本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有人甲狀旁腺激素的藥物組合物及其制備方法，以及該藥物組合物在治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面的用途。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破環(huán)而導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的常見的全身性疾病，已嚴(yán)重威脅著中老年人群，尤其是絕經(jīng)后女性的身體健康。目前，全世界約有2億以上人群患有骨質(zhì)疏松，其發(fā)病率已躍居常見病、多發(fā)病的第六位。我國骨質(zhì)疏松患者居于世界首位，約9000萬人，其發(fā)生率在50歲以上的人群中約為15.7％，在60歲以上的人群中約56％，其中絕經(jīng)后婦女發(fā)生率高于男性，為60～70％，一般發(fā)生在婦女絕經(jīng)后的5～10年內(nèi)。隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢，預(yù)計(jì)到2050年將增加到2.21億。

甲狀旁腺激素(parathyroidhormone，pth)是由甲狀旁腺主細(xì)胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟pth含有84個(gè)氨基酸殘基，是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨轉(zhuǎn)換最為重要的激素之一，小劑量間斷給藥能提高骨密度、改善骨質(zhì)量、降低骨折的發(fā)生率。研究表明，n端片段pth(1-34)保留了pth完整肽段的生物學(xué)活性，可促進(jìn)骨生長而有效治療骨質(zhì)疏松癥，臨床應(yīng)用中多采用pth(1-34)治療骨質(zhì)疏松疾病。目前市售的人重組pth(rhpth(1-34))注射液(teriparatide，特立帕肽)需每日皮下注射，頻繁注射易造成患者在身體心理與經(jīng)濟(jì)上的極大負(fù)擔(dān)，影響患者給藥的依從性。因此，改變給藥方式是提高蛋白質(zhì)和多肽類藥物給藥依從性的方式之一。

黏膜給藥作為較常見的給藥方式，具有給藥方便，藥量可控，患者依從性高等優(yōu)點(diǎn)，常用的粘膜給藥方式包括:口腔、鼻腔、直腸、眼等部位粘膜等，口腔黏膜給藥則是粘膜給藥的重要途徑之一。成年人口腔黏膜面積約200cm²，具有豐富的毛細(xì)血管，藥物可以通過毛細(xì)血管直接進(jìn)入體循環(huán)，避免胃腸道蛋白酶和酸的降解作用及肝臟首過效應(yīng)，提高患者依從性的同時(shí)使藥物能更好的被吸收，并達(dá)到預(yù)期的治療效果，因此經(jīng)口腔黏膜給藥是蛋白質(zhì)和多肽藥物給藥方式的重點(diǎn)研發(fā)方向之一。

由于口腔黏膜特有的生物學(xué)特性，如上皮屏障、上皮內(nèi)屏障、基底膜屏障等作用，使得口腔黏膜給藥的滲透系數(shù)較低，一般藥物難以通過口腔黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，以蛋白質(zhì)和多肽藥物為代表的大分子藥物尤為明顯；此外，口腔內(nèi)上皮表面分泌的黏液及口腔唾液、酶和免疫蛋白等生理環(huán)境，對(duì)蛋白質(zhì)和多肽藥物構(gòu)成了酶屏障和擴(kuò)散屏障。因此，蛋白質(zhì)和多肽藥物的生物利用度較低，是該類藥物實(shí)現(xiàn)口腔黏膜給藥首先需要克服的技術(shù)難點(diǎn)。盡管口腔黏膜給藥系統(tǒng)已經(jīng)得到了廣泛的研究，但是針對(duì)蛋白質(zhì)和多肽類藥物的口腔黏膜給藥系統(tǒng)進(jìn)展緩慢，目前還未有上市的經(jīng)口腔黏膜吸收的蛋白質(zhì)或多肽類藥物。

現(xiàn)有技術(shù)未公開rhpth(1-34)口腔黏膜給藥信息，可知rhpth(1-34)作為一種生物大分子多肽藥物，在口腔粘膜給藥過程中受口腔黏膜結(jié)構(gòu)和口腔生理環(huán)境的影響較大，不易通過口腔黏膜直接被吸收進(jìn)入血液循環(huán)中，采用口腔黏膜給藥存在較大技術(shù)困難。因此獲得一種經(jīng)口腔黏膜給藥并能獲得預(yù)期治療效果的rhpth(1-34)的制劑，是現(xiàn)有技術(shù)未解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于從解決現(xiàn)有技術(shù)的不足出發(fā)，首創(chuàng)一種可用于口腔黏膜給藥的含有人甲狀旁腺激素rhpth(1-34)的藥物組合物，該藥物組合物有效成分可以透過口腔黏膜，具有滲透吸收性高的特點(diǎn)，有利于提高藥物生物利用度，可以實(shí)現(xiàn)人甲狀旁腺激素rhpth(1-34)口腔黏膜給藥。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種可用于口腔黏膜給藥的含有人甲狀旁腺激素的藥物組合物，所述藥物組合物為溶液體系，所述藥物組合物包括人甲狀旁腺激素rhpth(1-34)、吸收促滲透劑ph20。

具體的，所述的人甲狀旁腺激素是重組人甲狀旁腺激素(rhpth(1-34))，可通過現(xiàn)有公知的基因工程重組技術(shù)制備。所述藥物組合物中rhpth的質(zhì)量為5～2000μg，所述rhpth可以適合的濃度存在于所述藥物組合物中，優(yōu)選的，所述藥物組合物中rhpth的濃度為50～2000μg/ml，更優(yōu)選的，所述藥物組合物中rhpth濃度為100～1000μg/ml。

發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過程中令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，重組人甲狀旁腺激素(rhpth(1-34))與吸收促滲透劑存在協(xié)同作用。具體的，當(dāng)采用特定種類及酶活性的吸收促滲透劑，可以實(shí)現(xiàn)有效成分口腔黏膜滲透效果明顯提高，有利于實(shí)現(xiàn)提高藥物生物利用度，以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)口腔黏膜給藥起效快等特點(diǎn)。

所述的吸收促滲透劑為透明質(zhì)酸酶，所述的透明質(zhì)酸酶為ph20，優(yōu)選人透明質(zhì)酸酶ph20(hph20)，本發(fā)明所述的透明質(zhì)酸酶可通過現(xiàn)有公知的基因工程重組技術(shù)制備。

由于蛋白質(zhì)/多肽藥物各自性質(zhì)不同，其受口腔黏膜結(jié)構(gòu)和口腔生理環(huán)境的影響程度不一，因此并非所有的蛋白質(zhì)/多肽藥物都適合口腔黏膜給藥，也并非口腔黏膜給藥的蛋白質(zhì)/多肽藥物都可以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的治療效果。因此，實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)關(guān)鍵在于吸收促滲透劑的種類以及rhpth(1-34)與吸收促滲透劑的含量。

具體的，對(duì)于rhpth(1-34)屬于親水性多肽，分子量為4.9kd，屬于大分子藥物，其受口腔黏膜結(jié)構(gòu)和口腔生理環(huán)境的影響較大，單獨(dú)使用很難直接通過口腔黏膜的上皮細(xì)胞間途徑滲透進(jìn)入血液被吸收。為了使rhpth(1-34)能夠穿過口腔黏膜進(jìn)入毛細(xì)血管，增加其滲透量以達(dá)到藥物的有效治療濃度，需在藥物組合物中添加適當(dāng)?shù)奈沾贊B透劑。吸收促滲透劑的種類存在選擇，現(xiàn)有技術(shù)公開了多種具有促滲透作用的化合物，諸如透明質(zhì)酸酶(ph20)、膽酸鹽、脂肪酸、醇類和表面活性劑類等，對(duì)于吸收促滲透劑的選擇需要綜合考量促滲透效果、相容性、不良反應(yīng)等因素，部分滲透劑促滲透效果不佳，無法達(dá)到治療目的，部分促滲透劑長期使用對(duì)可能口腔黏膜造成不可逆損傷甚至是降解作用，從而可發(fā)生炎癥等不良反應(yīng)，各吸收促滲透劑各有優(yōu)劣，綜合看來，透明質(zhì)酸酶(ph20)對(duì)于rhpth(1-34)促滲效果最好。

具體的，透明質(zhì)酸酶(ph20)屬于粘多糖分解酶，其一般體現(xiàn)為中性或者酸性，能水解細(xì)胞間基質(zhì)中的透明質(zhì)酸，并在短時(shí)間內(nèi)能形成＜200nm的細(xì)胞外基質(zhì)孔道，使口腔黏膜的粘滯性降低、滲透性增加，從而促進(jìn)rhpth(1-34)在黏膜中快速擴(kuò)散滲透，增強(qiáng)毛細(xì)血管的吸收作用，提高rhpth(1-34)的生物利用度。同時(shí)，ph20能快速被血漿清除，血漿半衰期短，且具有局部作用的特點(diǎn)，黏膜間質(zhì)中的透明質(zhì)酸可在24-48h內(nèi)完全重建，可快速恢復(fù)黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。因此，透明質(zhì)酸酶(ph20)一方面可逆地改變口腔黏膜角質(zhì)層屏障作用以促進(jìn)rhpth(1-34)的黏膜滲透吸收，另一方面損傷的黏膜可以較快速的恢復(fù)，對(duì)口腔黏膜不會(huì)造成嚴(yán)重的刺激和損害。本發(fā)明所述透明質(zhì)酸酶(ph20)優(yōu)選人透明質(zhì)酸酶(hph20)。更進(jìn)一步的，本發(fā)明采用通過基因重組技術(shù)制備的可溶性hph20(rhph20)為吸收促滲透劑，具體的，rhph20是成熟的ph20多肽，所述多肽在c-端缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(gpi)附著位點(diǎn)，使其在在中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞中重組表達(dá)表達(dá)后，不與cho細(xì)胞膜結(jié)合，從而使得rhph20分泌溶解在細(xì)胞培養(yǎng)基中。

所述吸收促滲透劑透明質(zhì)酸酶(ph20)的用量需控制在合理的范圍。具體的，所述藥物組合物中吸收促滲透劑的酶活性為500～20000u，可以以適當(dāng)?shù)拿富钚詽舛却嬖谟谒幬锝M合物中，優(yōu)選的，所述吸收促滲透劑的酶活性濃度為500～20000u/ml，更優(yōu)選的，所述的吸收促滲透劑酶活性為1000～20000u/ml。

發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，重組人甲狀旁腺激素(rhpth(1-34))、吸收促滲透劑與黏膜吸附劑的種類同樣存在協(xié)同作用，有利于實(shí)現(xiàn)口腔黏膜給藥效果的最優(yōu)化。

所述藥物組合物中的黏膜吸附劑指代具有粘度調(diào)節(jié)作用以保證藥物組合物與口腔黏膜接觸的藥用輔料。由于口腔黏膜分泌黏液/唾液，其使得藥物組合物被稀釋，并部分被吞咽而無法達(dá)到治療效果，加入粘膜吸附劑后，黏膜吸附劑與黏膜接觸時(shí)會(huì)吸收黏液中的水分，通過物理作用與黏膜接觸并粘附在一起，保證組合物在口腔中停留，并能與口腔黏膜充分接觸，減少口腔環(huán)境對(duì)藥物組合物活性成分的影響，因此在藥物組合物中加入黏膜吸附劑，以保證藥物組合物在口腔環(huán)境中的穩(wěn)定性，有助于進(jìn)一步提高rhph20的利用率，并進(jìn)一步提高rhpth(1-34)的滲透通過黏膜。通常前述具有粘度調(diào)節(jié)作用以保證藥物組合物與口腔黏膜接觸的藥用輔料均具有所述協(xié)同作用，優(yōu)選的，所述粘膜吸附劑可以選自聚維酮、卡波姆(cp)、羧甲基殼聚糖、聚乙烯酸、聚卡波非中的一種或兩種以上以任意比例混合所得的組合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用適量的粘膜吸附劑以達(dá)到上述進(jìn)一步提高藥物組合物中的rhpth(1-34)滲透通過黏膜的目的，所述藥物組合物中粘膜吸附劑占質(zhì)量比范圍為0.1％～99.9％，所述粘膜吸附劑可以適當(dāng)?shù)臐舛却嬖谟谒鏊幬锝M合物中，優(yōu)選的，所述的藥物組合物中黏膜吸附劑濃度為0.2～15mg/ml。

可以看出，本發(fā)明通過促滲透劑種類的選擇，以及進(jìn)一步對(duì)粘膜吸附劑種類的選擇，即可以實(shí)現(xiàn)顯著提高rhpth(1-34)在口腔黏膜給藥中顯著提高滲透口腔黏膜的目的，以此進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)人甲狀旁腺激素的口腔黏膜給藥起效快、治療效果好的特點(diǎn)，且患者依從性良好等特點(diǎn)。所述藥物組合物依然可以根據(jù)具體需要進(jìn)一步加入增稠劑、緩沖劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑等輔料中的一種或兩種以上，以進(jìn)一步解決藥物組合物的粘度、穩(wěn)定性等技術(shù)問題，以期進(jìn)一步優(yōu)化藥物組合物的成藥性等各項(xiàng)性能。例如，可以通過加入適量的增稠劑羧甲基纖維素鈉(cmc-na)以進(jìn)一步提高得到的藥物組合物中酶的活性和純度。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種前述可用于口腔黏膜給藥的含有rhpth(1-34)的藥用組合物的制備方法，其特征在于包括下述步驟：

1)制備含有除rhpth(1-34)和吸收促滲透劑之外組分的混合溶液；

2)將重組制備所得的吸收促滲透劑蛋白原液加入到步驟1)制備得到的混合溶液中，混勻；

3)將重組制備所得的rhpth(1-34)蛋白原液加入到步驟2)制備得到的混合溶液中，混勻；

4)過濾除菌得到可用于口腔黏膜給藥的含有rpth(1-34)的藥用組合物。

其中，步驟1)中所述混合溶液為水溶液，所述組分與前一個(gè)發(fā)明目的中所述一致，即可以含有或不含有黏膜吸附劑，也可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步包含但不僅限于粘稠劑、緩沖劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑等中的一種或兩種以上的藥用輔料。

所述方法有利于本發(fā)明所述的含有rhpth(1-34)藥用組合物的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并在生產(chǎn)過程中保證有效成分及其他成分/輔料性質(zhì)的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種含有本發(fā)明所述rpth(1-34)藥物組合物的藥物制劑，所述藥物制劑由本發(fā)明所述rpth(1-34)藥物組合物制備得到。所述藥物制劑包含但不限于噴霧劑、貼膜劑等。

所述含有本發(fā)明所述rpth(1-34)藥物組合物的藥物制劑為本發(fā)明所述rpth(1-34)藥物組合物制備得到，為供臨床使用的藥物制劑。所述藥物制劑可用于口腔黏膜給藥，具有給藥起效快、給藥方便等特點(diǎn)，患者依從性良好。

本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有rhpth(1-34)藥用組合物的藥物制劑在制備用于治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物中的用途。

由于本發(fā)明所述該藥物組合物中含有特定種類和用量范圍的吸收促滲透劑、黏膜吸附劑，可使藥物活性物質(zhì)rhpth(1-34)快速通過口腔黏膜滲透吸收進(jìn)入血液循環(huán)，并達(dá)到有效的血藥濃度，可減少給藥次數(shù)，無給藥疼痛，從而顯著提高患者臨床用藥的依從性，依據(jù)此首創(chuàng)的口腔黏膜給藥的藥物制劑較現(xiàn)有的注射給藥制劑具有更好的臨床應(yīng)用前景。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

1、提供了一種可用于口腔黏膜給藥的含有rhpth(1-34)的藥用組合物，所述藥物組合物通過加入特定種類和特定量的吸收促滲透劑和粘膜吸附劑，以提高rhpth(1-34)對(duì)口腔黏膜的滲透性，有利于提高藥物生物利用度，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)人甲狀旁腺激素的口腔黏膜給藥起效快、患者依從性良好等特點(diǎn)，并達(dá)到預(yù)期的治療效果；

2、提供了一種可用于口腔黏膜給藥含有rhpth(1-34)藥用組合物的制備方法，所述方法適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并在生產(chǎn)過程中保證有效成分及其他成分/輔料性質(zhì)的穩(wěn)定性；

3、提供一種含有本發(fā)明所述rpth(1-34)藥物組合物的藥物制劑，所述藥物制劑由本發(fā)明所述rpth(1-34)藥物組合物制備得到可用于口腔黏膜給藥，具有傳統(tǒng)口腔黏膜給藥起效快、給藥方便等特點(diǎn)，患者依從性良好；

4、提供了一種經(jīng)口腔黏膜給藥的含有rhpth(1-34)的藥用組合物在制備用于治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用，該藥物組合物配方安全無毒，使用方便，使用過程無毒無刺激，用藥起效快，顯著提高了患者臨床用藥的依從性。

附圖說明

圖1不同酶活性的吸收促滲透劑rhph20對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性的影響曲線(●、■和▲表示rhpth(1-34)的不同濃度，分別為100、560和1000μg/ml)；

圖2不同濃度的粘附劑對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性的影響曲線(●、■和▲表示rhpth(1-34)的不同濃度，分別為100、560和1000μg/ml)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例所述含有rhpth(1-34)的蛋白質(zhì)原液采用文獻(xiàn)：sungwl.jbiolchem.1991；266(5):2831-5.的方法制備，所得蛋白質(zhì)原液含有rhpth(1-34)濃度為2mg/ml，純度98.0％；

實(shí)施例所述含有rhph20的蛋白質(zhì)原液采用文獻(xiàn)：cn200680013224.x實(shí)施例2-9公開的方法制備，所得蛋白質(zhì)原液含有rhph20濃度為2mg/ml，純度98.0％。

實(shí)施例所述cd20采用文獻(xiàn)us5736137實(shí)施例ii公開的方法制備，所得蛋白質(zhì)原液含有rhph20濃度為2mg/ml，純度98.0％。

實(shí)施例1

含rhpth(1-34)的藥物組合物

表1.藥物組合物a-x各成分配比

將重組制備的rhpth(1-34)蛋白原液(純度98％，濃度2mg/ml)和rhph20蛋白原液(純度98％，濃度2mg/ml)分別于室溫或2～8℃下解凍，解凍后于2～8℃保存。

按照表1中藥物組合物a-x各成分配比，分別準(zhǔn)確稱量黏膜吸附劑，用注射用水溶解后配制為混合液，加入解凍后的rhph20蛋白原液，混勻，最后加入rhpth(1-34)蛋白原液，攪拌混勻，無菌條件下用孔徑為0.22μm濾膜過濾除菌，分別得到藥物組合物a-x。

依據(jù)制劑生產(chǎn)的需要，可將所得藥物組合物進(jìn)一步按照需要分裝為含有50～2000μgrhpth(1-34)的用藥單元。

對(duì)比實(shí)施例1、含rhpth(1-34)藥物組合物及其制備方法

按照如下表2中a1-a5中各成分配比，其中組合物a1除了不含吸收促滲透劑rhph20、增稠劑cmc-na和黏膜吸附劑，其余各組分及其配比與組合物a的相同；組合物a2除了不含吸收促滲透劑rhph20，其余各組分及其配比與組合物h的相同；組合物a3除了不含增稠劑cmc-na和黏膜吸附劑，其余各組分及其配比與組合物q的相同；組合物a4除了不含吸收促滲透劑rhph20，其余各組分及其配比與組合物t的相同；組合物a5除了不含增稠劑cmc-na和黏膜吸附劑，其余各組分及其配比與組合物x的相同，采用與實(shí)施例1相同的方法制備得到藥物組合物a1-a5。

表2.藥物組合物a1-a5的配方

對(duì)比實(shí)施例2

含cd20的藥物組合物

以cd20為有效成分，按照如下表3中組合物b1各成分配比，采用與實(shí)施例1組合物v相同的處方及方法制備得到含有cd20的藥物組合物。

表3含抗cd20單克隆抗體的藥物組合物

對(duì)比實(shí)施例3

以脫氧膽酸鈉為促吸收滲透劑，按照如下表4中各成分配比，采用與實(shí)施例1中相同方法制備得到含有rhpth(1-34)的藥物組合物c1-c4。

表4藥物組合物c1-c4的配方

實(shí)施例2滲透吸收性檢測

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(porteroa.pharmres,2002,19(2):169-174)，采用tr146食管鱗狀癌細(xì)胞(來源于atcc)作為口腔粘膜上皮細(xì)胞滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型，以檢測實(shí)施例1及對(duì)比實(shí)施例1-4所得藥物組合物的滲透吸收性。

