本發(fā)明涉及一種響應(yīng)面法提取單面針總生物堿，并利用大孔樹(shù)脂進(jìn)行產(chǎn)物純化分離的提取制備方法，屬于植物有效成分提取
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：：?jiǎn)蚊驷?zanthoxylumdissitumhemsl)又名蜆殼花椒。根、莖及葉均可入藥，臨床上有散瘀止痛、解毒消腫之功效，主治牙痛、腰痛、婦女月經(jīng)過(guò)多，產(chǎn)后月經(jīng)不調(diào)等癥；研究表明單面針中活性生物堿為主要藥用成分，其中目前已知的單面針?biāo)飰A有白蘚堿、兩面針堿、花椒堿、茵芋堿、血根堿、花椒棚堿等多種生物堿對(duì)炎癥以及抑制腫瘤都有效果。近年來(lái)，由于中成藥生產(chǎn)規(guī)模日趨擴(kuò)大，而單面針的自然繁殖率低下，生長(zhǎng)也較為緩慢，致使該天然資源日趨貧乏，供不應(yīng)求，并逐漸威脅著相關(guān)藥廠的正常生產(chǎn)。因此，尋求適宜的有效成分提取制備工藝對(duì)其資源的充分利用至關(guān)重要。響應(yīng)面法的提取優(yōu)化，是一種工藝條件優(yōu)化的有效方法，建立連續(xù)變量曲面模型、回歸方程來(lái)擬合多個(gè)響應(yīng)變量和一系列試驗(yàn)變量之間的關(guān)系,考察不同試驗(yàn)因素及其交互作用對(duì)目標(biāo)響應(yīng)值的影響。該方法能經(jīng)濟(jì)、有效、快速地確定多試驗(yàn)因素的最佳組合條件。本研究以混合提取溶液為溶劑,考查了不同體積分?jǐn)?shù)混合溶液、液料比、微波提取時(shí)間、溫度對(duì)單面針總生物堿的影響規(guī)律，利用響應(yīng)面法分析得到最佳提取工藝。大孔樹(shù)脂是一種聚合物吸附劑，對(duì)有機(jī)物具有濃縮、分離作用的高分子聚合物，選擇合適的樹(shù)脂類(lèi)型可有效起到特定有機(jī)物的分離提純作用，通過(guò)考查分離提純過(guò)程中的ph、混合提取液體積分?jǐn)?shù)、上樣液流速、洗脫液流速、洗脫液用量對(duì)所選大孔樹(shù)脂的吸附率與解吸附的影響。獲得了蜆殼花椒微波提取的優(yōu)化工藝的同時(shí)，也完善了其分離純化工藝。并作出分離提純后的活性生物堿抑菌實(shí)驗(yàn)比對(duì)，驗(yàn)證其純化工藝可有效的得到純度較高的單面針總生物堿。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)已有的單面針有效成分生物堿提取技術(shù)中：提取效率低、有效成分活性低、雜質(zhì)較高等缺陷，提供了一種響應(yīng)面法優(yōu)化單面針總生物堿的微波提取法，以及分離純化工藝。一種單面針總生物堿的提取及分離純化方法，先將單面針根莖混合磨粉，加入乙醇-丙酮混合溶液，進(jìn)行微波提取；所得提取液再利用樹(shù)脂進(jìn)行分離純化得到單面針總生物堿。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中單面針根、莖按照質(zhì)量比例1:2的混合。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中將單面針根莖混合打粉過(guò)60目篩，獲得根莖粉末。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中乙醇與丙酮的體積比為1:1。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中微波提取時(shí)，乙醇-丙酮混合溶液的體積百分比為70～90％，其余為水；料液比為15:1～25:1ml.g-1；提取溫度為50～70℃；提取時(shí)間為15～25min。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中微波提取時(shí)優(yōu)選，乙醇-丙酮混合溶液的體積百分比為89％，其余為水；料液比為21:1ml.g-1；提取溫度為70℃；提取時(shí)間為20min。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中微波功率為300w。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中微波提取次數(shù)為2次，且等待第一次提取體系恢復(fù)室溫后進(jìn)行第二次提取。兩次提取的時(shí)間總和，除開(kāi)中間冷卻的時(shí)間，為40分鐘。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中樹(shù)脂選用nka-9大孔吸附樹(shù)脂。作為進(jìn)一步的改進(jìn)，上述方法中分離純化的具體條件為：生藥與樹(shù)脂質(zhì)量比為1:1，調(diào)節(jié)上樣液ph為7.0，上樣流速2bv/h，洗脫時(shí)用6bv80％的1:1體積的乙醇-丙酮混合液以2bv/h的速度進(jìn)行洗脫。