本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及多巴胺1類受體激動(dòng)劑新的藥用用途，具體涉及多巴胺1類受體激動(dòng)劑在制備腫瘤治療藥物中的新用途。

背景技術(shù)：

根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的信息，我國(guó)年惡性腫瘤的發(fā)病率為350萬(wàn)人，針對(duì)這一龐大的人群，即便接受手術(shù)+放化療的綜合治療，其致殘率和死亡率均極高，其嚴(yán)重危害了患者的生命和生活質(zhì)量；另一方面，也給國(guó)家及患者家庭帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)壓力和醫(yī)療資源的壓力。比如，其中的腦惡性膠質(zhì)瘤，臨床實(shí)踐顯示，經(jīng)目前國(guó)際推薦的標(biāo)準(zhǔn)化治療，其平均生存率為14.6個(gè)月；再如，垂體腺瘤雖為良性腫瘤，但正常人群隨機(jī)mri檢查時(shí)垂體腺瘤發(fā)現(xiàn)率高達(dá)10％～38.5％(平均22.5％)；垂體腺瘤引起內(nèi)分泌功能的紊亂，如閉經(jīng)-泌乳和不育，巨人癥和肢端肥大癥，庫(kù)興綜合征等；以及垂體腫瘤增大壓迫鄰近結(jié)構(gòu)導(dǎo)致視力下降和垂體功能低下等，同樣嚴(yán)重危害了患者的生存和生活質(zhì)量。

通常，垂體泌乳素腺瘤的干預(yù)方案首選多巴胺受體激動(dòng)劑治療，其中80％-90％的病例經(jīng)藥物治療后能達(dá)到腫瘤體積的有效控制和prl水平的正常化?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了多巴胺受體(dopaminereceptor,dr)分為五型，分別為drd1，drd2，drd3，drd4及drd5，其中的drd1與drd5被業(yè)內(nèi)統(tǒng)稱為d1類受體，其中的drd2、drd3、drd4被業(yè)內(nèi)統(tǒng)稱為d2類受體。有研究顯示，垂體泌乳素腺瘤的治療藥物中，如溴隱亭和卡麥角林，其主要激動(dòng)drd2，而drd5在其中所起的作用不詳。目前drd5主要用于精神病學(xué)的研究中，如精神分裂癥、注意缺陷多動(dòng)障礙等疾病；近年來(lái)還有研究發(fā)現(xiàn)drd5與免疫相關(guān)，如樹(shù)突狀細(xì)胞上的drd5能促進(jìn)cd4⁺t細(xì)胞調(diào)節(jié)的自我免疫，且上調(diào)drd5表達(dá)能活化nk細(xì)胞。2012年guha等人發(fā)現(xiàn)刺激drd5受體能使經(jīng)氯喹堿化后的細(xì)胞重新酸化，恢復(fù)溶酶體降解能力，促進(jìn)細(xì)胞存活。迄今，尚未見(jiàn)drd5治療腫瘤的作用及機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。

現(xiàn)有技術(shù)已公開(kāi)的d1類受體激動(dòng)劑包含skf83959、skf38393等化合物，其中skf83959的分子式為c18h20clno2.hbr，有研究針對(duì)化合物skf83959研究發(fā)現(xiàn)，該藥具有抗帕金森以及神經(jīng)保護(hù)作用，還有研究公開(kāi)了化合物skf83959能緩解進(jìn)行性的運(yùn)動(dòng)障礙；其藥理研究首先發(fā)現(xiàn)skf83959通過(guò)pi-linkedd1多巴胺(磷脂酰肌醇相關(guān)的d1多巴胺)調(diào)控橫紋肌活動(dòng)，同時(shí)認(rèn)為d1樣受體/plc/ip3通路能成為帕金森治療新的藥物靶點(diǎn)；進(jìn)一步研究為d1樣受體/plc/ip3通路做了補(bǔ)充，公開(kāi)了海馬的d5/plc/ip3/鈣依賴型激酶iiα/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為skf83959治療帕金森的通路；以及skf83959不僅能抑制興奮性突觸傳導(dǎo)以及鈉離子通道，還能通過(guò)膜電位去極化下調(diào)海馬ca1區(qū)錐體元細(xì)胞的興奮性，這些研究結(jié)果對(duì)skf83959能夠抗帕金森的機(jī)制做了部分解釋；其次skf83959對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用可以通過(guò)受體與非受體途徑，除上述抗帕金森的相關(guān)機(jī)制外，還與erk和p38分子靶點(diǎn)相關(guān)。最新有研究提出skf83959是sigma-1強(qiáng)效的別構(gòu)調(diào)節(jié)劑，以協(xié)同的方式刺激內(nèi)源性脫氫表雄酮活性，抑制bv2小膠質(zhì)細(xì)胞與促炎癥的調(diào)節(jié)因子，如tnf-α，il-1β等；

自噬(autophagy)意為自體吞噬，是細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分利用溶酶體被降解過(guò)程的統(tǒng)稱，包括長(zhǎng)壽命蛋白和一些細(xì)胞器的降解再利用，從而維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)定?；钚匝躅?reactiveoxygenspecies，ros)是一類損傷細(xì)胞的毒性物質(zhì)，近年的研究發(fā)現(xiàn)ros作為一種信號(hào)分子參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等多個(gè)生理過(guò)程；ros，特別是線粒體源性ros，作為信號(hào)分子參與自噬的調(diào)節(jié)，在不同的環(huán)境下，導(dǎo)致細(xì)胞生存亦或死亡；ros的增加能夠?qū)е戮€粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mpt)開(kāi)放，mpt的開(kāi)放引起線粒體跨膜電位(δψm)降低，細(xì)胞色素c釋放，繼而激活一系列caspase酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ros誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，大量的ros就會(huì)引起細(xì)胞壞死，當(dāng)然，在相同的組織中壞死和凋亡也會(huì)同時(shí)發(fā)生，細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)向細(xì)胞壞死是由ros在腫瘤細(xì)胞中的含量所決定；有文獻(xiàn)報(bào)道，d1類受體，如skf38393，其慢性刺激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元nos的增加，從而加速細(xì)胞死亡；然而，drd5激活導(dǎo)致的ros增加致使腫瘤細(xì)胞死亡的研究機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道；skf83959是否具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，目前亦未見(jiàn)報(bào)道。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本發(fā)明的申請(qǐng)人擬提供多巴胺1類受體激動(dòng)劑新的藥用用途，具體涉及多巴胺1類受體激動(dòng)劑在制備腫瘤治療藥物中的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供多巴胺1類受體激動(dòng)劑新的藥用用途，具體涉及多巴胺1類受體激動(dòng)劑在制備腫瘤治療藥物中的新用途。

本發(fā)明所述的巴胺受體激動(dòng)劑為多巴胺1類受體激動(dòng)劑，包括drd1和drd5激動(dòng)劑，如skf83959、skf38393等化合物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述的巴胺受體激動(dòng)劑能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并通過(guò)提高ros促使腫瘤細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。

本發(fā)明的實(shí)施例中，采用多巴胺1類受體激動(dòng)劑skf83959，skf38393對(duì)大鼠mmq和gh3細(xì)胞，n2a細(xì)胞以及惡性腫瘤細(xì)胞(包括膠質(zhì)瘤u87、u251、shg66，大腸癌scg7901，胃癌sw480)進(jìn)行了體外試驗(yàn)，結(jié)果顯示，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用；進(jìn)一步的移植瘤模型證實(shí)，skf83959對(duì)gh3細(xì)胞和scg7901細(xì)胞的皮下移植瘤模型具有抑制其生長(zhǎng)的作用；機(jī)制研究結(jié)果表明：skf83959誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，而且這種自噬是通過(guò)抑制mtor通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的；同時(shí)，skf83959能促使細(xì)胞ros增加，從而導(dǎo)致死亡；本發(fā)明還進(jìn)行了人源垂體腺瘤原代細(xì)胞的試驗(yàn)，將skf83959用于人源垂體腺瘤原代細(xì)胞，結(jié)果顯示，其能顯著抑制人原代垂體瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本發(fā)明中，所述的巴胺受體激動(dòng)劑skf83959，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：6-chloro-2,3,4,5-tetrahydro-3-methyl-1-(3-methylphenyl)-1h-3-benzazepine-7,8-diol，分子式：c18h20clno2.hbr，分子量：398.73。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述的巴胺1類受體激動(dòng)劑如skf83959、skf38393等化合物可用于制備治療腫瘤藥物，尤其是能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到治療的效果的藥物；所述的腫瘤類型包括垂體腺瘤、神經(jīng)纖維瘤等良性腫瘤和包括惡性腫瘤細(xì)胞，如膠質(zhì)瘤、大腸癌、胃癌等。