吸去插入式培養(yǎng)皿上下各室的dmem培養(yǎng)液，用hbss緩沖液清洗tr146細(xì)胞。然后在上、下腔室分別加入hbss溶液，平衡1h后，吸出上室hbss溶液，加入2ml供試品(藥物組合物a-x，藥物組合物c1-c4)。按設(shè)定時(shí)間從下室取樣100μl，并立即補(bǔ)充等量hbss溶液。采用色譜方法，進(jìn)樣分析，記錄得到的峰面積(a)，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)rhpth(1-34)的累積滲透量。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)計(jì)算以下指標(biāo)：(1)rhpth(1-34)表觀滲透系數(shù)：papp＝(dq/dt)/(a×c0)；(2)rhpth(1-34)通過插入式培養(yǎng)皿(無細(xì)胞時(shí))的滲透系數(shù)：ppth＝(dq/dt)/(a×c0)；(3)細(xì)胞滲透系數(shù)：1/papp＝1/pc+1/ppth；(4)滲透吸收增強(qiáng)比率：er＝pc(組合物)/pc(對(duì)照)。其中dq/dt表示穩(wěn)態(tài)的滲透速率，a是滲透面積(cm²)，c0是指上腔室rhpth(1-34)的起始濃度，pc指rhpth(1-34)通過細(xì)胞的滲透系數(shù)，ppth指無細(xì)胞時(shí)插入式培養(yǎng)皿的滲透系數(shù)，pc(組合物)指藥物組合物a-x中rhpth(1-34)通過tr146的細(xì)胞滲透系數(shù)，pc(對(duì)照)指組合物a1-a5中rhpth(1-34)通過tr146的細(xì)胞滲透系數(shù)，其中藥物組合物a、h、q、t、x的對(duì)照組分別為組合物a1、a2、a3、a4和a5。

分別使用rhph20與rhpth(1-34)時(shí)，對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透性檢測方法是：吸去插入式培養(yǎng)皿上下各室的dmem培養(yǎng)液，用hbss緩沖液清洗tr146細(xì)胞。然后在上、下腔室分別加入hbss溶液，平衡1h后，吸出上室hbss溶液，先加入1ml酶活性為1000u/mlrhph20，然后再加入濃度為100μg/ml的rhpth(1-34))。按設(shè)定時(shí)間從下室取樣100μl，并立即補(bǔ)充等量hbss溶液。采用色譜方法，進(jìn)樣分析，記錄得到的峰面積(a)，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)rhpth(1-34)的累積滲透量。

(1)、實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1中各藥物組合物對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞滲透吸收性的影響：

表5.實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1各藥物組合物對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞滲透吸收性的影響(x±s，n＝3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，當(dāng)吸收促滲透劑為rhph20酶活性為1000～20000u/ml，且黏膜吸附劑濃度為0.3～15mg/ml時(shí)，藥物組合物a-x中rhpth(1-34)具有良好的經(jīng)tr146口腔粘膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用；組合物a1缺少吸收促滲透劑rhph20和黏膜吸附劑，使得rhpth(1-34)的滲透吸收作用顯著低于藥物組合物a；組合物a2、a4含有黏膜吸附劑，使得rhpth(1-34)的經(jīng)tr146口腔粘膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用略高于組合物a1，但是由于缺少吸收促滲透劑rhpth20，使得rhpth(1-34)的滲透吸收作用顯著低于組合物h、t；組合物a3、a5含有吸收促滲透劑rhph20，可降解細(xì)胞間質(zhì)的連接，使得細(xì)胞間孔徑變大，從而提高了rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔粘膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用，且高于組合物a1、a2和a4，但是仍顯著低于組合物q、x。由此可知，吸收促滲透劑rhph20與黏膜吸附劑、增稠劑對(duì)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞滲透吸收rhpth(1-34)具有協(xié)同作用。

當(dāng)rhph20(酶活性1000u/ml)與rhpth(1-34)(濃度為100μg/ml)分別放入上室時(shí)，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性(pc值為(2.37±0.31)×10^-7m/s)高于組合物a1，但是仍顯著低于組合物a(相對(duì)于組合物a，er值為7.8±1.26)，表明rhph20與有效成分rhpth(1-34)分別使用時(shí)，在一定程度上可以促進(jìn)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用，但是仍顯著低于本發(fā)明的藥物組合物對(duì)rhpth(1-34)的滲透吸收性；

(2)、對(duì)于對(duì)比實(shí)施例2，有效成分為抗cd20單抗，如利妥昔單抗，若要實(shí)現(xiàn)口腔黏膜給藥，可根據(jù)表2中組合物b1中各成分配比，采用與實(shí)施例1相同的方法制備。但是，制備含如此高濃度利妥昔單抗的組合物，需要對(duì)抗體進(jìn)行濃縮，但是濃縮后的抗體易發(fā)生聚集，不能保證抗體活性，并且通過口腔黏膜吸收后，在體內(nèi)容易引起治療性抗體的免疫原性反應(yīng)，此過程中產(chǎn)生的中和性抗體可以使治療性抗體無效。由此可見，在技術(shù)上無法實(shí)現(xiàn)經(jīng)口腔黏膜給藥的含抗cd20單抗的藥物組合物的制備及其在治療相關(guān)疾病中的用途。

(3)、對(duì)于對(duì)比實(shí)施例3，當(dāng)以脫氧膽酸鈉作為藥物組合物的吸收促滲透劑時(shí)，雖然可改變tr146口腔粘膜上皮細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層有序結(jié)構(gòu)，使磷脂分子的有序性降低，從而降低tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞間的黏度和提高黏膜細(xì)胞間的通透性，但是，tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞間形成的孔徑大小有限，不如rhph20降解黏膜細(xì)胞間透明質(zhì)酸后所形成的孔徑大，且即使增加脫氧膽酸鈉的用量也無法達(dá)到rhpth(1-34)有效濃度。因此rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性較實(shí)施例1中rhpth(1-34)的低，無法實(shí)現(xiàn)rhpth(1-34)通過口腔黏膜給藥而達(dá)到藥物有效濃度。

實(shí)施例3、不同酶活性的吸收促滲透劑rhph20對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性影響

按照如下表6.1中d1-d10各組合物配比，其中吸收促滲透劑rhph20酶活性分別為300、600、1000、2000、5000、8000、12000、20000u/ml，采用同實(shí)施例1相同的方法制備得到含不同酶活性的rhph20的組合物，并使用與實(shí)施例2相同的方法檢測不同酶活性的rhph20對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6.2和圖1所示，藥物組合物d1-d10，當(dāng)rhph20酶活性為1000～20000u/ml，可有效促進(jìn)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用；當(dāng)rhph20酶活性小于1000u/ml時(shí)，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用較rhph20酶活性為1000～20000u/ml時(shí)低，特別在rhph20酶活性小于500u/ml時(shí)，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性很低，從而不能顯著增加rhpth(1-34)的生物利用度；當(dāng)rhph20酶活性高于20000u/ml時(shí)，不再顯著增加rhpth(1-34)的滲透吸收作用。由此得出，rhph20酶活性為1000～20000u/ml時(shí)，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性存在劑量依賴性。

如圖1所示，當(dāng)藥物組合物的有效成分rhpth(1-34)濃度分別為100、1000μg/ml，黏膜吸附劑的種類和配比與表6.1藥物組合物d1-d10相同時(shí)，rhph20酶活性為300～30000u/ml時(shí)，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性曲線與藥物組合物d1-d10的相似。

表6.1藥物組合物d1-d10的配方

表6.2藥物組合物d1-d10rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性

實(shí)施例4、不同濃度黏膜吸附劑對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性影響

按照如下表7.1中e1-e11各組合物配比，其中黏膜吸附劑，包含聚維酮、卡波姆和羧甲基殼聚糖，其濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.8、1、5、7、10、15、18、25mg/ml，采用同實(shí)施例1相同的方法制備得到含不同濃度的黏膜吸附劑的組合物，并使用同實(shí)施例3相同的方法檢測不同濃度黏膜吸附劑對(duì)rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7.2和圖2所示，藥物組合物e1-e11，當(dāng)黏膜吸附劑的濃度為0.2～15mg/ml時(shí)，可有效促進(jìn)組合物粘附在口腔黏膜上，并有利于rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用，可提高其生物利用度；當(dāng)黏膜吸附劑的濃度小于0.2mg/ml時(shí)，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收作用很低，表明黏膜吸附劑濃度過低，不利于組合物的粘附作用，使得rhpth(1-34)的滲透吸收作用顯著降低；當(dāng)黏膜吸附劑的濃度大于15mg/ml時(shí)，rhpth(1-34)的滲透吸收性沒有顯著增加，表明黏膜吸附劑濃度高于15mg/ml時(shí)，會(huì)顯著增加組合物的粘稠度，使得與口腔黏膜接觸時(shí)，粘附力高，影響rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的擴(kuò)散吸收作用。由此可得，黏膜吸附劑濃度為0.2～15mg/ml，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性存在劑量依賴性。

表7.1藥物組合物e1-e11的配方

表7.2藥物組合物e1-e11rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性

如圖2所示，當(dāng)藥物組合物的有效成分rhpth(1-34)濃度分別為100、1000μg/ml，rhph20酶活性分別為1000和12000u/ml時(shí)，黏膜吸附劑濃度為0.05～25mg/ml時(shí)，rhpth(1-34)經(jīng)tr146口腔黏膜上皮細(xì)胞的滲透吸收性曲線與藥物組合物e1-e11的相似。

實(shí)施例4生物學(xué)活性：

(1)rhpth(1-34)生物學(xué)活性

采用camp測定法檢測上述實(shí)施例1所得藥物組合物中rhpth(1-34)生物學(xué)活性，rp-hplc法檢測rhpth(1-34)的純度及濃度，結(jié)果如表8所示：

表8.實(shí)施例1藥物組合物a-x中rhpth(1-34)生物學(xué)活性、純度及濃度

可知當(dāng)促吸收滲透劑rhph20酶活性為1000～2000iu/ml，黏膜吸附劑濃度為0.2～15mg/ml，和/或增稠劑濃度為0.3～4mg/ml時(shí)，實(shí)施例1所得藥物組合物中rhpth(1-34)純度均在98％以上，生物學(xué)活性保持較高水平，且濃度基本維持不變。此外，加入增稠劑后可進(jìn)一步提高rhpth(1-34)的生物學(xué)活性及純度。

(2)促吸收滲透劑(rhph20)的活性測試：

根據(jù)中國藥典2010版二部附錄xiic提供的透明質(zhì)酸酶的活性測定方法(濁度法)，檢測上述藥物組合物a-x中rhph20的酶活性。

該測定法是基于在酸性條件下透明質(zhì)酸會(huì)和血清反應(yīng)形成穩(wěn)定的膠狀物，經(jīng)透明質(zhì)酸酶降解后，反應(yīng)形成的膠狀物減少，變得澄清，以640nm波長測量澄清度，透明質(zhì)酸酶的含量和澄清程度成正比關(guān)系。

根據(jù)用rhph20測定參照標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋物產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算rhph20的酶活性，結(jié)果如表9所示：

表9.藥物組合物a-x中rhph20的酶活性

從上表數(shù)據(jù)可知，實(shí)施例1所得藥物組合物中rhph20酶活性保持較高水平，且純度約為98％；加入增稠劑后可進(jìn)一步提高rhph20的酶活性和純度。