本發(fā)明將多年生的單面針根莖晾干打碎過(guò)60目篩后按根莖粉末1:2混合，處理得到混合根莖粉，稱(chēng)取一定量的單面針根莖粉加入容器中，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的混合溶液，設(shè)定不同溫度、料液比進(jìn)行微波提取。所得提取液在利用大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附和解吸達(dá)到分離純化單面針總生物堿的目的，得到純化后的單面針總生物堿提取液；上述響應(yīng)面法設(shè)定提取的變量參數(shù)通過(guò)以下回歸方程：y＝-43.05333+0.93982a+0.89240b+13.24900c-0.36270d+3.49700ab+0.049500ac+7.197ad-6.997bc-2.496bd+0.011500cd-9.15250a2-0.027560b2-4.1010c2-1.912d2。上述中，y為響應(yīng)值及單面針總生物堿的提取量；設(shè)定變量a為混合提取液體積分?jǐn)?shù)、b為料液比；c為微波時(shí)間；d為提取溫度；所述a為70～90％；所述b為15:1～25:1ml.g-1；所述c為15～25min；所述d為50～70℃。單面針總生物堿含量測(cè)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的總生物堿提取液稀釋相應(yīng)體積后測(cè)定吸光值，對(duì)照白蘚堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出提取液中總生物堿的濃度，計(jì)算出所得總生物堿質(zhì)量，最后計(jì)算出單面針總生物堿的提取量。計(jì)算公式如下；上述白蘚堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程的得到：精密稱(chēng)取白蘚堿標(biāo)準(zhǔn)品1.2mg溶于25ml無(wú)水乙醇中，配制成48μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，分別精密吸取白蘚堿標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml置于10ml容量瓶中，無(wú)水乙醇定容至刻度。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在310nm處測(cè)定各溶液吸光度，以濃度c(ug/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度a為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性回歸方程a＝32.5c-0.0085，r＝0.9991。本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用微波法提取單面針總生物堿得到的優(yōu)化模擬方程：y＝-43.05333+0.93982a+0.89240b+13.24900c-0.36270d+3.49700ab+0.049500ac+7.197ad-6.997bc-2.496bd+0.011500cd-9.15250a2-0.027560b2-4.1010c2-1.912d2。由響應(yīng)面分析得到的優(yōu)化提取工藝為優(yōu)化的單面針總生物堿最佳提取工藝條件為:乙醇-丙酮(1:1)混合液體積分?jǐn)?shù)89％、料液比21ml/g、微波時(shí)間20min、提取溫度70℃，此工藝條件下提取單面針總生物堿量為12.35mg/g，與模型預(yù)測(cè)理論值僅相差0.032mg/g。后期nka-9大孔樹(shù)脂用于單面針總生物堿的分離純化，生藥與樹(shù)脂質(zhì)量比為1:1(g/g)，調(diào)節(jié)上樣液ph為7.0，上樣流速2bv/h，洗脫時(shí)，用6bv80％乙醇-丙酮(1：1)混合溶液以2bv/h的速度進(jìn)行洗脫，所得總生物堿平均純度為70.9％，抑菌實(shí)驗(yàn)表明所提生物堿對(duì)特定菌具有良好的抑菌性。其提取分離純化快速經(jīng)濟(jì)，完善了單面針總生物堿的提取制備工藝，較已報(bào)道的提取工藝更加高效快速。