選取8周齡健康雄性c57bl/6小鼠，分為3組(流程如圖3a左圖)：正常(nd)組：飼喂正常食物，在飼喂7周后口服藥物溶劑(0.9％naclwith40％propyleneglycol：配制40％丙二醇(體積比，丙二醇/h2o)，使用40％丙二醇作為溶劑配制終濃度為0.9％nacl(質(zhì)量體積比，nacl(g)/溶劑(l)))；根據(jù)小鼠體重計(jì)算溶劑服用量；做到與服用的藥物體積相同；肥胖(hfd)組：飼喂高脂食物(hfd,60kcal％fat,researchdiets)，在飼喂7周后口服藥物溶劑(40％丙二醇生理鹽水：配制40％丙二醇(體積比，丙二醇/h2o)，使用40％丙二醇作為溶劑配制終濃度為0.9％nacl(質(zhì)量體積比，nacl(g)/溶劑(l)))；根據(jù)小鼠體重計(jì)算溶劑服用量；做到與實(shí)驗(yàn)組小鼠服用藥物的體積相同，模擬肥胖導(dǎo)致的血糖代謝疾病；肥胖+sc144(hfd+sc144)組：飼喂高脂食物，在飼喂7周后口服p130抑制劑sc144藥物(5mg/kg)；藥物每日處理一次，為期一周。每周稱取小鼠體重，藥物處理一周后，處死小鼠分離獲取脂肪組織和血漿。分別提取上述各組小鼠脂肪組織的總rna作為模板，用atx引物、il-6引物或lif引物(表2)分別進(jìn)行rt-pcr(方法為前面所述)，檢測(cè)脂肪組織中atx、il-6、lif的mrna表達(dá)水平；通過(guò)免疫印跡檢測(cè)各組小鼠血漿中atx蛋白水平，一抗分別為抗atx抗體；通過(guò)免疫印跡檢測(cè)各組小鼠脂肪組織中p-stat3和stat3的蛋白水平，一抗分別為抗p-stat3和stat3的抗體。結(jié)果如圖3所示，與正常飲食(nd)小鼠相比較，高脂食物(hfd)飼喂的肥胖小鼠的脂肪組織中atxmrna水平和血漿中atx蛋白水平都顯著上調(diào)(圖3b、3c)?？诜p130抑制劑sc144處理hfd肥胖小鼠一周，肥胖小鼠的體重沒有發(fā)生明顯改變，但是脂肪組織中atxmrna水平和血漿中atx蛋白水平都顯著下調(diào)，基本回復(fù)到飼喂正常食物(nd)小鼠的水平(圖3a-c)。gp130抑制劑sc144處理顯著下調(diào)hfd肥胖小鼠脂肪組織中的p-stat3水平，但對(duì)stat3總蛋白水平?jīng)]有明顯影響(圖3c)。同時(shí)rt-pcr檢測(cè)各組小鼠脂肪細(xì)胞中il-6和lif的mrna表達(dá)水平，與nd組小鼠相比較，hfd肥胖小鼠脂肪組織中il-6和lif的mrna表達(dá)水平顯著的上調(diào)，但是口服gp130抑制劑sc144對(duì)hfd肥胖小鼠脂肪組織中il-6和lif的mrna表達(dá)水平?jīng)]用顯著的影響(圖3d，3e)。對(duì)各組小鼠血漿樣本進(jìn)行脂質(zhì)抽提，通過(guò)esilcms/ms方法檢測(cè)血漿中l(wèi)pa含量(詳見實(shí)施方法)。檢測(cè)結(jié)果表明，與nd小鼠相比較，hfd肥胖小鼠血漿中l(wèi)pa濃度顯著上調(diào)，口服gp130抑制劑sc144處理可以使hfd肥胖小鼠血漿中總lpa含量回復(fù)到nd小鼠的水平(圖4a)。進(jìn)一步對(duì)各種lpa亞型的檢測(cè)分析，得到了同樣的結(jié)果(圖4c-h)。另外，另一種不受到atx調(diào)控的活性脂類s1p的血漿濃度在nd小鼠和hfd肥胖小鼠之間沒有顯著差異，而且口服gp130抑制劑sc144處理對(duì)于hfd肥胖小鼠血漿中s1p的濃度沒有顯著的影響(圖4b)。