本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有人胰高血糖素樣肽-1類似物的藥物組合物及其制備方法，以及該藥物組合物在治療高血糖癥和/或糖尿病方面的用途。

背景技術(shù)：

糖尿病是一類因胰島素分泌不足或胰島素作用障礙，導(dǎo)致血糖過高、出現(xiàn)尿糖，甚至?xí)l(fā)一系列代謝紊亂的慢性疾病。如果糖尿病不能得到及時有效的治療，還會引起酮癥酸中毒、心血管疾病、腎衰竭以及視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥。糖尿病已成為繼腫瘤、心血管疾病之后又一個嚴(yán)重危害人類生命健康的慢性疾病。目前，我國糖尿病患者人數(shù)已達1億，約占全球糖尿病人總數(shù)的三分之一，其中2型糖尿病患者占90％以上。

目前，治療2型糖尿病的藥物需要長期服用，主要有二甲雙胍類、α糖苷酶抑制劑、磺酰脲類、列奈類、噻唑烷二酮類等化合物藥物，以及胰島素、人胰高血糖素樣肽-1類似物等生物藥，雖然這些化合物藥物短時間內(nèi)在降低血糖水平方面具良好療效，但是副作用較大，長期使用會因胰島素分泌過度導(dǎo)致胰島細胞功能衰竭。胰島素和人胰高血糖素樣肽-1類似物等生物藥在治療糖尿病相對于化合物藥物在副作用方面有一定優(yōu)勢，但需要通過注射給藥，，注射給藥的方式給患者長期使用帶來諸多不便。

exendin-4是從美國西南部與墨西哥北部地區(qū)的希拉毒蜥(helodermasuspectum)唾液中分離出來的一種39個氨基酸多肽，與哺乳動物以高血糖素樣多肽-1(glucagonlikepeptide-1，glp-1)的氨基酸同源性為53％，分子量為4186.57。多種動物模型表明胰腺glp-1受體對exendin-4和glp-1有相同的親和力，并且這兩種多肽具有同樣的刺激glp-1受體的功能。因此，exendin-4作為glp-1類似物，是glp-1受體的拮抗劑，具有促進胰腺β細胞增殖、改善其功能，以及促進胰島素分泌，增加機體對胰島素的敏感性和延緩胃排空、降低食欲，且不易被dpp-ⅳ降解，可顯著改善2型糖尿病患者的空腹及餐后血糖水平。

艾塞那肽是exendin-4的人工合成物，艾塞那肽注射液(byetta)1天兩次皮下注射；艾塞那肽緩釋微球(bydureon)一周注射一次。但是，艾塞那肽體內(nèi)半衰期只有2.4h，需要頻繁注射，且注射疼痛，導(dǎo)致患者順應(yīng)性較差；此外，注射劑使用不便以及可能會產(chǎn)生藥物注射副作用(如腸胃道反應(yīng)、增加胰腺炎、甲狀腺癌的患病風(fēng)險等)，且制造過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。目前，exendin-4也可通過現(xiàn)有公知的基因工程重組技術(shù)制備得到，較人工合成的具有生產(chǎn)成本更低，可滿足大規(guī)模生產(chǎn)的特點

經(jīng)口給藥的蛋白質(zhì)和多肽類藥物成為一種理想的改變給藥途徑。然而，蛋白質(zhì)多肽類藥物經(jīng)口給藥后，會面臨肝臟首過效應(yīng)、胃腸道內(nèi)蛋白酶降解等問題，導(dǎo)致其生物利用度低。

口腔黏膜作為一種較常見的給藥方式，給藥方便，患者依從性高；口腔黏膜面積約200cm²，有豐富的血管，藥物可以通過毛細血管直接進入體循環(huán)，較皮膚藥物更易穿透被吸收；低酶活性，避免胃腸道蛋白酶和酸的降解作用及肝臟首過效應(yīng)，使藥物能更好的被吸收；與鼻黏膜相比，口腔黏膜不易損傷。