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例3中提取溶劑濃度對(duì)提取效果的影響；圖2是實(shí)施例4中料液比對(duì)總生物堿提取效果的影響；圖3是實(shí)施例5中微波時(shí)間對(duì)總生物堿提取效果的影響；圖4是實(shí)施例6中溫度對(duì)總生物堿提取率效果的影響；圖5是實(shí)施例7中各提取因素間兩兩相互作用對(duì)總生物堿提取效果影響；圖6是實(shí)施例9中總生物堿分離純化過(guò)程中樣液ph對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響；圖7是實(shí)施例10中總生物堿分離純化過(guò)程中生藥與樹(shù)脂比例對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響；圖8是實(shí)施例11中總生物堿分離純化過(guò)程中混合液體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響；圖9是實(shí)施例12中總生物堿分離純化過(guò)程中上樣液流速對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響；圖10是實(shí)施例13中總生物堿分離純化過(guò)程中洗脫液流速對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響；圖11是實(shí)施例14中總生物堿分離純化過(guò)程中洗脫液用量對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方式，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，其具體實(shí)施方式僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。以下實(shí)施例1為微波提取法的溶劑選擇，實(shí)施例2為根莖混合比例與粒徑選擇對(duì)單面針總生物堿提取的影響，依照實(shí)際工業(yè)操作選擇最適合的根莖混合比例與粒徑以確保提取效果的同時(shí)降低成本。實(shí)施例3至6分別選用不同的提取液濃度、料液比、微波時(shí)間以及溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考查單個(gè)因素對(duì)單面針總生物堿的提取量的影響。實(shí)施例7在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用design-expert.v8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面法分析，以總生物堿的提取量(y)為響應(yīng)值，混合液濃度(a)、料液比(b)、提取時(shí)間(c)、提取溫度(d)為變量參數(shù)，對(duì)單面針總生物堿的提取過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)施例8至14從5種樹(shù)脂材料中篩選最適大孔樹(shù)脂進(jìn)行總生物堿的分離提純，并通過(guò)初提液的ph、生藥與樹(shù)脂比例、混合液體積分?jǐn)?shù)、上樣液流速、洗脫液流速以及用量逐步確立此大孔樹(shù)脂的最佳吸附和解析率即最佳純化分離條件，實(shí)施例15對(duì)分離提純后的單面針總生物堿進(jìn)行體外抑菌測(cè)試，驗(yàn)證其抑菌效果。實(shí)施例1不同溶劑對(duì)微波提取效果的影響稱(chēng)取10份經(jīng)真空干燥后的單面針根莖混合生藥粉各10g，分別加入20ml1％(v/v)的氨水浸潤(rùn)，然后以蒸餾水、無(wú)水乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇-乙酸乙酯(v∶v＝1：1)、乙醇-正丁醇(v∶v＝1∶1)、乙醇-氯仿(v∶v＝1∶1)、乙醇-丙酮(v∶v＝1∶1)為提取溶劑，將生藥粉與10倍量的溶劑裝入燒瓶?jī)?nèi)混勻，浸泡15h后70℃微波提20min，提取液濃縮制得浸膏，計(jì)算水溶性生物堿提取量，結(jié)果如表1所示。所以選擇乙醇-丙酮(1:1)混合溶液為提取劑。表1不同溶劑微波提取單面針效果實(shí)施例2不同粒徑與混合比例的根莖粉末對(duì)微波提取效果的影響分別稱(chēng)取5份干燥的單面針根與莖粉末，分別過(guò)40、60、80、100目篩，過(guò)篩后按照1:1、1:2、1:3的比例混合為5g混合樣。分別加入80％的混合提取溶劑50ml，料液比20g/ml，浸泡15h后于70℃微波提取20min，過(guò)濾，濾渣用相同方法重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，計(jì)算總生物堿提取量，結(jié)果如表2所示，不同粒徑、不同根莖混合比例同樣會(huì)對(duì)單面針總生物堿的提取效果產(chǎn)生影響。表2不同根莖混合比例與過(guò)篩數(shù)目對(duì)提取單面針效果根莖混合比例1:1根莖混合比例1:2根莖混合比例1:340目篩9.02mg/g8.11mg/g8.21mg/g60目篩11.25mg/g11.21mg/g8.24mg/g80目篩11.31mg/g11.23mg/g8.52mg/g100目篩11.56mg/g11.32mg/g8.54mg/g單面針根莖打粉過(guò)程中，根的硬度較高，往往需進(jìn)行多次打粉才可得到根粉，而根中的生物堿含量也相對(duì)高于莖。