上述研究結(jié)果表明，在hfd肥胖小鼠的脂肪組織中g(shù)p130信號(hào)通路的激活導(dǎo)致脂肪細(xì)胞atx表達(dá)上調(diào)，造成血漿中atx和lpa含量增加；口服gp130抑制劑sc144處理可以下調(diào)hfd肥胖小鼠脂肪組織atx的表達(dá)，使血漿中atx和lpa含量恢復(fù)正常。二、胰島素耐量試驗(yàn)和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠選取雄性c57bl/6小鼠，小鼠飼養(yǎng)遵循12小時(shí)晝夜飼養(yǎng)周期，小鼠實(shí)驗(yàn)獲得北京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查會(huì)的許可。選取8周齡健康雄性c57bl/6小鼠，分為4組(流程如圖4a左圖)：正常(nd)組：飼喂正常食物，在飼喂7周后口服藥物溶劑(0.9％naclwith40％propyleneglycol：配制40％丙二醇(體積比，丙二醇/h2o)，使用40％丙二醇作為溶劑配制終濃度為0.9％nacl(質(zhì)量體積比，nacl(g)/溶劑(l)))；根據(jù)小鼠體重計(jì)算溶劑服用量；做到與服用的藥物體積相同；肥胖(hfd)組：飼喂高脂食物(hfd,60％脂肪含量,researchdiets公司生產(chǎn))，在飼喂7周后口服藥物溶劑(40％丙二醇生理鹽水：配制40％丙二醇(體積比，丙二醇/h2o)，使用40％丙二醇作為溶劑配制終濃度為0.9％nacl(質(zhì)量體積比，nacl(g)/溶劑(l)))；根據(jù)小鼠體重計(jì)算溶劑服用量；做到與實(shí)驗(yàn)組小鼠服用藥物的體積相同；肥胖+sc144(hfd+sc144)組：飼喂高脂食物，在飼喂7周后口服p130抑制劑sc144藥物(5mg/kg)；藥物每日處理一次，為期一周。肥胖+ki16425(hfd+ki16425)組：飼喂高脂食物，在飼喂7周后腹腔注射lpa受體1/3(lpar1/3)抑制劑ki16425(5mg/kg)；藥物每日處理一次，為期一周。每周稱取小鼠體重，藥物處理一周后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量(glucosetolerancetest，gtt)和胰島素耐量(insulintolerancetest，itt)實(shí)驗(yàn)(詳見實(shí)施方法)。結(jié)果如圖5所示，口服gp130抑制劑sc144對(duì)hfd肥胖小鼠的體重沒有顯著影響(圖5a)，但是可以顯著地改善hfd肥胖小鼠的胰島素拮抗和葡萄糖耐量受損癥狀(圖5b-c)。lpa受體1/3的抑制劑ki16425處理也具有類似效果(圖5b-c)。上述研究成果表明，gp130是抑制脂肪細(xì)胞atx表達(dá)、干預(yù)肥胖相關(guān)的血糖代謝疾病的新靶點(diǎn)，阻斷gp130信號(hào)通路可以成為治療肥胖相關(guān)的血糖代謝疾病的新策略，gp130抑制劑(如sc144)可以被應(yīng)用于肥胖相關(guān)的血糖代謝疾病的治療。序列表<110>北京師范大學(xué)<120>gp130抑制劑在制備干預(yù)和治療肥胖導(dǎo)致的血糖代謝疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223><400>1acgacuuaggacuaucuuaaa21當(dāng)前第1頁(yè)12