盡管口腔黏膜給藥系統(tǒng)已經(jīng)得到了廣泛的研究，但是目前還未有上市的經(jīng)口腔黏膜吸收的蛋白質(zhì)或多肽類藥物，這是因為口腔黏膜特有的生物學(xué)特性所引起的，如上皮屏障、上皮內(nèi)屏障、基底膜屏障等作用，導(dǎo)致口腔黏膜給藥的滲透系數(shù)較低，從而阻礙大分子藥物進入血液循環(huán)；同時，藥物的相對分子量、解離度等也會影響藥物通過口腔黏膜滲透吸收的效果，因而蛋白質(zhì)類藥物的生物利用度較低。此外，口腔內(nèi)上皮表面分泌的黏液及口腔唾液、酶和免疫蛋白等生理環(huán)境，對蛋白質(zhì)類藥物構(gòu)成了酶屏障和擴散屏障。由于exendin-4是大分子物質(zhì)，受口腔黏膜結(jié)構(gòu)和口腔生理環(huán)境的影響，不易通過口腔黏膜直接被吸收進入血液循環(huán)中，例如現(xiàn)有技術(shù)cn103566376a公開了一種包括艾塞那肽和蛋白水解物及多種輔料組成的口腔黏膜劑，但在實驗中發(fā)現(xiàn)，仍難達到理想的臨床利用效果，因此，亟需開發(fā)一種經(jīng)口腔黏膜給藥的exendin-4的新劑型，達到理想的治療效果，替代注射給藥使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從解決現(xiàn)有技術(shù)的不足出發(fā)，提供了一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含人胰高血糖素樣肽-1類似物的藥物組合物及其制備方法，該藥物組合物可用于大規(guī)模生產(chǎn)制備經(jīng)口腔黏膜給藥的人胰高血糖素樣肽-1類似物制劑，該藥用組合物具有、滲透吸收性高、起效快、生物利用度高、患者依從性良好等特點。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有人胰高血糖素樣肽-1類似物的藥物組合物，包含：

1)人胰高血糖素樣肽-1類似物；

2)透明質(zhì)酸酶；

3)一種以上藥學(xué)上可接受的口腔黏膜給藥載體，所述的藥物組合物中黏膜吸附劑的質(zhì)量百分比為1％-99％。所述口腔黏膜給藥載體優(yōu)選一種以上藥學(xué)上的黏膜吸附劑。

所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物是exendin-4，通過現(xiàn)有公知的基因工程重組技術(shù)制備得到的exendin-4，較人工合成的exendin-4具有生產(chǎn)成本更低，可滿足大規(guī)模生產(chǎn)的特點。

所述藥物組合物中exendin-4為5～1000μg，優(yōu)選的，所述藥物組合物中exendin-4為25～500μg。所述藥物組合物中透明質(zhì)酸酶為hph20，酶活性為500～20000u，優(yōu)選的，所述的ph20為人ph20(hph20)，其酶活性為1000～20000u。即hph20以酶活性u計與exendin-4以μg為單位計的配比為0.2-4000，優(yōu)選為2-800。

所述藥物組合物優(yōu)選制備優(yōu)選為溶液體系，如噴霧，溶劑包括水、含醇溶劑等；或者口腔黏膜貼劑等劑型。在溶劑系統(tǒng)中，所述藥物組合物中exendin-4濃度為5～1000μg/ml,優(yōu)選25～500μg/ml。所述藥物組合物中hph20酶活性為500～20000u/ml，優(yōu)選的，所述的hph20酶活性為1000～20000u/ml。

由于exendin-4屬于親水性多肽，分子量約為4.2kd，受口腔黏膜結(jié)構(gòu)和口腔生理環(huán)境的影響，很難直接通過口腔黏膜的上皮細胞間途徑滲透進入血液被吸收。為了使exendin-4能夠經(jīng)口腔黏膜滲透進入毛細血管，增加其滲透吸收量以達到藥物的有效治療濃度是目前需要克服的技術(shù)難題。

本發(fā)明通過大量的實驗意外的發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸酶hph20用于本發(fā)明的口腔黏膜劑中短時間內(nèi)能形成＜200nm的細胞外基質(zhì)孔道，使口腔黏膜的粘滯性降低、滲透性增加，從而促進exendin-4在黏膜中快速擴散滲透，增強毛細血管對其吸收作用，提高exendin-4的生物利用度。同時，hph20能快速被血漿清除，血漿半衰期短，且具有局部作用的特點，黏膜間質(zhì)中的透明質(zhì)酸可在24-48h內(nèi)完全重建，可快速恢復(fù)黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。