為符合實(shí)際工業(yè)提取，因而調(diào)整根莖粉末混合比例，盡量提高莖的使用率可節(jié)約材料的消耗減少浪費(fèi)，同時(shí)為了得到較高的總生物堿提取率，適宜的粒徑大小也會(huì)提高微波提取效率，綜合以上因素降，低材料的損耗以及提取成本，同時(shí)保障一定的提取效率選用過(guò)60目篩的根莖粉末及粒徑約為250微米的根莖粉末按1:2的比例混合提取，此混合比例雖不是最佳生物堿提取比例，但相對(duì)其它混合比例與粒徑要求在成本與材料消耗反面相對(duì)最低且接近最佳值。實(shí)施例3提取溶劑濃度對(duì)提取效果的影響稱(chēng)取5份干燥的單面針根莖粉末，每份5g。分別加入50％、60％、70％、80％、90％的混合提取溶劑50ml，料液比20g/ml，浸泡15h后于70℃微波提取20min，過(guò)濾，濾渣用相同方法重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，計(jì)算總生物堿提取量。在混合提取液體積分?jǐn)?shù)為50％～90％范圍內(nèi)，隨著混合提取液體積分?jǐn)?shù)增加，總生物堿提取率逐漸增加。當(dāng)混合提取液體積分?jǐn)?shù)大于80％時(shí)，總生物堿提取率降低(圖1)。因此混合液體積分?jǐn)?shù)為80％時(shí)，提取液的極性與單面針總生物堿的極性最接近，生物堿的溶出率最高。實(shí)施例4料液比對(duì)總生物堿提取效果的影響稱(chēng)取5份干燥的單面針根莖粉末，每份5g，分別加入80％的混合提取液25、50、75、100、125ml，浸泡15h后于70℃超聲提取20min，過(guò)濾，濾渣用相同方法重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，計(jì)算總生物堿提取量。隨著料液比的增加，兩相間的濃度差增大，有利于總生物堿的擴(kuò)散溶出，總生物堿的提取率不斷增加；當(dāng)料液比達(dá)到1:20時(shí)，總生物堿的溶出趨于完全，提取量隨料液比的增加趨勢(shì)變化不大(圖2)，且料液比過(guò)大會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本增高以及后續(xù)過(guò)濾濃縮時(shí)間長(zhǎng)雜質(zhì)增多，總生物堿損失多等，故選取適宜料液比為1:20。實(shí)施例5微波時(shí)間對(duì)總生物堿提取效果的影響稱(chēng)取5份干燥的單面針根莖粉末，每份5g，分別加入80％的混合提取液50ml，浸泡15h后分別于70℃微波提取5、10、15、20、25min，過(guò)濾，濾渣用相同方法重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，計(jì)算總生物堿提取量。隨著提取時(shí)間增加，總生物堿的提取率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)20min，提取量增加不明顯，此時(shí)，總生物堿基本溶出，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致生物堿在較高的微波能量下不穩(wěn)定，成分逐漸被微波加熱升溫破壞，生物堿的提取總量反而會(huì)下將(圖3)，且較長(zhǎng)時(shí)間的微波能量會(huì)使細(xì)胞更大程度的破碎使之有更多的內(nèi)容物釋放出來(lái)造成雜質(zhì)提高，不易與后期純化，因此超聲時(shí)間20min最佳。實(shí)施例6溫度對(duì)總生物堿提取率的影響稱(chēng)取5份干燥的單面針根莖粉末，每份5g，分別加入80％的混合溶劑50ml，浸泡15h后分別于50、60、70、80、90℃微波提取15min，過(guò)濾，濾渣用相同方法重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，計(jì)算總生物堿提取量。隨著溫度升高，總生物堿提取量隨溫度升高而增加；溫度大于50℃，總生物堿提取量增加不顯著，且60℃時(shí)達(dá)到峰值(圖4)。說(shuō)明此條件下總生物堿提取基本完全。溫度過(guò)高會(huì)加速乙醇-丙酮揮發(fā)使其生物堿溶解性降低，影響提取效果，同時(shí)會(huì)造成生物堿過(guò)熱分解，使提取量降低。因此選擇最佳提取溫度60℃。實(shí)施例7響應(yīng)面法優(yōu)化單面針總生物堿的提取工藝在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用design-expert.v8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)。選取混合液體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素作實(shí)驗(yàn)因素，以總生物堿提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。