本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
：隨著社會(huì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，肥胖和糖尿病等“富貴病”在社會(huì)中呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。為了有效治療這些富貴病，科研人員進(jìn)行了大量的理論研究和藥物開發(fā)，現(xiàn)階段胰島素仍然是應(yīng)用最廣泛最有效的降血糖藥物。由于胰島素的蛋白屬性，口服給藥無法發(fā)揮降血糖的生物活性，多數(shù)糖尿病患者需要每天頻繁注射用藥，給患者的日常生活帶來諸多不便，而且還存在一定的過敏反應(yīng)、感染等風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重的降低了糖尿病患者的生活質(zhì)量。與傳統(tǒng)胰島素皮下注射給藥，胰島素口服給藥是相對(duì)安全、方便、無痛的給藥方式，同時(shí)，口服給藥經(jīng)腸道吸收后，由門靜脈循環(huán)進(jìn)入肝臟，更加符合胰島素的正常生理狀態(tài)。近年來，大量的文獻(xiàn)報(bào)道了利用多糖、聚丙烯酸、聚乳酸、磷脂等載體材料構(gòu)建的口服胰島素納米傳遞系統(tǒng)。殼聚糖作為多糖中的一種，具有非常好的載藥性和小腸吸收效率，在近期被廣泛的研究和報(bào)道。但是，殼聚糖作為一種氨基多糖，本身顯堿性，在制備口服胰島素納米復(fù)合物的過程中，對(duì)胰島素活力產(chǎn)生不可逆的破壞，嚴(yán)重降低胰島素的生物利用度?？v觀現(xiàn)有的口服胰島素納米體系，主要存在著生物利用度低，口服胰島素起效慢，吸收效率不穩(wěn)定等需要改進(jìn)的問題。因此，開發(fā)生物相容性好的高效口服胰島素納米復(fù)合物，提高其生物利用度，提高口服胰島素納米復(fù)合物的吸收效率具有重要研究意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明擬采用改進(jìn)的離子凝膠法，通過正負(fù)電荷相互作用的機(jī)理，制備穩(wěn)定高效的羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物。羅布麻酸性多糖是從羅布麻葉中提取得到的一種酸性多糖，具有羧基殘基coo-,帶負(fù)電荷。先前的研究表明羅布麻酸性多糖具有改善胰島細(xì)胞活力的生物功能（一種羅布麻酸性多糖在治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，專利號(hào)zl2013101362880）。羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物的具體制備方法為：s1：羅布麻酸性多糖溶液，置于磁力攪拌裝置上，同時(shí)滴加胰島素溶液和穿膜肽溶液，制備得到羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物溶液；s2：將制備的羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物溶液中加入凍干保護(hù)劑，冷凍干燥；s3：將凍干得到的羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物粉末分裝到腸溶膠囊中備用。羅布麻酸性多糖溶液，蒸餾水配制，濃度為0.1mg/ml至0.3mg/ml；磁力攪拌裝置的轉(zhuǎn)速為800至1500rpm；胰島素溶液，胰島素包括豬胰島素、牛胰島素等動(dòng)物源胰島素，或者人工重組制備的胰島素，用蒸餾水配制，濃度為0.5至1.0mg/ml，用0.1mhcl調(diào)節(jié)ph值，ph值在3.5-4.6之間；穿膜肽溶液，蒸餾水配制，濃度為0.05至0.2mg/ml；穿膜肽為九聚精氨酸寡肽。胰島素溶液滴加速度為1ml/min至10ml/min。穿膜肽溶液滴加速度為1ml/min至10ml/min。投藥量比例（質(zhì)量比）為羅布麻酸性多糖：胰島素：穿膜肽=1：（4至8）：（0.5至2）。凍干保護(hù)劑選用5%（w/v）海藻糖。本發(fā)明制備的羅布麻酸性多糖-穿膜肽-胰島素納米復(fù)合物有以下幾方面優(yōu)勢(shì)：1）羅布麻酸性多糖本身具有改善胰島細(xì)胞活力的功能（一種羅布麻酸性多糖在治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，專利號(hào)zl2013101362880），輔助胰島素的降血糖功效，提高糖尿病治療效率；2）羅布麻酸性多糖主鏈上的羧基殘基（coo-），可以為胰島素提供酸性微環(huán)境，對(duì)堿性的小腸液起到緩沖作用，保持胰島素的活力；3）穿膜肽（精氨酸九聚體）不僅作為納米材料制備過程中的交聯(lián)劑，還是一種小腸吸收促進(jìn)劑，可以顯著提高納米復(fù)合物的小腸吸收效率；4）另外，本發(fā)明擬通過腸溶膠囊灌胃給藥，避開藥物在胃液中的失活與損失，直接到達(dá)小腸部位被吸收，可以提高藥物的有效吸收，提高口服胰島素的生物利用度。通過本發(fā)明制備得到的羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物組織相容性好，制備方法簡(jiǎn)單，具有更高的生物利用度高的優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1為納米復(fù)合物粒徑測(cè)定結(jié)果圖。圖2為羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物降低sd糖尿病大鼠血糖結(jié)果圖，其中曲線a為生理鹽水對(duì)照組，曲線b為胰島素溶液口服對(duì)照組，曲線c為胰島素溶液皮下對(duì)照組，曲線d為納米復(fù)合物給藥組。具體實(shí)施方式（一）羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物的制備：10ml羅布麻酸性多糖水溶液，0.1mg/ml，放在磁力攪拌器上，加入轉(zhuǎn)子，同時(shí)緩慢加入ph=4的0.8mg/ml胰島素溶液和0.1mg/ml的穿膜肽溶液，加入速度1ml/min，滴加完畢，繼續(xù)攪拌5min。取1ml溶液100k超濾管離心，測(cè)定胰島素包封率，結(jié)果顯示胰島素包封率達(dá)到98%。取1ml溶液在馬爾文粒徑儀上測(cè)定納米粒徑，結(jié)果如圖1所示，粒徑為60nm。（二）羅布麻酸性多糖穿膜肽口服胰島素納米復(fù)合物的降血糖效果評(píng)價(jià)：成年雄性sd大鼠注射55mg/kg鏈脲佐菌素溶液，當(dāng)大鼠血糖濃度高于16.7mmol/l時(shí)，糖尿病大鼠模型誘發(fā)成功。將大鼠隨機(jī)分為5組（n=6），給藥前禁食過夜，各組給藥方案如表格1所示：表格1體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案組別給藥方案給藥途徑胰島素劑量a生理鹽水對(duì)照組膠囊灌胃0iu/kgb胰島素溶液口服對(duì)照組膠囊灌胃10iu/kgc胰島素溶液皮下對(duì)照組皮下注射1iu/kgd納米復(fù)合物給藥組膠囊灌胃10iu/kg分別在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、4、6、8、10h）測(cè)定血糖濃度。根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)血糖水平相對(duì)于初始值的百分率變化評(píng)價(jià)降血糖效果，以0h時(shí)血糖濃度作為100%，繪制血糖相對(duì)濃度-時(shí)間變化曲線。結(jié)果如圖2所示，生理鹽水對(duì)照組（曲線a）于胰島素溶液口服對(duì)照組（曲線b）均沒有明顯的降低血糖的效果，而胰島素溶液皮下對(duì)照組（曲線c）作為陽性對(duì)照具有很好的降低血糖的效果，但是當(dāng)時(shí)間超過6小時(shí)后，大鼠血糖開始上升；納米復(fù)合物給藥組（曲線d）在2小時(shí)過后開始顯著降低大鼠血糖，藥效持續(xù)到10小時(shí)之久。當(dāng)前第1頁12