現(xiàn)有技術(shù)已知的透明質(zhì)酸酶hph20屬于粘多糖分解酶，皮下注射后能水解細胞間基質(zhì)中的透明質(zhì)酸，幫助皮下注射給藥的生物藥提供生物利用度。由于口腔黏膜給藥途徑不同于皮下注射，透明質(zhì)酸酶hph20在本發(fā)明組合物中所起的作用不等同于其在皮下注射中的作用，同時作為單一的組合物，實驗發(fā)現(xiàn)是與本發(fā)明的藥物間起到了一定的協(xié)同作用才帶來了上述優(yōu)異效果。在實驗中發(fā)現(xiàn)，相對于其他常用的吸收促滲透劑，如膽酸鹽、脂肪酸、醇類和表面活性劑類等，本發(fā)明采用hph20作為exendin-4的口腔黏膜促滲透劑，可解決這些常規(guī)滲透劑長期使用對黏膜的損傷甚至是降解作用，從而可有效避免黏膜發(fā)生炎癥等不良反應(yīng)。

本發(fā)明通過添加hph20，一方面可以可逆地改變口腔黏膜角質(zhì)層屏障作用以促進exendin-4的黏膜滲透吸收，另一方面對口腔黏膜不會形成嚴(yán)重刺激和損害，且黏膜損傷后可以快速恢復(fù)。所述的hph20，可通過現(xiàn)有技術(shù)已知的技術(shù)進行制備。具體的，本發(fā)明采用hph20是通過基因重組技術(shù)制備的可溶性hph20(rhph20)，rhph20是成熟的ph20多肽，所述多肽在c-端缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(gpi)附著位點，使其在在中國倉鼠卵巢(cho)細胞中重組表達表達后，不與cho細胞膜結(jié)合，從而使得rhph20分泌溶解在細胞培養(yǎng)基中。

所述的黏膜吸附劑包括：聚維酮、聚乙烯酸(pva)、聚卡波菲(pc)、卡波姆(cp)、羧甲基殼聚糖，優(yōu)選的，所述藥物組合物中的黏膜吸附劑為聚維酮、羧甲基殼聚糖、卡波姆的一種或組合。為了使藥物組合物能夠有效的滲透通過口腔黏膜，首先需保證組合物能與口腔黏膜接觸，減少口腔環(huán)境對藥物組合物活性成分的影響，因此在藥物組合物中加入黏膜吸附劑，以保證藥物組合物在口腔環(huán)境中藥物活性成分的有效利用率。由于口腔黏膜分泌黏液，黏液主要成分是水，當(dāng)黏膜吸附劑與黏膜接觸時會吸收黏液中的水分，通過物理作用與黏膜接觸并粘附在一起，有助于提高rhph20的利用率以及exendin-4通過黏膜的滲透吸收性。聚維酮是聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的簡稱，可溶于水，粘性高，在液體制劑中可作為粘度調(diào)節(jié)劑、結(jié)晶抑制劑和藥物增溶劑，使藥物組合物可粘附于口腔黏膜上，增強rhph20對黏膜間質(zhì)的降解率，提高exendin-4的滲透率；羧甲基殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性，且無生物毒性，具有良好的水溶性，可作為一種良好的生物材料輸送蛋白質(zhì)多肽類藥物，其不僅可有效維持藥物組合物中的活性成分，而且使上皮組織中的黏蛋白保持濕潤，從而延長藥物組合物中活性成分在黏膜表面的吸收時間，增加exendin-4的穿透口腔黏膜的能力，促進口腔黏膜對exendin-4的吸收；卡波姆作為羧基高分子聚合物，具有很強的生物粘附性，通過產(chǎn)生于聚合物表面大分子鏈間的相互滲透，提高rhph20對黏膜間質(zhì)的降解作用，促使exendin-4的透膜作用，在快速釋藥的同時又可維持藥物活性物質(zhì)的有效濃度。具體的，所述的藥物組合物中黏膜吸附劑的質(zhì)量百分比為1％-99％，優(yōu)選2％-85％，例如每份單獨包裝的液體藥物組合物中，濃度為0.2～50mg/ml，優(yōu)選濃度為0.2～15mg/ml。

