本發(fā)明涉及功勞木生物堿提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種基于響應(yīng)面法功勞木生物堿提取方法。
背景技術(shù)：
：功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞mahoniabealei(fort.)carr.或細葉十大功勞mahoniafortunei(lindl.)fedde的干燥莖，全年均可采收，切塊片，干燥。廣泛分布于我國江蘇、浙江、江西、福建、貴州、廣西、湖北等地。藥理研究表明功勞木具有抗菌、抗腫瘤、抗炎等活性，其藥理作用與生物堿類類成分密切相關(guān)。對于功勞木生物堿的提取方法，在現(xiàn)有技術(shù)中，如文獻號為cn103933100公開了在制備過程中，對于功勞木粗提取物的制備，采用傳統(tǒng)的回流提取技術(shù)，傳統(tǒng)的回流提取技術(shù)存在溫度高，提取時間長，溶劑量大等缺點。酶法提取是一項生物工程技術(shù)，其根據(jù)藥材特點選用恰當(dāng)?shù)纳锩?，可以在溫和的條件下將植物細胞壁降解，促進有效成分的釋放，從而達到高效提取中藥有效成分或部位的目的。酶法提取，具有提取條件溫和、能耗小，對設(shè)備無特殊要求等優(yōu)點，使得酶法提取功勞木生物堿得到了大量的研究，但是，由于酶法提取中，其對于酶用量、酶解時間、酶解溫度以及酶解ph值，均對酶法提取的產(chǎn)品的產(chǎn)率造成影響，而現(xiàn)有技術(shù)中，對于酶法提取過程中，由于其上述指標(biāo)控制不恰當(dāng)，導(dǎo)致酶法提取功勞木中的總生物堿的產(chǎn)率難以達到8％以上，而實際在功勞木中，其含有大量的生物堿成分，這不僅造成了功勞木提取生物堿資源的浪費，而且導(dǎo)致從功勞木中提取生物堿的成本較高。響應(yīng)面法，其是工藝優(yōu)化過程常用的有效方法，是以非線性擬合的回歸方程為函數(shù)計算的工具，在多因子試驗中，因子與響應(yīng)值的相互關(guān)系通過多項式擬合，把因子和響應(yīng)值的關(guān)系函數(shù)化，可對函數(shù)的面進行分析，研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進行優(yōu)化，實現(xiàn)整個工藝上的因素最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，避免傳統(tǒng)的離散分析，使得優(yōu)化后的工藝能夠得到大幅度的改善?；诖耍瑸榱四軌?qū)崿F(xiàn)酶解法提取功勞木中的生物堿，使得生物堿的產(chǎn)率得到大幅度的提高，將其提取成本，本研究者結(jié)合響應(yīng)面法和酶解提取功勞木中的生物堿進行探索，為功勞木生物堿提供一種新思路。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于響應(yīng)面法功勞木生物堿提取方法。具體是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：將功勞木干燥、粉碎，得到功勞木粉末；將功勞木粉末采用纖維素酶進行酶解處理，得到酶解液，即就是粗提液；并將粗提液進行濃縮至稠膏，采用真空干燥箱烘干后，烘干20-25h，優(yōu)選烘干24h；采用高效液相色譜法定量分析總生物堿的含量，在高效液相色譜法測定過程中，流動相采用乙腈：磷酸二氫鉀＝30:70的體積比混合溶液，其中磷酸二氫鉀摩爾濃度為0.05mmol/l，磷酸二氫鉀是采用磷酸調(diào)節(jié)ph為3.0的溶液；在液相色譜分析過程中，流速為1ml/min，并在波長為265nm下繪制功勞木中藥根堿、巴馬汀和小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體的回歸方程如下：藥根堿：y藥根堿＝3917.22x+91.80(r2＝0.9993)；巴馬?。簓巴馬汀＝4323.61x-72.90(r2＝0.9997)；小檗堿：y小檗堿＝3575.27x-130.30(r2＝0.9992)；其中y藥根堿、y巴馬汀、y小檗堿為相應(yīng)成分的量，x為取的功勞木粉末重量。功勞木總生物堿產(chǎn)率y＝[(總生物堿含量×提取物重量)/功勞木原藥材重量]×100％，總生物堿含量為藥根堿、巴馬汀及小檗堿含量之和。對纖維素酶用量、酶解時間、酶解溫度、酶解ph值作為功勞木總生物堿產(chǎn)率影響的四個因素，并將上述四個因素進行單因素試驗，確定四個因素在其他因素不變前提下的最優(yōu)水平，具體單因素試驗操作如下步驟：(1)酶用量單因素試驗以酶解時間為3.5h、酶解溫度為50℃、酶解ph為5.0，酶用量以1g功勞木計分別為10mg、12mg、14mg、16mg、18mg，并將其按照上述條件進行酶解，并測定計算出功勞木總生物堿產(chǎn)率的變化，得出曲線，計算出酶用量最優(yōu)值，其結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，在酶解時間、酶解溫度、酶解ph值相同的條件下，隨著酶用量的增加，提取所得功勞木總生物堿含量先增加后減少，這是由于隨著酶用量的增加，酶對植物細胞壁的破壞效果越顯著，當(dāng)酶用量過大，則酶相對于植物已經(jīng)達到飽和，繼續(xù)增加酶用量會障礙有效成分的溶出。