為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了：sfk83959抑制垂體瘤細(xì)胞株mmq和gh3的生長(zhǎng)，抑制n2a細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也有效抑制惡性腫瘤細(xì)胞，包括惡性膠質(zhì)瘤u87、u251、shg66，大腸癌scg7901，胃癌sw480的生長(zhǎng)；sfk83959抑制人原代垂體瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。skf38393抑制了gh3、u87、scg7901、sw480、hepg2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖2顯示了：裸鼠移植瘤模型證實(shí)skf83959有效抑制gh3和scg7901的細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖3顯示了：skf83959抑制mtor通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生，通過(guò)蛋白水平驗(yàn)證lc3-ii的表達(dá)，電鏡下證實(shí)存在自噬體，及共聚焦顯微鏡下觀察gfp-lc3-ii的形成。同時(shí)，抑制p-mtor及p-4ebp1蛋白表達(dá)。

圖4顯示了：sfk83959增加細(xì)胞ros介導(dǎo)細(xì)胞死亡，使用ros抑制劑nac能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡，同時(shí)，逆轉(zhuǎn)skf83959介導(dǎo)的lc3-ii表達(dá)和p-4ebp1蛋白抑制。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1sfk83959抑制細(xì)胞株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：

大鼠垂體瘤細(xì)胞株gh3和mmq(購(gòu)于atcc)，和人原代垂體腺瘤細(xì)胞(手術(shù)取下后置培養(yǎng)液直接送培養(yǎng))于37℃、5％co2條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含2.5％胎牛血清(gibco)加12.5％的馬血清的dmem/f12(gibco)。n2a細(xì)胞和其他惡性腫瘤細(xì)胞(u87、u66、u251、scg7901、sw480、hepg2)(中科院)于37℃，5％co2條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(gibco)的dmem(gibco)培養(yǎng)基。多巴胺1類受體激動(dòng)劑skf83959和skf38393購(gòu)自tocris(英國(guó))，母液50mm由dmso(sigma)配制，mts檢測(cè)細(xì)胞活性試劑購(gòu)自promega(美國(guó))。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、mts實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度skf83959作用后gh3和mmq細(xì)胞的活性

1)gh3細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為0.7×10⁴細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板貼壁過(guò)夜；mmq細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×10⁴細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中；加入含不同藥物濃度培養(yǎng)基，gh3細(xì)胞按藥物終濃度分為5組(0μm、1μm、5μm、10μm、25μm)；mmq細(xì)胞按藥物終濃度分為5組(0μm、1μm、5μm、25μm、50μm)組，每組5個(gè)副孔，每孔為100μl體系，空白對(duì)照組含dmso0.3％；

2)將給藥后的細(xì)胞于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48小時(shí)；

3)每孔加入20μlmts溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；

4)以檢測(cè)波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光度的值。計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。n＝5，實(shí)驗(yàn)平行三次。mmq細(xì)胞活性結(jié)果如圖1.a所示；gh3細(xì)胞活性結(jié)果如圖1.b所示；