所述組合物進一步含有或者不含有一種以上的其他性質(zhì)的輔料，包含一種以上的增稠劑等。所述的增稠劑選自：羧甲基纖維素、羧甲基纖維素納(cmc-na)、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素，優(yōu)選的，所述的增稠劑為cmc-na。cmc-na可以增加藥物組合物的粘度，降低口腔黏液對藥物的粘滯性、減少蛋白酶對藥物活性成分的降解作用；當(dāng)與黏液中的水分結(jié)合后，不僅有利于增加對口腔黏膜的粘合性，而且可增強黏膜吸附劑對黏膜的粘附作用，易于rhph20和exendin-4的釋放，以及促使exendin-4快速穿透黏膜進入血液循環(huán)，增加其血清濃度。具體的，所述的藥物組合物中增稠劑的質(zhì)量百分比為1％-99％，優(yōu)選為1％-35％，例如每份單獨包裝的液體藥物組合物中，cmc-na的濃度為0.1～5mg/ml，優(yōu)選的，所述的cmc-na濃度為0.2～4mg/ml。

上述經(jīng)口腔黏膜給藥的含exendin-4的藥物組合物處方中活性成分與輔料具有較好的兼容性，所包含的輔料種類及用量使得處方在整體上維持exendin-4有效的藥物活性和rhph20對口腔黏膜作用的良好活性；此外，黏膜吸附劑、增稠劑與rhph20對口腔黏膜間質(zhì)的降解作用，以及exendin-4黏膜滲透吸收性具有協(xié)同作用。該藥物組合物配方有利于后續(xù)的制劑生產(chǎn)工藝的開發(fā)，以及通過后續(xù)工藝制備得到符合臨床使用的制劑產(chǎn)品。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種前述經(jīng)口腔黏膜給藥的含有exendin-4的藥用組合物的制備方法，其特征在于包括下述步驟：

1)制備含有黏膜吸附劑(或者進一步含有增稠劑)的混合溶液；

2)將重組制備所得的rhph20蛋白原液加入到步驟1)所制備的混合溶液中，混勻；

3)將重組制備所得的exendin-4蛋白原液加入到步驟2)所制備的混合溶液中，混勻；

4)除菌，即可得到經(jīng)口腔黏膜給藥的含有exendin-4的藥用組合物。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有exendin-4藥用組合物在制備用于治療高血糖癥和/或糖尿病的藥物中的用途，所述的藥物組合物中exendin-4使用量為5～1000μg，優(yōu)選的，所述藥物組合物中exendin-4使用量為25～500μg。由于該藥物組合物中含有黏膜吸附劑、增稠劑和高活性的rhph20，可使藥物活性物質(zhì)exendin-4快速通過口腔黏膜滲透吸收進入血液循環(huán)，并達到有效的血藥濃度，可減少給藥次數(shù)，無給藥疼痛，從而顯著提高患者臨床用藥的依從性，且采用基因工程重組技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)exendin-4和rhph20，可滿足臨床大量用藥的需求，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及有益效果，包括但不限于此：

1、本發(fā)明提供的藥物組合物，通過exendin-4，透明質(zhì)酸酶ph20和黏膜吸附劑組合物用于口腔黏膜給藥，一方面可以可逆地改變口腔黏膜角質(zhì)層屏障作用以促進exendin-4的黏膜滲透吸收，另一方面對口腔黏膜不會形成嚴(yán)重刺激和損害，且黏膜損傷后可以快速恢復(fù)，黏膜吸附劑可使組合物快速粘附到黏膜表面，且快速釋放藥物組合物中活性物質(zhì)，提高活性物質(zhì)的利用率。

2、所提供的一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有exendin-4的藥用組合物，所述藥物組合物含有增稠劑，增加了藥物組合物活性物質(zhì)間的粘性，減少口腔黏液對藥物組合物的粘滯性以及黏液中蛋白酶對藥物活性物質(zhì)的降解作用。

3、所提供的一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有exendin-4的藥用組合物，提高口腔黏膜對親水性多肽的傳導(dǎo)性，使得exendin-4以高濃度快速滲透口腔黏膜進入血液循環(huán)，達到藥物的有效血清濃度，提高了exendin-4的系統(tǒng)生物利用度，可作為exendin-4注射給藥的一種替代使用方式。

4、所提供的一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有exendin-4的藥用組合物在制備用于治療高血糖癥和/或糖尿病的藥物中的應(yīng)用，該藥物組合物配方安全無毒，使用方便，使用過程無毒無刺激，用藥起效快，顯著提高了患者臨床用藥的依從性。

5、實驗發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物是透明質(zhì)酸酶與本發(fā)明的藥物間起到了一定的協(xié)同作用才帶來了上述優(yōu)異效果，相對于透明質(zhì)酸酶和cd20抗體的組合，其難以滿足口腔給藥的臨床效果。

附圖說明

圖1為不同酶活性的rhph20對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性的影響，其中，●、■和▲表示exendin-4的不同濃度，分別為48、280和500μg/ml；pc表示exendin-4通過tr146細胞的滲透系數(shù)。

圖2為不同濃度的黏膜吸附劑對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性的影響，其中，●、■和▲表示exendin-4的不同濃度，分別為48、280和500μg/ml；pc表示exendin-4通過tr146細胞的滲透系數(shù)。

圖3為不同濃度的藥物組合物w，經(jīng)單次口腔黏膜給藥，對自發(fā)性ⅱ型糖尿病kk^ay小鼠血糖(mmol/l)的影響，其中，●表示空白對照，■表示皮下注射0.6μg/kg的exentin-4，◆、▲和※表示藥物組合物w的不同濃度，分別為56、168和504μg/kg。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例使用的含有exendin-4的蛋白質(zhì)原液采用文獻：cn200410062650.5的方法制備，所得蛋白質(zhì)原液含有exendin-4濃度為1.5mg/ml，純度98.0％；使用的含有rhph20的蛋白質(zhì)原液采用文獻：cn200680013224.x的方法制備，所得蛋白質(zhì)原液含有rhph20酶活性為500～20000u/ml，純度98.0％。

實施例1.經(jīng)口腔黏膜給藥的含exendin-4藥物組合物及其制備方法

將重組制備的exendin-4蛋白原液(純度98％，濃度1.5mg/ml)和rhph20蛋白原液(純度98％，活性為500-20000u/ml)分別于室溫或2～8℃下解凍，解凍后于2～8℃保存。

按照下表1中藥物組合物a-x各成分配比，分別準(zhǔn)確稱量黏膜吸附劑和/或增稠劑，用注射用水溶解后配制為混合液，加入解凍后的rhph20蛋白原液，混勻，最后加入exendin-4蛋白原液，攪拌混勻，無菌條件下用孔徑為0.22μm濾膜過濾除菌，分別得到藥物組合物a-x。

表1.藥物組合物a-x各成分配比

實施例2經(jīng)口腔黏膜給藥的含exendin-4藥物組合物中活性成分的檢測

1)檢測藥物組合物a-x中exendin-4的生物學(xué)活性：

采用camp測定法檢測上述藥物組合物a-x中exendin-4生物學(xué)活性，高效液相色譜法(其中，色譜柱采用source5rpc預(yù)裝柱(4.6×150mm，amershambiosciences))檢測exendin-4的純度及濃度。

表2.藥物組合物a-x中exendin-4生物學(xué)活性、純度及濃度

實驗結(jié)果如表2所示，藥物組合物a-x中exendin-4純度均在98％以上，生物學(xué)活性保持較高水平，且濃度基本維持不變。

2)經(jīng)口腔黏膜給藥的含exendin-4藥物組合物中rhph20的活性測試：

根據(jù)中國藥典2010版二部附錄xiic提供的透明質(zhì)酸酶的活性測定方法(濁度法)，檢測上述藥物組合物a-x中rhph20的酶活性。該測定法是基于在酸性條件下透明質(zhì)酸會和血清反應(yīng)形成穩(wěn)定的膠狀物，經(jīng)透明質(zhì)酸酶降解后，反應(yīng)形成的膠狀物減少，變得澄清，以640nm波長測量澄清度，透明質(zhì)酸酶的含量和澄清程度成正比關(guān)系。根據(jù)用rhph20測定參照標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋物產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算rhph20的酶活性。

表3.藥物組合物a-x中rhph20的酶活性

實驗結(jié)果如表3所示，藥物組合物a-x中rhph20酶活性保持較高水平，且純度在98％以上。

由此表明，本發(fā)明制備的經(jīng)口腔黏膜給藥的含exendin-4藥物組合物中活性成分具有較高的生物學(xué)活性，且純度高，且加入增稠劑后可進一步提高exendin-4的生物學(xué)活性及純度，以及rhph20的酶活性和純度。

對比實施例1、含exendin-4藥物組合物及其制備方法

按照表4中a1-a5中各成分配比，其中組合物a1除了不含rhph20、增稠劑cmc-na和黏膜吸附劑，其余各組分及其配比與組合物e的相同；組合物a1+除不含exendin-4、增稠劑cmc-na和黏膜吸附劑，其余組分及其配比與組合物e相同；組合物a2除了不含rhph20，其余各組分及其配比與組合物l的相同；組合物a3除了不含增稠劑cmc-na和黏膜吸附劑，其余各組分及其配比與組合物r的相同；組合物a4除了不含rhph20，其余各組分及其配比與組合物u的相同；組合物a5除了不含增稠劑cmc-na和黏膜吸附劑，其余各組分及其配比與組合物x的相同，采用與實施例1相同的方法制備得到藥物組合物a1-a5。

表4.藥物組合物a1-a5的配方

對比實施例2使用常規(guī)滲透劑代替rhph20的藥物組合物

(1)將脫氧膽酸鈉作為藥物組合物的吸收促滲透劑，按照表5中各成分配比，使用同實施例1相同的方法制備組合物b1-b4。

表5藥物組合物b1-b4的配方

(2)將乳鐵蛋白水解物作為藥物組合物的吸收促滲透劑，濃度為5mg/ml，按照表5中b1各成分配比，使用同實施例1相同的方法制備組合物b5，其中乳鐵蛋白水解物采用文獻：cn103566376a所公開的制備方法。

對比實施例3經(jīng)口腔黏膜給藥的含抗cd20單克隆抗體的藥物組合物

表6含抗cd20單克隆抗體的藥物組合物c

抗cd20單抗，如利妥昔單抗，若要實現(xiàn)口腔黏膜給藥，可根據(jù)表6中組合物c中各成分配比，采用與實施例1相同的方法制備。但是，制備含如此高濃度利妥昔單抗的組合物，需要對抗體進行濃縮，但是濃縮后的抗體易發(fā)生聚集，不能保證抗體活性，并且通過口腔黏膜吸收后，在體內(nèi)容易引起治療性抗體的免疫原性反應(yīng)，此過程中產(chǎn)生的中和性抗體可以使治療性抗體無效。由此可見，在技術(shù)上無法實現(xiàn)經(jīng)口腔黏膜給藥的含抗cd20單抗的藥物組合物的制備及其在治療相關(guān)疾病中的用途。

實施例3exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性體外檢測

采用tr146食管鱗狀癌細胞(來源于atcc)作為口腔粘膜上皮細胞滲透轉(zhuǎn)運模型，以檢測exendin-4的滲透吸收性。采用文獻porteroa.pharmres,2002,19(2):169-174中所述方法：

吸去插入式培養(yǎng)皿上下各室的dmem培養(yǎng)液，用hbss緩沖液清洗tr146細胞。然后在上、下腔室分別加入hbss溶液，平衡1h后，吸出上室hbss溶液，加入2ml供試品(藥物組合物a-x，藥物組合物b1-b4)。按設(shè)定時間從下室取樣100μl，并立即補充等量hbss溶液。采用色譜方法，進樣分析，記錄得到的峰面積(a)，計算各時間點exendin-4的累積滲透量。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)計算以下指標(biāo)：(1)exendin-4表觀滲透系數(shù)：papp＝(dq/dt)/(a×c0)；(2)exendin-4通過插入式培養(yǎng)皿(無細胞時)的滲透系數(shù)：pe-4＝(dq/dt)/(a×c0)；(3)細胞滲透系數(shù)：1/papp＝1/pc+1/pe-4；(4)滲透吸收增強比率：er＝pc(組合物)/pc(對照)。其中dq/dt表示穩(wěn)態(tài)的滲透速率，a是滲透面積(cm²)，c0是指上腔室exendin-4的起始濃度，pc指exendin-4通過細胞的滲透系數(shù)，pe-4指無細胞時插入式培養(yǎng)皿的滲透系數(shù)，pc(組合物)指藥物組合物a-x中exendin-4通過tr146的細胞滲透系數(shù)，pc(對照)指組合物a1-a5中exendin-4通過tr146的細胞滲透系數(shù)，其中藥物組合物e、l、r、u、x的對照組分別為組合物a1和a1⁺、a2、a3、a4和a5。

組合物a1⁺對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透性檢測方法是：吸去插入式培養(yǎng)皿上下各室的dmem培養(yǎng)液，用hbss緩沖液清洗tr146細胞。然后在上、下腔室分別加入hbss溶液，平衡1h后，吸出上室hbss溶液，先加入1ml組合物a1⁺，然后再加入1ml組合物a(濃度為48μ8/ml的exendin-4)。按設(shè)定時間從下室取樣100μl，并立即補充等量hbss溶液。采用色譜方法，進樣分析，記錄得到的峰面積(a)，計算各時間點exendin-4的累積滲透量。

(1)實施例1和對比實施例1各藥物組合物對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞滲透吸收性的影響

表7.實施例1和對比實施例1各藥物組合物對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞滲透吸收性的影響(x±s，n＝3)

實驗結(jié)果如表7所示，藥物組合物a-x中exendin-4具有良好的經(jīng)tr146口腔粘膜上皮細胞的滲透吸收作用；組合物a1缺少rhph20和黏膜吸附劑，使得exendin-4的滲透吸收作用顯著低于藥物組合物a；組合物a1⁺(只含有rhph20)，當(dāng)與組合物a1(只含有exendin-4)分別放入上下室時，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性高于組合物a1，但是仍顯著低于組合物a，表明rhph20與有效成分exendin-4分別使用時，在一定程度上可以促進exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收作用，但是仍顯著低于本發(fā)明的藥物組合物對exendin-4的滲透吸收性；組合物a2、a4含有黏膜吸附劑，使得exendin-4的經(jīng)tr146口腔粘膜上皮細胞的滲透吸收作用略高于組合物a1，但是由于缺少rhpth20，使得exendin-4的滲透吸收作用顯著低于組合物l、u；組合物a3、a5含有rhph20，提高了exendin-4經(jīng)tr146口腔粘膜上皮細胞的滲透吸收作用，且高于組合物a1、a2和a4，但是難以在組合物中形成均一穩(wěn)定的物質(zhì)，仍顯著低于組合物r、x。由此可知，rhph20與黏膜吸附劑、增稠劑對tr146口腔黏膜上皮細胞滲透吸收exendin-4具有協(xié)同作用。

(2)、對比實施例2采用常規(guī)吸收促滲透劑對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性影響

脫氧膽酸鈉作為藥物組合物的吸收促滲透劑時，雖然可改變tr146口腔粘膜上皮細胞脂質(zhì)雙分子層有序結(jié)構(gòu)，使磷脂分子的有序性降低，從而降低tr146口腔黏膜上皮細胞間的黏度和提高黏膜細胞間的通透性，但是，tr146口腔黏膜上皮細胞間形成的孔徑大小有限，不如rhph20降解黏膜細胞間透明質(zhì)酸后所形成的孔徑大，因此exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性較實施例1中exendin-4的低。

乳鐵蛋白水解物作為藥物組合物的吸收促滲透劑時，雖然可以嵌入到tr146口腔黏膜上皮細胞表面，使得exendin-4滲透黏膜，但是，降低tr146口腔黏膜上皮細胞間粘度的能力有限，不如rhph20改變黏膜細胞間緊密連接的作用力強，因此，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性較實施例1中exendin-4的低。

實施例4不同酶活性的rhph20對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性影響

按照表8中d1-d3各組合物配比，其中rhph20酶活性分別為300、600、1000、2000、5000、8000、12000、20000u/ml，采用同實施例1相同的方法制備得到含不同酶活性的rhph20的藥物組合物，并使用同實施例3相同的方法檢測不同酶活性的rhph20對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性的影響。

表8藥物組合物d1-d3的配方

實驗結(jié)果如圖1所示，當(dāng)rhph20酶活性為1000～20000u/ml，可有效促進exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收作用；當(dāng)rhph20酶活性小于1000u/ml時，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收作用較rhph20酶活性為1000～20000u/ml時較低，而在rhph20酶活性小于500u/ml時，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性極低，不能顯著增加exendin-4的生物利用度；當(dāng)rhph20酶活性高于20000u/ml時，不再顯著增加exendin-4的滲透吸收作用。由此得出，rhph20酶活性為1000～20000u/ml時，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性存在劑量依賴性。

實施例5不同濃度黏膜吸附劑對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性影響

按照表9中e1-e3各組合物配比，其中黏膜吸附劑聚維酮k30，其濃度分別為0.2、0.8、1、5、8、12、15、18、25mg/ml，采用同實施例1相同的方法制備得到含不同濃度的黏膜吸附劑的組合物，并使用同實施例3相同的方法檢測不同濃度黏膜吸附劑對exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性的影響。

表9藥物組合物e1-e3的配方

實驗結(jié)果如圖2所示，當(dāng)黏膜吸附劑聚維酮k30的濃度為1～15mg/ml時，可有效促進組合物粘附在口腔黏膜上，并有利于exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收作用，可提高其生物利用度；當(dāng)聚維酮k30的濃度小于1mg/ml時，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收作用很低，表明聚維酮k30濃度過低，不利于組合物的粘附作用，使得exendin-4的滲透吸收作用顯著降低；當(dāng)聚維酮k30的濃度大于15mg/ml時，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性沒有顯著增加，表明聚維酮k30濃度高于15mg/ml時，會顯著增加組合物的粘稠度，使得與口腔黏膜接觸時，粘附力高，影響exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的擴散吸收作用。由此可得，聚維酮k30濃度為1～15mg/ml，exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收性存在劑量依賴性。

此外，當(dāng)黏膜吸附劑卡波姆濃度為0.2～1mg/ml，以及羧甲基殼聚糖濃度為1～5mg/ml時，具有與聚維酮k30濃度為1～15mg/ml時相似的exendin-4經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細胞的滲透吸收作用趨勢圖。

實施例6.經(jīng)口腔黏膜給藥的含exendin-4組合物體內(nèi)藥效實驗

選取60只自發(fā)性ⅱ型糖尿病kk^ay小鼠，隨機分為5組，每組12只。3組待試藥物組的小鼠分別單次口腔黏膜給予實施例1制備的藥物組合物w，分別按照56、168、504μg/kg(分別相當(dāng)于exendin-4為2、6、18μg/kg，參照已有研究的胰島素噴霧劑oral-lyn相對于注射給藥設(shè)定劑量倍數(shù))體重給藥；陽性藥對照組小鼠單次皮下注射給予0.6μg/kg體重exendin-4；空白對照組小鼠單次口腔黏膜給予等量磷酸鹽緩沖液。

其中，空白對照組和待試藥物組的小鼠尾靜脈注射60mg/kg戊巴比妥鈉溶液進行麻醉后，使其在麻醉臺上保持仰臥姿勢，并經(jīng)食管結(jié)扎，口腔黏膜給藥時，保證每只實驗動物處于水平線上的同一位置。將空白對照組和待試藥物組的組合物分別裝載在不同的噴霧瓶中，并將不同組別的組合物噴入到對應(yīng)組別動物的口腔黏膜中，給藥后10min解開食管結(jié)扎。

5組動物分別于給藥前(0h)，首次給藥后1h、2h、3h、4h、5h和6h時，對小鼠進行眼眶取血，用葡萄糖氧化酶法測定其空腹血糖濃度，考察藥物組合物w有效成分exendin-4對自發(fā)性ⅱ型糖尿病kk^ay小鼠血糖濃度的影響。每次取血測定血糖當(dāng)天，在停食3h后給藥，并在取血完成后恢復(fù)進食。

結(jié)果表明，藥物組合物經(jīng)單次口腔黏膜給藥，與皮下單次注射exendin-4，在給藥后1h、2h和3h，與空白對照組相比，均顯著降低自發(fā)性ⅱ型糖尿病kk^ay小鼠的血糖濃度(p<0.05)；高劑量藥物組合物w(504μg/kg)和中劑量藥物組合物w(168μg/kg)在給藥后1h、2h和3h降低小鼠血糖濃度幅度顯著高于皮下單次注射exendin-4；給藥后6h時，高劑量藥物組合物w(504μg/kg)、中劑量藥物組合物w(168μg/kg)和低劑量藥物組合物w(56μg/kg)使得小鼠血糖濃度維持在一個低于皮下單次注射exendin-4的水平；而空白對照組的自發(fā)性ⅱ型糖尿病kk^ay小鼠的血糖濃度一直處于較高水平(見表10、圖3)。

表10藥物組合物w單次口腔黏膜給藥對自發(fā)性ⅱ型糖尿病kk^ay小鼠血糖(mmol/l)的影響

與空白對照組比，*p<0.05；**p<0.01

由此表明，本發(fā)明實施例1制備的經(jīng)口腔黏膜給藥的含exendin-4藥物組合物具有顯著降低糖尿病小鼠血糖濃度的作用，且相較于皮下注射exendin-4，本發(fā)明實施例1制備的藥物組合物可以使小鼠的血糖濃度在較長時間內(nèi)維持在一個較低水平。說明口腔黏膜給藥途徑已經(jīng)實現(xiàn)了藥物exendin-4良好的吸收和利用。

在相同的實驗條件下，藥物組合物a-v和x表現(xiàn)出與藥物組合物w近似的降糖效果，尤以藥物組合物w最佳。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。