因此，酶用量以16mg/g為宜。(2)酶解時間單因素試驗以酶用量16mg/g，酶解溫度50℃，酶解ph值5.0，酶解時間2h、2.5h、3h、3.5h、4h條件進行酶法提取，并測定計算出功勞木總生物堿產(chǎn)率的變化，得出曲線，計算出酶解時間最優(yōu)值，其結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，在酶用量、酶解溫度、酶解ph值相同的條件下，功勞木總生物堿產(chǎn)率隨著酶解時間的延長而升高，當(dāng)酶解時間超過3.5h時，總生物堿產(chǎn)率趨于平穩(wěn)。因此，酶解時間以3.5h為宜。(3)酶解溫度單因素試驗以酶用量16mg/g，酶解時間3.5h，酶解ph5.0，酶解溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件進行酶法提取，并測定計算出功勞木總生物堿產(chǎn)率的變化，得出曲線，計算出酶解溫度最優(yōu)值，其結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，在酶解時間、酶解ph值、酶用量相同的條件下，功勞木總生物堿產(chǎn)率隨著酶解溫度的上升而升高，這是由于隨著溫度升高，酶的活性不斷升高，有利于對植物細胞壁的破壞，從而有利于細胞內(nèi)生物堿類成分的溶出，當(dāng)溫度超過50℃時，總生物堿產(chǎn)率下降，這是由于溫度過高引起酶失活，因而降低總生物堿產(chǎn)率。因此，酶解溫度以50℃為宜。(4)酶解ph值單因素試驗以酶用量16mg/g，酶解時間3.5h，酶解溫度50℃，酶解ph值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5條件進行酶法提取，并測定計算出功勞木總生物堿產(chǎn)率的變化，得出曲線，計算出酶解ph值最優(yōu)值，其結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，在酶解時間、酶解溫度、酶用量相同的條件下，功勞木總生物堿產(chǎn)率隨著酶解ph值的增大而升高，這是由于隨著酶解ph值升高，酶的活性不斷升高，有利于對植物細胞壁的破壞，從而有利于細胞內(nèi)生物堿類成分的溶出，當(dāng)酶解ph值超過5.0時，總生物堿產(chǎn)率下降，這是由于酶解ph值過高引起酶失活，因而降低總生物堿產(chǎn)率。因此，酶解ph值以5.0為宜。在完成以上單因素試驗操作處理步驟之后，將上述單因素試驗得到的結(jié)果擬定為最優(yōu)水平，并進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，并在上述最優(yōu)水平的基礎(chǔ)上，以及在單因素試驗選取的參數(shù)基礎(chǔ)上，將最優(yōu)化參數(shù)進行水平調(diào)整，具體調(diào)整之后的水平設(shè)置表為表1：表1利用design-expert軟件根據(jù)box-benhnken設(shè)計原則進行四因素三水平實驗設(shè)計，試驗方案以及響應(yīng)結(jié)果如表2所示：表2以酶用量a、酶解時間b、酶解溫度c、酶解ph值d為自變量，以功勞木總生物堿產(chǎn)率為響應(yīng)值y，建立多元二次方程，并對多元二次方程進行計算，得出功勞木總生物堿回歸方程如下：y＝-105.7615+7.597a+11.282b+0.549c+8.103d-0.515ab+0.021ac+0.280ad+0.099bc+0.070bd-0.037cd-0.255a2-1.178b2-0.010c2-1.113d2。對上述功勞木總生物堿回歸方程進行方差分析，其結(jié)果如表3所示：表3來源平方和自由度方差f值p值模型15.84141.1370.87<0.0001a-酶用量0.4010.4025.260.0002b-酶解溫度2.90e-0212.90e-021.820.1991c-酶解ph值0.6710.6741.81<0.0001d-酶解時間4.60e-0214.60e-022.860.1130ab1.0611.06e+0066.45<0.0001ac0.7210.7245.26<0.0001ad0.3110.3119.640.0006bc0.9810.9861.39<0.0001bd1.23e-0311.23e-030.080.7858cd0.1310.138.350.0119a26.7616.76423.27<0.0001b20.5610.5635.22<0.0001c26.8716.87430.56<0.0001d20.5010.5031.44<0.0001殘差0.22141.60e-02失擬0.21102.10e-025.610.0555純誤差1.50e-0243.72e-03總和16.0628并利用design-expert軟件對多元二次回歸方程進行響應(yīng)面分析，得到回歸方程各因素相互之間的響應(yīng)面圖，如圖5～圖10所示。