本發(fā)明屬于獸用生物制品
技術領域：
，具體涉及一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法。
背景技術：
：h9n2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，但發(fā)病率高，其主要臨床表現(xiàn)為輕度呼吸道癥狀，采食量減少，產(chǎn)蛋率可從90％降至20％以下，甚至絕產(chǎn)，對商品肉雞可導致30％左右死亡，極易與大腸桿菌混合感染，嚴重影響家禽的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。而且，該h9n2亞型aiv可以穿越宿主障礙感染哺乳動物，包括人，即有機會在人類中大規(guī)模流行，給人類健康帶來嚴重的威脅。雖然h9亞型禽流感滅活疫苗已廣泛應用，該病也得到了有效控制，但是近幾年來h9亞型禽流感在免疫雞群中時有發(fā)生。為此，通過高適應載體表達高質(zhì)量的有效抗原同時減少原有的生產(chǎn)成本達到針對同源/非同源h9亞型aiv提供免疫保護的疫苗尤為必要。目前，我國的禽流感h9亞型主要是通過雞胚尿囊腔接種流感病毒而獲得，專利文獻cn102093982b公開了一種禽流感h9n2亞型病毒毒株及其應用，所述禽流感h9n2亞型病毒毒株(orthomyxoviridae)的cgmccno：3526。該禽流感h9n2亞型病毒毒株具有良好的特異性和免疫原性，雞胚尿囊液凝集紅細胞的作用不能被抗ndv陽性血清、抗eds76陽性血清、抗m41陽性血清、抗h5亞型禽流感病毒單因子陽性血清以及抗h7亞型禽流感病毒單因子陽性血清所抑制，而能被h9亞型禽流感病毒單因子陽性血清抑制。免疫雛雞能產(chǎn)生對h9特異的hi抗體。該禽流感h9n2亞型病毒毒株可以預防禽類的h9亞型禽流感，用于病毒的鑒定和流行病學的調(diào)查。但是上述禽流感h9n2亞型病毒毒株采用spf雞胚載體進行病毒增殖，病毒滴度不高且用spf雞胚載體大規(guī)模生產(chǎn)其生產(chǎn)成本非常昂貴，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。同時，通過雞胚尿囊腔接種流感病毒會出現(xiàn)如大流行時疫苗的供給量往往受到spf雞胚數(shù)量的限制；有些毒株無法在雞胚中復制，因此難以獲得足夠量的病毒，只有雞胚適應株才能獲得高產(chǎn)量病毒；受體結(jié)合特異位點的變異導致抗原性降低；疫苗生產(chǎn)下游技術一成不變且十分繁重、易于污染等等，大大的限制了禽流感h9亞型疫苗的推廣和應用。技術實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明提供一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明是采用動物傳代細胞lmh細胞進行病毒增殖，在培養(yǎng)流感病毒時能夠在短期內(nèi)大量增殖病毒，且無外源因子污染，能維持病毒抗原穩(wěn)定，同時在培養(yǎng)過程中不需要添加胰蛋白酶，培養(yǎng)得到的流感病毒具有病毒含量高，血凝價高，免疫原性好的優(yōu)點。本發(fā)明提供了一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟：s1細胞載體的制備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000-2000單位/ml青鏈霉素雙抗的dmem培養(yǎng)液在37℃、5％co2的條件下2～3天，接著用無血清dmem培養(yǎng)液清洗細胞2～3次，得細胞載體；s2病毒的接種：將禽流感病毒h9亞型病毒液按終體積1:50～1:200接種到步驟s1得到的細胞載體中，放置37℃條件下吸附30-60min后吸棄病毒液，接著加入培養(yǎng)基a，于37℃、5％co2的條件下培48～72h，出現(xiàn)70～80％細胞病變，得病變細胞；s3病毒液收集：將步驟s2得到的病變細胞凍融2～3次，于4℃、5000rpm條件下離心8～12min后，收集禽流感病毒h9亞型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型病毒液；s4病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型病毒液，得禽流感病毒h9亞型疫苗抗原；s5疫苗配制：a油相制備：取92～96份白油，1～3份硬脂酸鋁，3～5份司班-80，將白油加熱到75～85℃，接著加入司班-80和硬脂酸鋁，攪拌溶解至透明，滅菌，得油相；b水相制備：取40～50份步驟s4得到的禽流感病毒h9亞型疫苗抗原，加入3～5份吐溫-80，攪拌至完全溶解，得水相；c乳化：將步驟a得到的油相與步驟b得到的水相混合，在14000-16000rpm的條件下乳化4-6min，按照每瓶250ml進行分裝，即得。進一步地，所述的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟：s1細胞載體的制備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1600單位/ml青鏈霉素雙抗的dmem培養(yǎng)液在37℃、5％co2的條件下2天，接著用無血清dmem培養(yǎng)液清洗細胞3次，得細胞載體；s2病毒的接種：將禽流感病毒h9亞型按終體積1:50～1:500接種到步驟s1得到的細胞載體中，放置37℃條件下吸附30～60min后吸棄病毒液，接著加入培養(yǎng)基a，于37℃、5％co2的條件下培56h，出現(xiàn)75％細胞病變，得病變細胞；s3病毒液收集：將步驟s2得到的病變細胞凍融3次，于4℃、5000rpm的條件下離心10min后，收集禽流感病毒h9亞型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型病毒液；s4病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型病毒液，得禽流感病毒h9亞型疫苗抗原；s5疫苗配制：a油相制備：取94份白油，2份硬脂酸鋁，4份司班-80，將白油加熱到78℃，接著加入司班-80和硬脂酸鋁，攪拌溶解至透明，滅菌，得油相；b水相制備：取45份步驟s4得到的禽流感病毒h9亞型疫苗抗原，加入4份吐溫-80，攪拌至完全溶解，得水相；c乳化：將步驟a得到的油相與步驟b得到的水相混合，在15000rpm的條件下乳化4-6min，按照每瓶250ml進行分裝，即得。進一步地，所述步驟s2中的培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺1～4mmol/l、重組人胰島素4～10μg/ml、人血清白蛋白1～3mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白2～6μg/ml、生物素2～4μg/ml和生長因子8～22mmol/l。進一步地，所述步驟s2中的培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺2mmol/l、重組人胰島素6μg/ml、人血清白蛋白2mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白4μg/ml、生物素3μg/ml和生長因子14mmol/l。進一步地，所述生長因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按質(zhì)量比(4～6):(1～3)組成。進一步地，所述生長因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按質(zhì)量比5:2組成。進一步地，所述步驟s1中的lmh細胞放置轉(zhuǎn)瓶內(nèi)培養(yǎng)。進一步地，所述步驟s1中的lmh細胞放置微載體反應器內(nèi)培養(yǎng)，微載體使用量2～10克/升。本發(fā)明采用的lmh細胞為atcclmh-crl-2117細胞，焦磷酸硫胺素的cas號為67-03-8，天麻素的cas號為62499-27-8。本發(fā)明采用的lmh細胞作為載體細胞和采用由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定質(zhì)量比組成生長因子可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備得到的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗病毒含量高，禽流感病毒h9亞型≥108.5tcid50，禽流感病毒h9亞型≥108.3eid50，禽流感病毒h9亞型ha≥29，可以有效的提高禽流感病毒、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的疫苗效果。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗外觀為乳白色乳劑，將10ml疫苗加入離心管中，以3000rpm離心15min，管底析出的水相應≤0.4ml，具有較高的穩(wěn)定性高；吸取1.0ml疫苗，令其垂直自然流出0.4ml，時間低于3.8s，具有較好的粘度，滅活、甲醛含量和安全性符合國家標準，有利于該禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的推廣和應用。進一步地，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明提供的lmh細胞載體不僅能培養(yǎng)出血凝價高的禽流感h9亞型病毒，并且能完全取代采用傳統(tǒng)的用雞胚生產(chǎn)禽流感h9亞型病毒；從spf雞的免疫效力試驗可知，本發(fā)明制備得到的禽流感h9亞型和滅活疫苗免疫spf雞可以產(chǎn)生高水平的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法具有以下優(yōu)勢：(1)本發(fā)明采用lmh傳代細胞系進行禽流感h9亞型病毒增殖不需要向細胞培養(yǎng)液中添加額外的胰酶，而且lmh細胞背景清楚，無外源病原，易增殖性，可以有效的簡化工藝，降低成本。(2)本發(fā)明制備得到的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的病毒含量高、穩(wěn)定性好，安全性高，是一種較為理想的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗。具體實施方式：以下通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供的谷氨酰胺、重組人胰島素、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和生物素為常規(guī)市售產(chǎn)品，例如，重組人胰島素購于沈陽拜英生物技術有限公司。實施例1、一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法s1細胞載體的制備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含5％新生牛血清和1000單位/ml青鏈霉素雙抗的dmem培養(yǎng)液在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)2天，接著用無血清dmem培養(yǎng)液清洗細胞2次，得細胞載體；所述lmh細胞放置轉(zhuǎn)瓶內(nèi)培養(yǎng)或放置微載體反應器內(nèi)培養(yǎng)。