2、mts實(shí)驗(yàn)檢測(cè)skf83959作用n2a細(xì)胞及其它惡性腫瘤細(xì)胞的活性

1)n2a細(xì)胞及其它惡性腫瘤細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為0.7×10⁴細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板貼壁過(guò)夜，加入含skf83959培養(yǎng)基，每個(gè)細(xì)胞株分2組，藥物終濃度均為25μm，每組5個(gè)副孔，每孔為100μl體系，空白對(duì)照組含dmso0.3％；

2)將給藥后的細(xì)胞于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48小時(shí)；

3)每孔加入20μlmts溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；

4)以檢測(cè)波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光度的值。計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。n＝5，實(shí)驗(yàn)平行三次。各細(xì)胞活性結(jié)果如圖1.c所示；

3、mts實(shí)驗(yàn)檢測(cè)skf83959作用人原代垂體瘤細(xì)胞的活性

1)人原代垂體瘤細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為0.7×10⁴細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板貼壁過(guò)夜。加入含skf83959培養(yǎng)基，每個(gè)細(xì)胞株分2組，藥物終濃度均為25μm，每組5個(gè)副孔，每孔為100μl體系，空白對(duì)照組含dmso0.3％；

2)將給藥后的細(xì)胞于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48小時(shí)；

3)每孔加入20μlmts溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；

4)以檢測(cè)波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光度的值。計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。n＝5，實(shí)驗(yàn)平行三次。

各細(xì)胞活性結(jié)果如圖1.d所示；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，skf83959能抑制各腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中，sfk83959抑制垂體瘤細(xì)胞株mmq和gh3的生長(zhǎng)，同時(shí)也抑制n2a細(xì)胞和其他惡性腫瘤細(xì)胞(u87、u66、u251、scg7901、sw480)的生長(zhǎng)；sfk83959還抑制人原代垂體瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

同樣的方法進(jìn)行skf38393實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)skf38393亦可抑制垂體瘤細(xì)胞gh3及其他惡性腫瘤細(xì)胞(u87、scg7901、sw480、hepg2)的生長(zhǎng)(如圖1.e所示)。

例2、裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：

裸鼠購(gòu)置于slac(上海)，其余同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)方法：

1)選取4周齡的裸鼠；

2)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞收集，用無(wú)血清培養(yǎng)基10ml，于1000轉(zhuǎn)/分，離心3min，連續(xù)洗3次，最后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸腫瘤細(xì)胞，密度調(diào)至1×10⁷細(xì)胞/ml，每只裸鼠腋下接種100ul(即1×10⁶個(gè)腫瘤細(xì)胞)，4天左右在裸鼠腋下可捫及腫瘤；

3)待腫瘤體積長(zhǎng)到約100mm³時(shí)分組dmso和skf83959組，給予skf83959(1mg/kg)腹腔注射，每只裸鼠體重在20g左右，每只裸鼠腹腔注射量為1μl的skf83959(50mm)+99μl生理鹽水，每天給藥一次，且用游標(biāo)卡尺量腫瘤長(zhǎng)軸與寬軸大小(單位：mm)；

4、給藥11天后，常規(guī)處理裸鼠，獲取瘤體稱重并拍照，統(tǒng)計(jì)腫瘤體重和體積，腫瘤體積＝長(zhǎng)軸×寬軸²×1/2；gh3細(xì)胞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.a、2.b、2.c示，scg7901細(xì)胞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.d、2.e、2.f示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，skf83959抑制腫瘤細(xì)胞gh3和scg7901的細(xì)胞生長(zhǎng)。

實(shí)施例3、skf83959通過(guò)抑制mtor通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生

實(shí)驗(yàn)材料：

ripa裂解液、pmsf、上樣緩沖液(5×)、bca蛋白定量盒、dapi購(gòu)自碧云天生物生物技術(shù)研究所(江蘇)；proteaseinhibitorcocktail購(gòu)自merck公司(德國(guó))。bsa購(gòu)自sigma(9048-46-8)。pbs、0.5％trypsin-edta購(gòu)自gibco?？贵w：antibodylc3(sigmal7543)、antibodygapdh(華安arh4156)、antibodyparp(cst#9542)、antibodyp-4ebp1(cst#2855)、antibodyp-mtor(cst#5536)、anti-rabbitigg(cst14708)、anti-rabbitigg-peroxidaseantibody(sigmaa0545)；強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自bio-rad公司。

實(shí)驗(yàn)方法：

1)gh3細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為4×10⁵細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中貼壁過(guò)夜，每孔含培養(yǎng)基2ml，藥物終濃度為25μm，分別作用0h、12h、24h、48h。0h為對(duì)照組，含dmso0.3％，于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)；

2)westernblot檢測(cè)lc3-ii、p-mtor、p-4ebp1的表達(dá)

(1)蛋白提取：

用前將pmsf(100mm，1:100)及proteaseinhibitorcocktailsetiii(1:200)加入ripa裂解液；

按藥物作用時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，收集細(xì)胞時(shí)，去6孔板中培養(yǎng)液，pbs輕輕洗滌細(xì)胞后，用0.05％胰酶消化gh3細(xì)胞10秒，去胰酶，加1ml完全培養(yǎng)基中和，收集于1.5mlep管，2000rpm離心5min，棄上清，加入100μl裂解液冰浴裂解30min；裂解后12000rpm離心20min；吸取上清進(jìn)行定量，同時(shí)取部分上清，加入1/4體積的上樣緩沖液(5×)，100℃煮10min；變性后的蛋白保存于-80℃冰箱中；

(2)上樣量：bca蛋白定量盒對(duì)各組提取的蛋白樣品進(jìn)行定量，校正后蛋白樣品上樣量為40μg；

(3)電泳：80v恒壓電泳30分鐘進(jìn)行樣品的濃縮；120v電泳1.5小時(shí)進(jìn)行樣品的分離，根據(jù)marker判斷電泳程度；

(4)轉(zhuǎn)膜：采用濕轉(zhuǎn)，170ma，恒流轉(zhuǎn)膜2小時(shí)；

(5)抗體雜交：首先用5％的bsa在室溫?fù)u床上封閉1小時(shí)；封閉液稀釋一抗(lc31:5000；gapdh1:2000；p-mtor1:1000；p-4ebp11:1000；parp1:1000)，將轉(zhuǎn)好的膜在雜交槽中4℃雜交過(guò)夜；tbst洗膜3次(室溫?fù)u床，每次2ml，5min)；用封閉液將二抗稀釋，在雜交槽中室溫?fù)u床雜交1小時(shí)；tbst洗膜三次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；

(6)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(ecl法)進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3.a、3.b所示，imajej統(tǒng)計(jì)p-4ebp1、p-mtor與gapdh的相對(duì)表達(dá)量(如圖3.c所示)；

電鏡檢測(cè)

按上述實(shí)驗(yàn)方法，gh3細(xì)胞給藥后48h，將細(xì)胞收集于15ml離心管中，2000rpm離心10min，后加入2.5％戊二醛中，送電鏡中心檢測(cè)，結(jié)果如圖3.d所示；

共聚焦檢測(cè)lc3表達(dá)

1)藥物處理細(xì)胞：gh3細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×10⁵細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁過(guò)夜。6孔板棄培養(yǎng)液，換成含終濃度為25μm的skf83959新鮮培養(yǎng)基；對(duì)照組換成含dmso0.3％的新鮮培養(yǎng)基，于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48h；

2)細(xì)胞甩片：6孔板棄培養(yǎng)基，0.05％胰酶消化20s后，棄胰酶，1ml完全培養(yǎng)基中和，收集細(xì)胞，通過(guò)甩片機(jī)將細(xì)胞甩至玻片上，1500轉(zhuǎn)，15min；

3)固定通透：用油性筆將細(xì)胞區(qū)圈起，向其中加入100μl丙酮進(jìn)行固定通透5min，室溫?fù)u床，tbst洗滌細(xì)胞3次，每次5min；

4)封閉：向細(xì)胞區(qū)域加入0.1％bsa200μl，將玻片放入濕盒，室溫封閉1h；

5)抗體雜交：0.1％bsa稀釋lc3(1：100)，向細(xì)胞區(qū)域加入100μl一抗稀釋液，放入濕盒，孵育過(guò)夜；室溫?fù)u床，tbst洗滌細(xì)胞4次，每次5min；0.1％bsa稀釋二抗(1：100)，向細(xì)胞區(qū)域加入100μl二抗稀釋液，放入濕盒，室溫孵育1h；室溫?fù)u床，tbst洗滌細(xì)胞4次，每次5min。抗熒光淬滅劑封片；

6)激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，拍照并統(tǒng)計(jì)lc3綠色熒光斑點(diǎn)(如圖3.e所示)。

結(jié)果表明：skf83959作用gh3細(xì)胞后，通過(guò)抑制p-mtor及p-4ebp1的表達(dá)，抑制mtor信號(hào)通路，促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白lc3的表達(dá)增加，誘導(dǎo)自噬小體的形成。

實(shí)施例4、ros介導(dǎo)sfk83959誘導(dǎo)細(xì)胞死亡試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：

ros抑制劑nac、ros檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物生物技術(shù)研究所(江蘇)，其余實(shí)驗(yàn)耗材同上。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、流式檢測(cè)skf83959作用后gh3細(xì)胞內(nèi)ros水平

1)藥物處理：gh3細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×10⁵細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁過(guò)夜，。加入含藥新鮮培養(yǎng)基分4組，分別為dmso、skf83959、nac、skf83959+nac組，使skf83959的終濃度為25μm，nac的終濃度為10μm，空白對(duì)照組含dmso0.3％。于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48h；

2)收集細(xì)胞：收集細(xì)胞時(shí)，去6孔板中培養(yǎng)液，pbs輕輕洗滌細(xì)胞后，用0.05％胰酶消化gh3細(xì)胞10秒，去胰酶，加1ml完全培養(yǎng)基中和，輕輕吹散，收集于1.5mlep管，800rpm離心5min，棄上清；

3)裝載探針：按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋dcfh-da，使終濃度為10微摩爾/升。將收集好的細(xì)胞懸浮于稀釋好的dcfh-da中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的dcfh-da；

4)流式檢測(cè)：將裝載好探針的細(xì)胞，通過(guò)488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行流式檢測(cè)(如圖4.a所示)；skf83959可使胞內(nèi)ros水平上升。

2、mts檢測(cè)ros抑制劑與skf83959作用后gh3細(xì)胞活性

1)gh3細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為0.7×10⁴細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板貼壁過(guò)夜。加入含藥新鮮培養(yǎng)基分4組，分別為dmso、skf83959、nac、skf83959+nac組，使skf83959的終濃度為25μm，nac的終濃度為10μm，每組5個(gè)副孔，空白對(duì)照組含dmso0.3％。將給藥后的細(xì)胞于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48小時(shí)；

2)每孔加入20μlmts溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；

3)以檢測(cè)波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光度的值。計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。n＝5，實(shí)驗(yàn)平行三次；細(xì)胞活性結(jié)果如圖4.b所示，結(jié)果抑制ros水平，可部分逆轉(zhuǎn)skf83959誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

3、westernblot檢測(cè)ros抑制劑與skf83959作用gh3細(xì)胞后lc3-ii與p-4ebp1的表達(dá)gh3細(xì)胞懸浮于常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×10⁵細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板貼壁過(guò)夜；加入含藥新鮮培養(yǎng)基分4組，分別為dmso、skf83959、nac、skf83959+nac組，使skf83959的終濃度為25μm，nac的終濃度為10μm，空白對(duì)照組含dmso0.3％，將給藥后的細(xì)胞于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)48小時(shí)；

提取蛋白，westernblot檢測(cè)lc3和p-4ebp1蛋白表達(dá)情況，方法同實(shí)施例3；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制ros的產(chǎn)生，均可部分逆轉(zhuǎn)skf83959誘導(dǎo)lc3表達(dá)的增加與4ebp1磷酸化活性的降低。(如圖4.c所示)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ros在skf83959誘導(dǎo)自噬引起細(xì)胞死亡過(guò)程中，起重要作用。