最終得出功勞木總生物堿的纖維素酶提取法優(yōu)化后的工藝參數(shù)為：酶用量16.14mg/g、酶解時間3.58h、酶解溫度51.81℃、酶解ph值4.93。并根據(jù)實際情況進行了工藝參數(shù)的修正，并修正為：酶用量16mg/g、酶解時間3.6h、酶解溫度52℃、酶解ph值4.9，進行三次平行試驗，其功勞木總生物堿產(chǎn)率的平均值9.94％。調(diào)整為酶用量14mg/g、酶解時間3.5h、酶解溫度50℃、酶解ph值4.5，進行三次平行試驗，其功勞木總生物堿產(chǎn)率的平均值8.84％。調(diào)整為酶用量16mg/g、酶解時間3.5h、酶解溫度40℃、酶解ph值5.5，進行三次平行試驗，其功勞木總生物堿產(chǎn)率的平均值8.47％。調(diào)整為酶用量18mg/g、酶解時間3.5h、酶解溫度60℃、酶解ph值5，進行三次平行試驗，其功勞木總生物堿產(chǎn)率的平均值8.63％。綜上可見，在本發(fā)明創(chuàng)造中，通過響應(yīng)面法對纖維素酶酶解提取功勞木中的總生物堿的工藝參數(shù)進行界定，其能夠有效的使得各個工藝參數(shù)相互之間的影響得到充分的彌補和完善，避免了單因素試驗處理之后的正交設(shè)計調(diào)整參數(shù)存在的片面性和離散型，有效的使得最佳組合參數(shù)得到綜合因素的考慮，提高了功勞木中生物堿提取參數(shù)的準(zhǔn)確性，提高了生物堿的產(chǎn)率，降低了成本。具體在處理過程中，本發(fā)明創(chuàng)造提供一種功勞木生物堿的提取方法，包括以下步驟：(1)功勞木干燥、粉碎，得到功勞木粉末；(2)稱取功勞木粉末，加入緩沖溶液，調(diào)整ph值為3.5-5.5，加入纖維素酶，加入量以1g功勞木粉加入10-18mg纖維素酶，控制溫度為30-70℃，酶解2-4h；(3)將步驟(2)酶解后的物料進行過濾，得到粗提液；(4)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提液濃縮至稠膏，并采用真空干燥箱烘干20-25h，即可。優(yōu)選，在提取過程中，包括以下步驟：(1)將功勞木烘干、粉碎，得功勞木粉末；(2)稱取功勞木粉末，加入緩沖溶液，調(diào)整ph值為4.5-5.5，加入纖維素酶，加入量以1g功勞木粉加入14-18mg纖維素酶，控制溫度為40-60℃，酶解3-4h；(3)將步驟(2)酶解后的物料進行過濾，得到粗提液；(4)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提液濃縮至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可。上述的粉末為70-90目。優(yōu)選，上述的粉末為80目。在上述工藝步驟中，所述的緩沖溶液為醋酸-醋酸鹽溶液或磷酸-磷酸二氫鹽溶液或磷酸-磷酸氫鹽溶液。所述的醋酸鹽為醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨中的一種。所述的磷酸二氫鹽為磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉中的一種；所述的磷酸氫鹽為磷酸氫鉀、磷酸氫鹽中的一種。對于在上述的提取工藝步驟中，對于工藝參數(shù)優(yōu)選為纖維素酶用量16.14mg/g、酶解時間3.58h、酶解溫度51.81℃、酶解ph值4.93；該參數(shù)的優(yōu)選，能夠?qū)崿F(xiàn)功勞木中總生物堿提取的產(chǎn)率達到9.94％以上。本發(fā)明創(chuàng)造通過對功勞木進行纖維素酶酶解法提取，并對提取過程中的纖維素酶用量、酶解時間、酶解溫度、酶解ph值等工藝參數(shù)進行合理的確定和選擇，使得功勞木總生物堿的產(chǎn)率達到了8.4％以上，有效的降低了功勞木總生物堿提取成本。附圖說明圖1為酶用量對功勞木總生物堿產(chǎn)率的影響圖；圖2為酶解時間對功勞木總生物堿產(chǎn)率的影響圖；圖3為酶解溫度對功勞木總生物堿產(chǎn)率的影響圖；圖4為酶解ph值對功勞木總生物堿產(chǎn)率的影響圖；圖5為酶用量和酶解時間對功勞木總生物堿產(chǎn)率影響的響應(yīng)面三維圖；圖6為酶用量和酶解溫度對功勞木總生物堿產(chǎn)率影響的響應(yīng)面三維圖；圖7為酶用量和酶解ph值對功勞木總生物堿產(chǎn)率影響的響應(yīng)面三維圖；圖8為酶解時間和酶解溫度對功勞木總生物堿產(chǎn)率影響的響應(yīng)面三維圖；圖9為酶解時間與酶解ph值對功勞木總生物堿產(chǎn)率影響的響應(yīng)面三維圖；圖10為酶解溫度和酶解ph值對功勞木總生物堿產(chǎn)率影響的響應(yīng)面三維圖。具體實施方式下面結(jié)合具體的實施方式來對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的限定，但要求保護的范圍不僅局限于所作的描述。