實(shí)施例5經(jīng)口腔黏膜給藥的含rhpth(1-34)的藥物組合物體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)

spf級(jí)sd雌性大鼠90只，6月齡，體重257±13克。其中10只為基線、20只用于模型鑒定，60只用于藥效研究。

術(shù)前取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10只作為基線組(base)，60只動(dòng)物經(jīng)氯胺酮(100mg/kg體重)腹腔注射麻醉下行背側(cè)切口，作雙側(cè)卵巢完全摘除(卵巢摘除組，ovx)或20只僅切除卵巢周圍少量脂肪組織(假摘卵組，sham)。

基線組(base)動(dòng)物經(jīng)22％烏來糖(0.5ml/100g體重)腹腔麻醉，頸動(dòng)脈放血處死。取股骨和腰椎作骨量和骨生物力學(xué)性能測定。

術(shù)后12周隨機(jī)選取假摘卵組(sham)和卵巢摘除組(ovx)各10只，經(jīng)22％烏來糖腹腔麻醉，頸動(dòng)脈放血處死。取子宮稱重，并取股骨和腰椎作骨量和骨生物力學(xué)性能測定，以確認(rèn)卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松模型成立。

其余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)一步分組，每組10只。假摘卵組(sham)剩余大鼠作為正常對(duì)照組(sham)，卵巢摘除組(ovx)剩余大鼠進(jìn)一步平行分為5組，包括陰性對(duì)照組(ns)、待試藥物組為實(shí)施例1中不同給藥劑量的藥物組合物w口腔黏膜給藥(oral)、以及皮下注射陽性對(duì)照組(sc)。

正常對(duì)照(sham)和陰性對(duì)照(ns)大鼠經(jīng)口腔黏膜給予溶媒作對(duì)照處理；三組待試藥物組(oral)分別給予463、1390和4170μg/kg/次藥物組合物w(分別相當(dāng)于rhpth(1-34)為7、21、63μg/kg。，參照已有研究的胰島素噴霧劑oral-lyn相對(duì)于注射給藥設(shè)定劑量倍數(shù))；陽性對(duì)照組(sc)給予rhpth(1-34)2.1μg/kg/次。每組每周6次，治療17周。實(shí)驗(yàn)分組和治療具體內(nèi)容見如下表10。

其中，正常對(duì)照組(sham)、陰性對(duì)照組(ns)和三組不同給藥劑量的待試藥物組w(oral)的大鼠尾靜脈注射60mg/kg戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉后，使其在麻醉臺(tái)上保持仰臥姿勢，并經(jīng)食管結(jié)扎，口腔黏膜給藥時(shí)，保證每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于水平線上的同一位置。正常對(duì)照組(sham)、陰性對(duì)照組(ns)和三組待試藥物組(oral)不同的藥物裝載在不同的噴霧瓶中，然后分別對(duì)相應(yīng)分組的動(dòng)物進(jìn)行口腔黏膜給藥。

表10.實(shí)驗(yàn)分組及內(nèi)容

檢測指標(biāo)：

治療結(jié)束前14天和4天腹腔注射四環(huán)素(30mg/kg體重)和鈣黃綠素(10mg/kg體重)制作骨組織形態(tài)計(jì)量標(biāo)本，分析礦化沉積率。治療結(jié)束后實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)22％烏來糖(0.5ml/100g體重)腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈采血取血標(biāo)本，處死后取股骨、脛骨和腰椎等骨和其他標(biāo)本作下列各項(xiàng)指標(biāo)測定。

(1)骨密度(bmd)：股骨與腰椎骨密度值分別主要反映皮質(zhì)骨為主與松質(zhì)骨為主的骨密度。股骨(左)與腰椎(l1-5)骨密度用雙能x線骨密度儀(hologicdiscoverya，精度1％；cv<1％)進(jìn)行高分辨掃描，獲得其骨密度值(g/cm2)。

(2)骨生物力學(xué)：股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)與腰椎壓縮試驗(yàn)分別主要反映皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨的力學(xué)性能。新鮮股骨(右)與腰椎(l3)標(biāo)本剔除肌肉后分別在萬能材料測試儀(instron-5543usa；精度0.04％；測量范圍10-1100n)的三點(diǎn)彎曲裝置(跨度18mm；速率10.0mm/min；溫度23℃；濕度60-70％)與壓縮裝置上測試，獲得三點(diǎn)彎曲最大載荷與壓縮最大載荷，結(jié)果以牛頓力(n)表示。

(3)骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)：包括血清ocn、和trap5b。骨鈣素(ocn)主要由成熟成骨細(xì)胞合成分泌，沉積于骨基質(zhì)，其血清水平反映骨轉(zhuǎn)換水平和骨礦化程度，使用大鼠ocn酶免試劑盒(rat-midosteocalcin,ac12f1,ids英國)進(jìn)行檢測。抗酒石酸酸性磷酸酶5b(trap5b)主要由破骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其血清活性反映破骨細(xì)胞數(shù)量和活性，使用大鼠trap5b酶免試劑盒(rattraptmassay，sb-tr102,ids)檢測大鼠血清中trap5b活性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

(1)不同給藥劑量的藥物組合物w對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠bmd的影響如表11所示：

表11.不同給藥劑量的藥物組合物w治療ovx大鼠17周后bmd測定結(jié)果(x±sd)

n＝10；與ns組比較*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；±％為與ns組比較的差異百分?jǐn)?shù)，(±％)為與sham組比較的差異百分?jǐn)?shù)(+為增加，－為減少)

如表11所示，ovx骨質(zhì)疏松對(duì)照大鼠(ns組)經(jīng)17周后觀察，股骨(左)和腰椎(l1-l5)bmd較sham組明顯降低，前者降低8.7％(p<0.001)，后者降低11.1％(p<0.001)。經(jīng)口腔黏膜給藥藥物組合物w治療17周(每周6次)，1390μg/kg組和4170μg/kg組的股骨和腰椎bmd較ns組明顯增加(分別為6.2～9.8％，p<0.01或p<0.001；11.4～5.6％，p<0.001或p<0.05)；此外，1390μg/kg組相對(duì)于ns組股骨和腰椎bmd的增加效果與sc組的一致，4170μg/kg組相對(duì)于ns組股骨bmd的增加效果優(yōu)于sc組，而腰椎bmd的增加效果與sc組的相當(dāng)。

(2)不同給藥劑量的藥物組合物w對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)性能的影響：

表12.不同給藥劑量的藥物組合物w治療ovx大鼠17周后骨生物力學(xué)性能測定結(jié)果(x±sd)

n＝10；與ns組比較*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；±％為與ns組比較的差異百分?jǐn)?shù)，(±％)為與sham組比較的差異百分?jǐn)?shù)(+為增加，－為減少)

如表12所示，ovx骨質(zhì)疏松對(duì)照大鼠(ns)經(jīng)17周繼續(xù)觀察，股骨三點(diǎn)彎曲最大載荷和腰椎壓縮最大載荷較sham組分別降低2.4％(p>0.05)和32.5％(p<0.001)。經(jīng)不同給藥劑量的藥物組合物w口腔黏膜給藥治療17周，1390μg/kg組和4170μg/kg組股骨三點(diǎn)彎曲最大載荷和腰椎壓縮最大載荷較ns組分別增加15.2％(p<0.01)、8.3，以及70.9％、61.2％(p<0.01或p<0.001)；此外，1390μg/kg組相對(duì)于ns組股骨三點(diǎn)彎曲載荷和腰椎壓縮載荷的增加效果優(yōu)于sc組，4170μg/kg組相對(duì)于ns組股骨三點(diǎn)彎曲載荷的增加效果不及sc組，而腰椎壓縮載荷的增加效果略優(yōu)于sc組。

(3)不同給藥劑量的藥物組合物w對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清alp和trap5b活性的影響：

表13.不同給藥劑量的藥物組合物w治療ovx大鼠17周后血清ocn和trap5b測定結(jié)果(x±sd)

與ns組比較*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；±％為與ns組比較的差異百分?jǐn)?shù)，(±％)為與sham組比較的差異百分?jǐn)?shù)(+為增加，－為減少)

如表13所示，ovx骨質(zhì)疏松對(duì)照大鼠(ns)繼續(xù)觀察17周，血清骨鈣素(ocn)恢復(fù)近sham組水平(+8.8％，p>0.05)。經(jīng)不同給藥劑量的藥物組合物w口腔黏膜給藥治療后，血清ocn水平較ns組顯著增高，其中，1390μg/kg組和4170μg/kg組較ns組分別增加131％、72.4％(p<0.001或p<0.05)；此外，1390μg/kg組相對(duì)于ns組ocn增加效果與sc組一致，4170μg/kg組相對(duì)于ns組ocn增加效果不及sc組。ovx骨質(zhì)疏松對(duì)照大鼠(ns組)血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(trap5b)水平較sham組降低24.7％(p<0.01)，經(jīng)不同濃度的藥物組合物w口腔黏膜給藥治療后，血清trap5b水平較ns組增加顯著提高，其中，1390μg/kg組和4170μg/kg組較ns組分別增加27.6％(p<0.05)、27.5％(p<0.05)；此外，1390μg/kg組和4170μg/kg組相對(duì)于ns組trap5b增加水平均略優(yōu)于sc組。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，待試藥物組(oral)與正常對(duì)照組(sham)相比較，具有相似程度的骨密度、骨強(qiáng)度；待試藥物組(oral，給藥劑量分別為1390μg/kg和4170μg/kg)與陰性對(duì)照組相比，可顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度、骨強(qiáng)度和血清中ocn和trap5b水平，與陽性對(duì)照組(sc)相比較，同樣可以使骨密度增加、骨強(qiáng)度增大，以及血清中ocn和trap5b水平明顯升高。由此可見，本發(fā)明實(shí)施例1所制備的藥物組合物可明顯改善卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松癥狀，說明口腔黏膜給藥途徑已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了藥物rhpth(1-34)良好的吸收和利用。

在對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1所得其他組藥物組合物的動(dòng)物活性實(shí)驗(yàn)中，其他組藥物組合物a-v和x同樣表現(xiàn)為與藥物組合物w一致近似的活性效果，尤以藥物組合物w最佳。

綜上可知，實(shí)施例1所得藥物組合物中有效成分及促吸收滲透劑均保持較高的活性，在滲透吸收性檢測中也表現(xiàn)為較好的滲透吸收性，綜合各項(xiàng)指標(biāo)可知實(shí)施例1所得藥物組合物具有較好的制備成口腔黏膜給藥藥物制劑的前景。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。