s2病毒的接種：將禽流感病毒h9亞型按終體積1:60接種到步驟s1得到的細胞載體中，放置37℃條件下吸附30min后吸棄病毒液，接著加入培養(yǎng)基a，于37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)48h，出現(xiàn)70％細胞病變，得病變細胞；所述培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺2mmol/l、重組人胰島素4μg/ml、人血清白蛋白1mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白2μg/ml、生物素2μg/ml和生長因子10mmol/l；所述生長因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按質(zhì)量比4:3組成。s3病毒液收集：將步驟s2得到的病變細胞凍融2次，于4℃、5000rpm條件下離心8min后，收集禽流感病毒h9亞型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型病毒液；s4病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型病毒液，得禽流感病毒h9亞型疫苗抗原；s5疫苗配制：a油相制備：取92份白油，1份硬脂酸鋁，3份司班-80，將白油加熱到75℃，接著加入司班-80和硬脂酸鋁，攪拌溶解至透明，滅菌，得油相；b水相制備：取40份步驟s4得到的禽流感病毒h9亞型疫苗抗原，加入3份吐溫-80，攪拌至完全溶解，得水相；c乳化：將步驟a得到的油相與步驟b得到的水相混合，在14000的條件下乳化4min，按照每瓶250ml進行分裝，即得。實施例2、一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法s1細胞載體的制備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含8％新生牛血清和1600單位/ml青鏈霉素雙抗的dmem培養(yǎng)液在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)2天，接著用無血清dmem培養(yǎng)液清洗細胞3次，得細胞載體；所述lmh細胞放置微載體反應器內(nèi)培養(yǎng)，微載體使用量6克/升。s2病毒的接種：將禽流感病毒h9亞型按終體積1:120接種到步驟s1得到的細胞載體中，放置37℃條件下吸附40min后吸棄病毒液，接著加入培養(yǎng)基a，于37℃、5％co2的條件下56h，出現(xiàn)75％細胞病變，得病變細胞；所述培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺2mmol/l、重組人胰島素6μg/ml、人血清白蛋白2mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白4μg/ml、生物素3μg/ml和生長因子14mmol/l；所述生長因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按質(zhì)量比5:2組成。s3病毒液收集：將步驟s2得到的病變細胞凍融3次，于4℃、5000rpm條件下離心10min后，收集禽流感病毒h9亞型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型病毒液；s4病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型病毒液，得禽流感病毒h9亞型疫苗抗原；s5疫苗配制：a油相制備：取94份白油，2份硬脂酸鋁，4份司班-80，將白油加熱到78℃，接著加入司班-80和硬脂酸鋁，攪拌溶解至透明，滅菌，得油相；b水相制備：取45份步驟s4得到的禽流感病毒h9亞型疫苗抗原，加入4份吐溫-80，攪拌至完全溶解，得水相；c乳化：將步驟a得到的油相與步驟b得到的水相混合，在15000rpm的條件下乳化5min，按照每瓶250ml進行分裝，即得。實施例3、一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法s1細胞載體的制備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含10％新生牛血清和2000單位/ml青鏈霉素雙抗的dmem培養(yǎng)液在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)3天，接著用無血清dmem培養(yǎng)液清洗細胞3次，得細胞載體；所述lmh細胞放置微載體反應器內(nèi)培養(yǎng)，微載體使用量8克/升。s2病毒的接種：將禽流感病毒h9亞型病毒液按終體積1:180接種到步驟s1得到的細胞載體中，放置37℃條件下吸附60min后吸棄病毒液，接著加入培養(yǎng)基a，于37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)72h，出現(xiàn)80％細胞病變，得病變細胞；所述培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺4mmol/l、重組人胰島素10μg/ml、人血清白蛋白3mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6μg/ml、生物素4μg/ml和生長因子20mmol/l；所述生長因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按質(zhì)量比6:1組成；s3病毒液收集：將步驟s2得到的病變細胞凍融3次，于4℃、5000rpm條件下離心12min后，收集禽流感病毒h9亞型上清液和，接著進行tcid50和eid50檢測，合格后，將上述上清液超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型病毒液；s4病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型病毒液，得禽流感病毒h9亞型疫苗抗原；s5疫苗配制：a油相制備：取96份白油，3份硬脂酸鋁，5份司班-80，將白油加熱到85℃，接著加入司班-80和硬脂酸鋁，攪拌溶解至透明，滅菌，得油相；b水相制備：取50份步驟s4得到的禽流感病毒h9亞型疫苗抗原，加入5份吐溫-80，攪拌至完全溶解，得水相；c乳化：將步驟a得到的油相與步驟b得到的水相混合，在16000rpm的條件下乳化6min，按照每瓶250ml進行分裝，即得。對比例1、一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法與實施例2的區(qū)別在于，所述步驟s1中將lmh細胞替換為mdck細胞作為細胞載體，其余步驟與實施例2類似。對比例2、一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法與實施例2的區(qū)別在于，所述步驟s2中培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺2mmol/l、重組人胰島素6μg/ml、人血清白蛋白2mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白4μg/ml、生物素3μg/ml和新生牛血清14mmol/l；其余步驟與實施例2類似。對比例3、一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法與實施例2的區(qū)別在于，所述步驟s2中培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺2mmol/l、重組人胰島素6μg/ml、人血清白蛋白2mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白4μg/ml、生物素3μg/ml和焦磷酸硫胺素14mmol/l；其余步驟與實施例2類似。對比例4、一種禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的制備方法與實施例2的區(qū)別在于，所述步驟s2中培養(yǎng)基a包括dmem基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺2mmol/l、重組人胰島素6μg/ml、人血清白蛋白2mg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白4μg/ml、生物素3μg/ml和生長因子14mmol/l；所述生長因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按質(zhì)量比1:1組成；其余步驟與實施例2類似。試驗例一、禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的病毒含量檢測1、試驗材料：實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2和對比例3的步驟s3制備的禽流感病毒h9亞型上清液。2、試驗方法：分別檢測實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2和對比例3的步驟s3制備的禽流感病毒h9亞型上清液的tcid50、eid50和ha(血凝價)。2.1、tcid50的檢測方法：分別將收集的禽流感病毒h9亞型病毒液于-20℃反復凍融兩次后，于4℃、5000rpm離心10min，分別取離心后上清液用于超濾濃縮；將上述離心后的上清液用50k中空纖維柱將其濃縮后，取濃縮后的病毒液用dmem細胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95個稀釋度接種48孔鋪滿單層lmh細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度重復5孔，同時設立陰性對照細胞，每孔0.1ml，37℃吸附30min后，補加含1～2％新生牛血清、適量雙抗和2mm谷氨酰胺的dmem培養(yǎng)液0.3ml于37℃、5％co2培養(yǎng)120小時，觀察細胞病變(cpe)，利用reed-muench方法計算tcid50；2.2、eid50的檢測方法：將禽流感病毒h9亞型收集的細胞病毒液于-20℃反復凍融兩次后，于4℃、5000rpm離心10min，取離心后上清液，將上述離心濃縮后上清液用pbs按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種spf雞胚，0.1ml/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結(jié)束后利用reed-muench方法計算離心收獲的上清液的eid50；2.3、ha的檢測方法：按微量法在v型血凝試驗微量板上進行，雞紅細胞濃度為1％(v/v)，反應總量均為0.075ml。3、試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如表1所示。表1禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的病毒含量檢測表由表1可知，本發(fā)明制備得到的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗病毒含量高，禽流感病毒h9亞型≥108.5tcid50，禽流感病毒h9亞型≥108.3eid50，禽流感病毒h9亞型ha≥29，可以有效的提高禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的疫苗效果。說明本發(fā)明采用的lmh細胞作為載體細胞和采用由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定質(zhì)量比組成生長因子可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。試驗例二、禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量檢測1、試驗材料：實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗。2、試驗方法：對實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗進行外觀，穩(wěn)定性，粘度，無菌檢驗，滅活檢驗，安全檢驗和甲醛含量測定。2.1、外觀觀察：直接觀察實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的外觀情況。2.2、穩(wěn)定性測定：各吸取實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗10毫升加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應≤0.5ml。2.3、粘度測定：用出口內(nèi)徑為1.2mm的1.0ml吸管，在25℃左右吸取實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時間，應不超過8秒。2.4、無菌檢驗：取實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管和酪胨瓊脂各兩支，每支0.2ml，一支置37℃培養(yǎng)，一支置25℃培養(yǎng)，觀察3～5日，應純粹，無菌生長。2.5、滅活檢驗：取實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗，用dmem營養(yǎng)液以10-1、10-2、10-3三個比例稀釋待檢樣品，同時設立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用于陽性對照，分別接種于48孔lmh細胞單層細胞，每組重復接種5孔，每孔0.4ml37℃、5％co2培養(yǎng)96小時。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現(xiàn)細胞病變，陽性對照組各稀釋度孔中細胞病變均明顯，達80％以上，判定為滅活檢驗合格。2.6、安全檢驗：用7日齡spf雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗1ml，觀察14日，結(jié)果試驗雞均健活，無任何局部和全身不良反應。2.7、甲醛含量測定：ⅰ、對照品溶液的制備：取已標定的甲醛溶液適量，配成每1.0ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0ml置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得；ⅱ、被測樣本的制備：用5.0ml刻度吸管量取實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗5.0ml，置50ml量瓶中，用20％吐溫-80乙醇溶液10ml，分次洗滌吸管，洗液并入50ml量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強烈振搖，靜止分層，下層液如果不澄清，濾過，棄去初濾液，取澄清續(xù)濾液，即得；ⅲ、測定法：精密吸取對照品溶液和被檢品溶液各0.5ml，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10ml，乙酰丙酮試液10ml，置60℃恒溫水浴15分鐘，冷水冷卻5分鐘，放置20分鐘后，按紫外-可見分光光度計法，在410nm的波長處測定吸收度，計算即得。甲醛含量符合國家標準，即檢驗合格。3、試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如表2所示。表2禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量檢測實施例1實施例2實施例3外觀乳白色乳劑乳白色乳劑乳白色乳劑穩(wěn)定性(析出的水，ml)0.30.20.4粘度(液體流出時間，s)3.54.23.8無菌檢驗合格合格合格滅活檢驗合格合格合格安全檢驗定合格合格合格甲醛含量測定合格合格合格由表2可知，本發(fā)明實施例1、實施例2和實施例3制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗外觀為乳白色乳劑，將10ml疫苗加入離心管中，以3000rpm離心15min，管底析出的水相應≤0.4ml，具有較高的穩(wěn)定性高；吸取1.0ml疫苗，令其垂直自然流出0.4ml，時間低于3.8s，具有較好的粘度，滅活、甲醛含量和安全性符合國家標準，有利于該禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的推廣和應用。實施例三、禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的效力試驗：1、試驗材料：實施例2制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗。2、試驗方法：取21日齡spf雞45只，將實施例2制備的禽流感病毒h9亞型滅活疫苗的四批禽流感h9亞型滅活疫苗分別以0.3ml/只胸肌注射，每批滅活疫苗10只spf雞。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，連同對照組5只spf雞分別采血，測定其禽流感病毒h9亞型hi21天、35天和49天的抗體效價。3、試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如表3所示。表3禽流感病毒h9亞型hi抗體效價表由表3可知，采用本發(fā)明提供的lmh細胞載體不僅能培養(yǎng)出血凝價高的禽流感h9亞型病毒，并且能完全取代采用傳統(tǒng)的用雞胚生產(chǎn)禽流感h9亞型病毒；從spf雞的免疫效力試驗可知，本發(fā)明制備得到的禽流感h9亞型滅活疫苗免疫spf雞可以產(chǎn)生高水平的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體。當前第1頁12