實施例1將功勞木干燥、粉碎成80目，得到功勞木粉末；稱取功勞木粉末10.0000g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，調(diào)整ph值為4.5，加入纖維素酶140mg，在50℃下酶解3.5h；將酶解后的物料進行過濾，得到粗提液；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提液濃縮至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到生物堿。稱取上述生物堿，采用無水甲醇溶解，稀釋后，采用高效液相色譜法測定功勞木總生物堿量，并根據(jù)生物堿產(chǎn)率y＝[(總生物堿含量×提取物重量)/功勞木原藥材重量]×100％，總生物堿含量為藥根堿、巴馬汀及小檗堿含量之和；計算出生物堿產(chǎn)率為8.84％。實施例2將功勞木干燥、粉碎成80目，得到功勞木粉末；稱取功勞木粉末10.0000g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液，調(diào)整ph為5.5，加入纖維素酶160mg，在40℃下酶解3.5h；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提液濃縮至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到生物堿。稱取上述生物堿，采用無水甲醇溶解，稀釋后，采用高效液相色譜法測定功勞木總生物堿量，并根據(jù)生物堿產(chǎn)率y＝[(總生物堿含量×提取物重量)/功勞木原藥材重量]×100％，總生物堿含量為藥根堿、巴馬汀及小檗堿含量之和；計算出生物堿產(chǎn)率為8.47％。實施例3將功勞木干燥、粉碎成80目，得到功勞木粉末；稱取功勞木粉末10.0000g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液，調(diào)整ph為5，加入纖維素酶180mg，在60℃下酶解3.5h；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提液濃縮至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到生物堿。稱取上述生物堿，采用無水甲醇溶解，稀釋后，采用高效液相色譜法測定功勞木總生物堿量，并根據(jù)生物堿產(chǎn)率y＝[(總生物堿含量×提取物重量)/功勞木原藥材重量]×100％，總生物堿含量為藥根堿、巴馬汀及小檗堿含量之和；計算出生物堿產(chǎn)率為8.63％。實施例4將功勞木干燥、粉碎成80目，得到功勞木粉末；稱取功勞木粉末10.0000g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液，調(diào)整ph為4.9，加入纖維素酶160mg，在52℃下酶解3.6h；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提液濃縮至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到生物堿。稱取上述生物堿，采用無水甲醇溶解，稀釋后，采用高效液相色譜法測定功勞木總生物堿量，并根據(jù)生物堿產(chǎn)率y＝[(總生物堿含量×提取物重量)/功勞木原藥材重量]×100％，總生物堿含量為藥根堿、巴馬汀及小檗堿含量之和；計算出生物堿產(chǎn)率為9.94％。實施例5將功勞木干燥、粉碎成80目，得到功勞木粉末；稱取功勞木粉末10.0000g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液，調(diào)整ph為4.93，加入纖維素酶161.4mg，在51.81℃下酶解3.58h；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將粗提液濃縮至稠膏，并采用真空干燥箱烘干24h，即可得到生物堿。稱取上述生物堿，采用無水甲醇溶解，稀釋后，采用高效液相色譜法測定功勞木總生物堿量，并根據(jù)生物堿產(chǎn)率y＝[(總生物堿含量×提取物重量)/功勞木原藥材重量]×100％，總生物堿含量為藥根堿、巴馬汀及小檗堿含量之和；計算出生物堿產(chǎn)率為9.96％。在本發(fā)明創(chuàng)造的某些實施例中，對于干燥粉碎后的粉末顆粒度在70-90目之間；在某些實施例中采用緩沖液為醋酸-醋酸鹽溶液或磷酸-磷酸二氫鹽溶液或磷酸-磷酸氫鹽溶液。上述的醋酸鹽為醋酸鉀、醋酸銨中的一種。上述的磷酸二氫鹽為磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉中的一種；所述的磷酸氫鹽為磷酸氫鉀、磷酸氫鹽中的一種。在某些實施例中，對于采用真空干燥箱烘干的時間為20h或者25h，或者介于20-25h之間。最后應(yīng)說明的是：以上例舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或者聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁12