本發(fā)明屬于獸用疫苗佐劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗及其制備方法。

背景技術(shù)：

納米乳是一種液-液分散體系，是由表面活性劑、助表面活性劑、油相及水相構(gòu)成的半透明或透明乳液，亦是一類各向同性、納米級(jí)粒徑的膠體分散體系。納米乳可分為三種類型：ⅰ型油包水型納米乳（w/o型），納米顆粒內(nèi)部為水相，由外部表面活性劑等組成的外膜包裹，分散于油相中；ⅱ型水包油型納米乳（o/w型），納米顆粒內(nèi)部為油相，由外部表面活性劑等組成的外膜包裹，分散于水相中；ⅲ型為雙連續(xù)型納米乳（w/o/w或o/w/o型），是一種過渡狀態(tài)，其形成的油相顆粒水相包裹，同時(shí)也可與其它油滴連接形成油連續(xù)相，包裹介于油相中的水滴。

納米乳佐劑具有其他佐劑不可比擬的優(yōu)勢(shì)，納米乳由于其粒徑較小，通過黏膜部位攝取時(shí)，能夠穿過黏膜下表層，而粒徑大的則定位于黏膜上表層，并且粒徑小的乳粒的轉(zhuǎn)化率顯著高于粒徑大的。納米乳載體系統(tǒng)可以保護(hù)dna免受核酸酶降解，并且由于其所具有的生物降解性與生物相容性，還可避免發(fā)生載體效應(yīng)。此外，納米乳顆粒不僅是樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞的首選吞噬目標(biāo)，而且納米乳顆粒能通過黏膜免疫，直接作用于抗原遞呈細(xì)胞或定植到黏膜表面的微皺，增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬和加工遞呈作用，從而提升抗原誘導(dǎo)效率，提高免疫作用。除此之外，納米乳顆粒具有較強(qiáng)地抗溶解能力，可控制抗原緩慢釋放，延長抗原在體內(nèi)的作用時(shí)間，從而提高抗體的產(chǎn)生。

而現(xiàn)有的納米乳佐劑大多采用鋁鹽、油乳等疫苗佐劑，在使用時(shí)存在較多的副作用，如：導(dǎo)致嚴(yán)重的接種反應(yīng)、形成無菌性化膿損害，產(chǎn)生外部可見的浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死等問題，同時(shí)油乳佐劑、鋁膠佐劑僅能刺激th2型免疫反應(yīng)，免疫效力低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足而提供的一種安全性好，穩(wěn)定性高，免疫效應(yīng)強(qiáng)的一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗及其制備方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10~20份

助表面活性劑10~20份

油相10~20份

水相30~40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為1~2:1~2；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1~2:1~2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為3~5:1~2。

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑10份

油相10份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為1:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:1；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為3:1。

所述的油相為白油，白油與表面活性劑、助表面活性劑的質(zhì)量比為1:1:1。

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的制備方法，其特征在于具有以下步驟：

步驟1）、取所述份量的表面活性劑、助表面活性劑、油相按質(zhì)量比為1:1:1是比例混合均勻，然后緩慢加入無菌滅活豬偽狂犬病毒抗原，制備得到w/o乳劑；

步驟2）、將蘆薈膠緩慢加入到步驟1）中制得的w/o乳劑中，使用恒溫磁力攪拌器不斷攪拌，直到w/o乳劑呈半透明狀，然后緩慢加入cpg寡聚脫氧核苷酸，加入cpg寡聚脫氧核苷酸的同時(shí)進(jìn)行攪拌，直至w/o乳劑呈透明狀；最終制得所述的豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗。

蘆薈含有豐富的營養(yǎng)成分，含大量b族維生素、氨基酸、微量元素及大量糖類、蒽醌類等生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗紫外線輻射、抗病毒、抗氧化、提高機(jī)體免疫機(jī)能等功能。蘆薈對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)活性來自于大分子的糖和糖蛋白，這些大分子的糖的免疫調(diào)節(jié)活性與巨噬細(xì)胞的活化有關(guān)，它能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)生細(xì)胞因子il-6和tnf-α，與ifn-γ一起作用促使no釋放，促進(jìn)表面抗原的表達(dá)。蘆薈膠含有多陰離子分子，對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫有輔助活性，可增強(qiáng)感染傷口局部免疫反應(yīng)。因此，蘆薈作為免疫增強(qiáng)劑、新型免疫佐劑，在提高生產(chǎn)性能、增強(qiáng)畜禽免疫功能、防治畜禽疾病等方面具有廣闊的發(fā)展前景。

cpg寡聚脫氧核苷酸是含有非甲基化cpg（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸序列。cpg基序是具有較強(qiáng)免疫活性的以非甲基化的cpg為基元構(gòu)成的回文序列，其堿基排列大多為5，-pur-pur-cg-pyr-pyr-3，，也稱為免疫刺激序列。cpg寡聚脫氧核苷酸能在動(dòng)物體內(nèi)誘生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，主要包括激活nk細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；刺激b淋巴細(xì)胞增殖，分化及產(chǎn)生免疫球蛋白；誘導(dǎo)分泌il-6、il-12、tnf-α和ifn-γ等多種細(xì)胞因子；誘導(dǎo)抗抗體誘生的細(xì)胞凋亡。所以，它在誘導(dǎo)機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答及調(diào)控免疫應(yīng)答類型（th1和th2型）等方面發(fā)揮重要作用。非脊椎動(dòng)物微生物，包括細(xì)菌、線蟲、軟體動(dòng)物、酵母、昆蟲和原蟲的dna中存在非甲基化的cpg二核苷酸，且其出現(xiàn)頻率較高，平均每16對(duì)二核苷酸出現(xiàn)一次；而在脊椎動(dòng)物dna中，多數(shù)cpg位點(diǎn)均已甲基化（甲基化程度達(dá)80%），非甲基化cpg出現(xiàn)頻率較低，每50~60對(duì)二核苷酸出現(xiàn)一次（稱為cpg抑制）。試驗(yàn)表明，人工涉及合成含有非甲基化cpg基序的寡聚脫氧核苷酸（稱為cpg-odn）和細(xì)菌dna均具有免疫刺激作用，具有優(yōu)良的佐劑特性。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明將蘆薈膠應(yīng)用到疫苗佐劑中，與其他化學(xué)佐劑相比，純天然的蘆薈具有不良反應(yīng)少、毒副作用小、多效性等特點(diǎn)，同時(shí)還具有顯著地免疫調(diào)節(jié)作用，本發(fā)明將蘆薈膠制備成納米佐劑用于豬偽狂犬病毒滅活苗，較傳統(tǒng)的佐劑更安全、更穩(wěn)定，同時(shí)豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗可顯著促進(jìn)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。

2、本發(fā)明在納米乳佐劑配方（表面活性劑、助表面活性劑、油相、水相）的基礎(chǔ)上，將水相常用的蒸餾水改為具有多種藥理活性及顯著免疫調(diào)節(jié)作用的蘆薈膠，同時(shí)加入可誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)、調(diào)控th1和th2兩種免疫應(yīng)答類型的cpg寡聚脫氧核苷酸，不僅彌補(bǔ)了油乳佐劑、鋁膠佐劑僅能刺激th2型免疫反應(yīng)的缺點(diǎn)，同時(shí)還提高了佐劑的免疫效力。

附圖說明

圖1為不同佐劑的豬偽狂犬病毒滅活苗體液免疫檢測(cè)結(jié)果。

圖2為不同佐劑的豬偽狂犬病毒滅活苗細(xì)胞免疫檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗處方的篩選

（1）表面活性劑的篩選

表面活性劑既含有親水基團(tuán)，又含有親油基團(tuán)，因此大部分是兩親性分子，并且表面活性劑的親水親油性質(zhì)可用hlb值表示。本發(fā)明待選的表面活性劑有tween-20、tween-80、span-20、span-80、聚氧乙烯蓖麻油（el-40）、peg-400等，將適量待選的表面活性劑分別與一定量的油相白油混合，恒溫磁力攪拌器不斷攪拌，同時(shí)緩慢加入超純水并不斷攪拌，開始時(shí)體系粘度較低，由于含水量小于含油量，形成油包水（w/o）型納米乳，但是隨著水量的增加，體系粘度突然增加，表面活性劑形成層狀結(jié)構(gòu)，體系出現(xiàn)液晶態(tài)，繼續(xù)滴加蒸餾水，體系又會(huì)突然由粘變稀，此時(shí)w/o型納米乳發(fā)生轉(zhuǎn)相，形成即形成水包油（o/w）型納米乳，o/w型可用超純水無限稀釋直至乳液呈透明狀，此時(shí)，記錄所加入超純水的量。將所得表面活性劑、白油、超純水的量繪制成三元相圖，最終選出的最佳表面活性劑為el-40和peg-400。

為增加納米乳的表面張力及穩(wěn)定性，本發(fā)明擬通過采用混合表面活性劑，即將選出的兩種表面活性劑按照1:1、1:2、1:3、2:1、2:3、3:1、3:2的比例，依據(jù)繪制的偽三元相圖及混合表面活性劑的hlb計(jì)算公式，選出的最佳混合表面活性劑比例。

混合表面活性劑hlb值=（wa×hlba+wb×hlbb）/（wa+wb）

wa、wb分別代表兩種表面活性劑的質(zhì)量百分比，hlba、hlbb分別代表兩種表面活性劑的hlb值。

（2）助表面活性劑的篩選

為調(diào)節(jié)表面活性劑的hlb值及促使膠束的形成，本發(fā)明將選擇短鏈醇如丙二醇、正丁醇作為助表面活性劑。在制備納米乳佐劑時(shí)，將表面活性劑el-40和peg-400混合均勻后，分別與丙二醇、正丁醇及其混合溶液按照1:1、1:2、1:3、2:1、2:3、3:1、3:2的比例混合均勻，然后加入一定量的白油，恒溫磁力攪拌器不斷攪拌，同時(shí)緩慢滴加超純水，邊加邊攪拌，直至乳液成透明狀。根據(jù)表面活性劑、助表面活性劑、白油、超純水的量繪制偽三元相圖，確定表面活性劑的種類及比例。

（3）油相的篩選

本發(fā)明將選好的表面活性劑和助表面活性劑混合后，將其與白油分別按照1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的比例混合均勻，并緩慢加入超純水，邊滴邊攪拌，直至乳液呈透明狀。

（4）水相的篩選

本發(fā)明將選好的表面活性劑、助表面活性劑及油相混勻后，然后分別按照1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的比例緩慢加入蘆薈膠，邊加邊攪拌，當(dāng)乳液呈半透明狀時(shí)停止加入。此時(shí)，將cpg寡聚脫氧核苷酸繼續(xù)按照1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的比例緩慢加入到之前的蘆薈膠乳液中，直至乳液呈透明狀。

篩選結(jié)果：

（1）表面活性劑的篩選結(jié)果

當(dāng)el-40和peg-400的比例為1:1時(shí)，載乳量較多，所形成的乳區(qū)較大。因此確定表面活性劑el-40和peg-400的質(zhì)量比km=1:1時(shí)為最佳配比。

（2）助表面活性劑的篩選結(jié)果

表面活性劑與混合表面活性劑丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比km=1：1時(shí)，所形成的納米乳穩(wěn)定性好，久置不易分層，為納米乳佐劑的最適配比。

（3）油相的篩選

由加水滴定法繪制的偽三元相圖結(jié)果可知，當(dāng)表面活性劑、助表面活性劑、油相的質(zhì)量比km=1:1:1時(shí)，為最佳的納米乳佐劑配方，形成的納米乳能在較大范圍內(nèi)被水稀釋而仍能保持水包油的狀態(tài)不被破壞。

（4）水相的篩選結(jié)果

經(jīng)加水滴定法確定的蘆薈膠納米乳佐劑的最終質(zhì)量比為：表面活性劑（el-40、peg-400）：助表面活性劑（丙二醇、正丁醇）：油相（白油）：水相（蘆薈膠、cpg寡聚脫氧核苷酸）=1:1:1:4。

豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的制備方法

（1）豬偽狂犬病毒抗原的純化

取少量偽狂犬病毒感染豬病料，制成病料懸液，與dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液以1:5比例接種至單層的pk-15細(xì)胞，37℃孵育1.5h，換細(xì)胞培養(yǎng)維持液培養(yǎng)18h后，按tischer法加入適量300mmol/ld-氨基葡萄糖于相同條件下處理30min，棄去d-氨基葡萄糖，pbs輕洗2次，換含2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，收獲病毒。0.2%甲醛37℃滅活48h，經(jīng)無菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)。

（2）豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的制備

步驟1）、取所述份量的表面活性劑、助表面活性劑、油相按質(zhì)量比為1:1:1是比例混合均勻，然后緩慢加入無菌滅活豬偽狂犬病毒抗原，制備得到w/o乳劑；

步驟2）、將蘆薈膠緩慢加入到步驟1）中制得的w/o乳劑中，使用恒溫磁力攪拌器不斷攪拌，直到w/o乳劑呈半透明狀，然后緩慢加入cpg寡聚脫氧核苷酸，加入cpg寡聚脫氧核苷酸的同時(shí)進(jìn)行攪拌，直至w/o乳劑呈透明狀；最終制得所述的豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗。

實(shí)施例2、豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的質(zhì)量評(píng)價(jià)

（1）根據(jù)水溶性染料亞甲基藍(lán)和油溶性染料蘇丹紅在納米乳中擴(kuò)散快慢來判斷疫苗的類型。亞甲基藍(lán)呈藍(lán)色，易在水相中擴(kuò)散；蘇丹紅呈紅色，易在油相中擴(kuò)散；在豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗中，若藍(lán)色染料擴(kuò)散比紅色染料快則為o/w型納米乳滅活苗，反之則為w/o型納米乳滅活苗，若兩者擴(kuò)散速度一樣則為雙連續(xù)型納米乳滅活苗。

（2）黏度測(cè)定：用1ml玻璃吸管，（下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm），在25℃環(huán)境中吸取豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗1ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時(shí)間，測(cè)定三次，取平均值。

（3）穩(wěn)定性檢測(cè)：吸取制備的豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗于10ml離心管中，以3000r/min離心30分鐘，觀察是否有水相析出。

（4）豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗粒徑分析：用bt-9300s型激光粒度分布儀檢測(cè)所制備的蘆薈膠納米乳佐劑粒徑。

豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

（1）乳劑類型檢測(cè)結(jié)果

將亞甲基藍(lán)燃料及蘇丹紅染料同時(shí)滴加在兩杯豬偽狂犬蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗中發(fā)現(xiàn)，兩種染料的擴(kuò)散速度相近，因此判斷本發(fā)明的制備為雙連續(xù)相w/o/w型納米乳佐劑。

（2）黏度測(cè)定結(jié)果

用玻璃吸管吸取豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗1ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所用時(shí)間，平行檢測(cè)3次，測(cè)得豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗黏度平均值為4.6s。

（3）穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

用離心機(jī)以3000r/min的速度離心豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗30分鐘，上層并未有水相析出，說明本發(fā)明制備的豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗比較穩(wěn)定、不易破乳。

（4）納米乳粒徑檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)激光粒度分析儀測(cè)得豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗粒徑為0.056μm。

實(shí)施例3、豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的安全性檢測(cè)

（1）肌肉刺激性檢測(cè)

分別于家兔左、右側(cè)股四頭肌內(nèi)無菌注射1ml豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗和1ml氯化鈉注射液，同時(shí)設(shè)豬偽狂犬白油佐劑滅活苗對(duì)照組。注射豬偽狂犬病毒白油佐劑滅活苗后48h，觀察注射部位股四頭肌的刺激反應(yīng)。豬偽狂犬病毒白油佐劑滅活苗的制備方法為：將94%白油和6%司盤80混合后加1%~2%硬脂酸鋁，滅菌后，加入無菌滅活的豬偽狂犬病毒液和4%吐溫80，25℃以下乳化30min即得豬偽狂犬病毒白油佐劑滅活苗。

（2）熱原檢測(cè)

將1ml38.0℃預(yù)熱的豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗在無菌條件下沿家兔耳緣靜脈緩慢注入，空白對(duì)照組注射1ml生理鹽水，同時(shí)設(shè)豬偽狂犬白油佐劑滅活苗對(duì)照組，每組3只家兔。在注射后每隔半小時(shí)測(cè)一次體溫，測(cè)定6次，用6次體溫中的最高值減去正常體溫，即為體溫的升高值。根據(jù)體溫的升高值來檢查疫苗熱原是否合格。

（3）毒性試驗(yàn)

將1ml豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗分點(diǎn)注入28~50日齡易感豬雙側(cè)耳根后，同時(shí)設(shè)豬偽狂犬白油佐劑滅活苗對(duì)照組，連續(xù)觀察10日，觀察試驗(yàn)豬有無毒性反應(yīng)。

豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的安全性檢測(cè)結(jié)果

（1）肌肉刺激性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗組家兔注射部位無明顯的變化，而豬偽狂犬白油佐劑滅活苗組家兔的注射部位肌肉出現(xiàn)重度充血、紅腫現(xiàn)象。說明白油佐劑具有較大的肌肉刺激性。

（2）熱原檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組試驗(yàn)家兔的體溫都有所升高，但豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗組家兔的平均體溫升高值為0.3℃，而豬偽狂犬白油佐劑滅活苗組家兔的平均體溫升高值為0.7℃，超過《中國藥典》規(guī)定的0.6℃，所以熱原檢查結(jié)果不合格，如表1所示。

表1熱原檢測(cè)結(jié)果

（3）毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗和豬偽狂犬白油佐劑滅活苗均對(duì)試驗(yàn)豬無明顯的毒性。

實(shí)施例4、豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的體液免疫實(shí)驗(yàn)

12只28日齡試驗(yàn)仔豬經(jīng)elisa檢測(cè)prv抗原、抗體均為陰性。平均分為豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗和豬偽狂犬病毒白油佐劑滅活苗組2組。每組每頭豬頸部肌肉注射疫苗1ml，在接種后的0、7、14、21、28、35、42、49、56、63d，進(jìn)行耳靜脈采血，分離血清，elisa法檢測(cè)血清內(nèi)豬偽狂犬病毒抗體滴度。

豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗體液免疫檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，以蘆薈膠納米乳為佐劑的豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，在接種后的第4周達(dá)到抗體效價(jià)高峰，抗體高峰維持時(shí)間較長；而豬偽狂犬白油佐劑滅活苗在接種后的第5周達(dá)到抗體高峰，且高峰時(shí)的抗體效價(jià)明顯低于豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗組，抗體效價(jià)高峰維持時(shí)間短，抗體下降快。說明豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗能顯著促進(jìn)機(jī)體的體液免疫。

實(shí)施例5、豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的細(xì)胞免疫試驗(yàn)

12只28日齡試驗(yàn)仔豬經(jīng)elisa檢測(cè)prv抗原、抗體均為陰性。平均分為豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗和豬偽狂犬病毒白油佐劑滅活苗組2組。每組每頭豬頸部肌肉注射疫苗1ml，在首免后的7、14、21、28采取外周抗凝血，分離外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)刀豆蛋白cona進(jìn)行誘導(dǎo)刺激后，mtt法檢測(cè)豬外周淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的細(xì)胞免疫檢測(cè)結(jié)果

如圖2所示，豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗免疫豬的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯高于白油佐劑滅活苗，且在14d時(shí)達(dá)到高峰，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化維持時(shí)間較長。說明豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗可顯著促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫。

實(shí)施例6、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑10份

油相10份

水相30份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為1:2；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為3:1。

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的制備方法，其特征在于具有以下步驟：

步驟1）、取所述份量的表面活性劑、助表面活性劑、油相按質(zhì)量比為1:1:1是比例混合均勻，然后緩慢加入無菌滅活豬偽狂犬病毒抗原，制備得到w/o乳劑；

步驟2）、將蘆薈膠緩慢加入到步驟1）中制得的w/o乳劑中，使用恒溫磁力攪拌器不斷攪拌，直到w/o乳劑呈半透明狀，然后緩慢加入cpg寡聚脫氧核苷酸，加入cpg寡聚脫氧核苷酸的同時(shí)進(jìn)行攪拌，直至w/o乳劑呈透明狀；最終制得所述的豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗。

以下實(shí)施例中豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗的制備方法與實(shí)施例6相同，不再贅述。

實(shí)施例7、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑20份

助表面活性劑20份

油相20份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例8、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑20份

油相20份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為3:2。

實(shí)施例9、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑20份

助表面活性劑10份

油相20份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例10、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑20份

助表面活性劑20份

油相10份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例11、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑20份

助表面活性劑20份

油相20份

水相30份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例12、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑20份

助表面活性劑10份

油相10份

水相30份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例13、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑20份

油相10份

水相30份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例14、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑10份

油相20份

水相30份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例15、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑10份

油相10份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例16、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑10份

油相20份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例17、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑20份

油相10份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例18、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑10份

助表面活性劑20份

油相20份

水相30份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例19、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑20份

助表面活性劑10份

油相10份

水相40份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。

實(shí)施例20、

一種豬偽狂犬病毒蘆薈膠納米乳佐劑滅活苗，其特征在于：包括以下重量份數(shù)的原料組成：

表面活性劑20份

助表面活性劑10份

油相20份

水相30份

所述的表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的混合物，所述聚氧乙烯蓖麻油el-40和peg-400的質(zhì)量比為2:1；

所述助表面活性劑為丙二醇和正丁醇的混合物，所述丙二醇和正丁醇的質(zhì)量比為1:2；

所述的水相為蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸的混合物，所述的蘆薈膠和cpg寡聚脫氧核苷酸其質(zhì)量比為5:2。