表3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)平均值。note：thedateintableisthemeanofthreerepeatedexperiments.以a(混合提取液體積分?jǐn)?shù)％)、b(料液比ml/g)、c(微波時(shí)間min)、d(溫度℃)為自變量，單面針總生物堿提取量為響應(yīng)值，共進(jìn)行29組響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)誤差，24個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析，得到以單面針總生物堿提取量為響應(yīng)的回歸方程：y＝-43.05333+0.93982a+0.89240b+13.24900c-0.36270d+3.49700ab+0.049500ac+7.197ad-6.997bc-2.496bd+0.011500cd-9.15250a2-0.027560b2-4.1010c2-1.912d2。對(duì)表2數(shù)據(jù)分析，該回歸模型p值為0.0319小于0.05，其決定系數(shù)r2＝0.8369，純誤差項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該擬合方程有顯著影響與實(shí)際情況相符合。表4響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析注：*表示顯著，**表示極顯著。note：*and**indicatedsignificanceat0.05and0.01levels,respectively失擬項(xiàng)p值大于0.1表明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該數(shù)學(xué)模型擬合良好誤差較小。該擬合方程能充分反映出響應(yīng)值與各因素間的關(guān)系，其影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素之間存在一定的交互作用，其中a、b2、c2為極顯著影響p值均小于0.01，c、ac、ad、bc、a2為顯著影響。進(jìn)而從單因素水平來(lái)看可以得出其影響順序?yàn)?a(混合提取液體積分?jǐn)?shù)％)>c(微波時(shí)間min)>b(料液比ml/g)>d(溫度℃)。在有交互作用存在下，對(duì)單面針總生物堿提取量的影響順序?yàn)?ac>bc>ad>ab>cd>bd。利用design-expert.v8.0.6軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出最佳提取單面針總生物堿工藝條件為:混合提取液體積分?jǐn)?shù)88.87％、料液比21.23ml/g、微波時(shí)間20min、提取溫度70℃時(shí)單面針總生物堿提取量可達(dá)到12.382mg/g，結(jié)合實(shí)際操作時(shí)的局限性，最終得出最佳提取工藝條件為:混合液體積分?jǐn)?shù)89％、料液比21ml/g、微波時(shí)間20min、提取溫度70℃，按此優(yōu)化提取工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值為總生物堿提取量為12.35mg/g，與理論值相差0.032mg/g，證明此響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件可靠。實(shí)施例85種大孔樹(shù)脂的選擇取處理好的5種型號(hào)大孔樹(shù)脂各1g，分別置于50ml錐形瓶中，各加入上述方法制備的總生物堿原液30ml，室溫下120r/min搖床24h至吸附平衡。過(guò)濾，測(cè)定濾液中總生物堿濃度，計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率。將過(guò)濾后的大孔樹(shù)脂用濾紙吸干后置于50ml錐形瓶中，分別加入70％乙醇-丙酮(1:1)混合液30ml，室溫下120r/min搖床24h至解吸平衡。測(cè)定解吸液中總生物堿濃度，計(jì)算解吸率。以總生物堿的吸附率和解吸率為指標(biāo)，篩選出最適于總生物堿分離純化的樹(shù)脂類(lèi)型。上述吸附率和解吸率計(jì)算方法：吸附率p＝((c0－c1)×100％)/c0解吸率d＝(c×v0)/(q×m)×100％吸附量＝((c0－c1)×v)/m上述式中：q為吸附量(mg/g)，c0為總生物堿提取液初始濃度(mg/ml)，c1為吸附后總生物堿溶液濃度，v為總生物堿溶液體積，m為樹(shù)脂質(zhì)量，c為解吸液濃度(mg/ml)，v0為解吸液體積。結(jié)果如表5所示表55種大孔樹(shù)脂對(duì)總生物堿靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果由表4結(jié)果可見(jiàn)，nka-9型樹(shù)脂的比吸附量、吸附率、解吸率3個(gè)指標(biāo)均明顯高于其他4種樹(shù)脂，說(shuō)明nka-9型樹(shù)脂適用于單面針總生物堿的分離純化，因此本工藝選擇nka-9型樹(shù)脂用于單面針總生物堿的分離純化。實(shí)施例9樣液ph對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響精密稱(chēng)取1.0g預(yù)處理好的nka-9樹(shù)脂5份，分別置于50ml錐形瓶中，各加入ph值(用鹽酸和氨水調(diào)節(jié))為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的總生物堿提取液30ml，室溫下120r/min搖床24h至吸附平衡。過(guò)濾，測(cè)定濾液中總生物堿濃度，計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率。如圖6樣液ph值顯著影響大孔樹(shù)脂對(duì)總生物堿的吸附，在不同的ph條件下，樣液中總生物堿的存在狀態(tài)不同，與樹(shù)脂的結(jié)合能力存在差異，因此影響樹(shù)脂的吸附。在ph4.0-7.0范圍內(nèi)，隨著ph的增加，大孔樹(shù)脂吸附率逐漸增加，ph為8.0時(shí)，吸附率有所降低，說(shuō)明ph為7.0時(shí)最有利于大孔樹(shù)脂對(duì)總生物堿的吸附，因此，確定上樣液ph為7.0。實(shí)施例10生藥與樹(shù)脂比例對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響精密稱(chēng)取1.0g預(yù)處理好的nka-9樹(shù)脂5份，分別置于錐形瓶中，分別加入總生物堿提取液10、20、30、40、50ml(相當(dāng)于生藥與樹(shù)脂質(zhì)量之比為0.5、1、1.5、2、2.5g/g)，調(diào)節(jié)ph值為7.0，室溫下120r/min搖床24h至吸附平衡。過(guò)濾，測(cè)定濾液中總生物堿濃度，計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附率。如圖7生藥與樹(shù)脂比例為0.5-1時(shí)，樹(shù)脂對(duì)總生物堿的吸附率較高，幾乎將提取液中的生物堿完全吸附；隨著比例的增加，生物堿的吸附率明顯降低，生藥與樹(shù)脂比例為2.5時(shí)，生物堿吸附率只有54.3％，因此，為了達(dá)到最佳吸附效果，生藥與樹(shù)脂比例確定為1:1。實(shí)施例11乙醇-丙酮混合液體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響取上述吸附飽和的nka-9樹(shù)脂，用20ml蒸餾水沖流后置于50ml錐形瓶中，分別加入30ml體積分?jǐn)?shù)為50％、60％、70％、80％、90％的乙醇-丙酮(1:1)混合液，室溫下120r/min搖床24h至解吸平衡。測(cè)定解吸液中總生物堿濃度，計(jì)算解吸率。利用大孔樹(shù)脂分離純化總生物堿解吸附時(shí)，解吸率通常會(huì)隨著乙醇濃度的增加而增加，且花椒中的生物堿主要存在于70％-90％乙醇-丙酮混合液洗脫液部分。由圖8可見(jiàn)，乙醇-丙酮混合液濃度為80％時(shí)樹(shù)脂的解吸率最高，濃度過(guò)高時(shí)，解析液中雜質(zhì)的含量會(huì)增多，因此，選擇80％乙醇-丙酮混合液作為該實(shí)驗(yàn)洗脫液。實(shí)施例12上樣液流速對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響取1.0g已預(yù)處理的nka-9樹(shù)脂5份，濕法裝柱。將上樣液分別以1、2、3、4、5bv/h流過(guò)樹(shù)脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。收集流出液，測(cè)定總生物堿濃度，計(jì)算吸附率。由圖9可見(jiàn)，隨著上樣液流速的增加，總生物堿的吸附率呈下將趨勢(shì)，說(shuō)明流速大不利于生物堿的吸附，可能是因?yàn)榱魉俅髸r(shí)生物堿不能充分和樹(shù)脂接觸，導(dǎo)致吸附率降低。綜合吸附率和時(shí)間成本，選擇上樣液流速為2bv/h。實(shí)施例13洗脫液流速對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響取5bv80％乙醇-丙酮混合液5份分別以1、2、3、4、5bv/h流速通過(guò)已經(jīng)達(dá)到吸附飽和的樹(shù)脂柱(先用2bv蒸餾水洗去雜質(zhì))進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸附，考察洗脫液流速對(duì)解吸率的影響。由圖10可見(jiàn)，洗脫液流速對(duì)樹(shù)脂解吸率有一定影響，洗脫液流速為2bv/h時(shí)解吸率最高，隨著流速增加，樹(shù)脂洗脫率逐漸降低，因此，洗脫液流速選擇2bv/h。實(shí)施例14洗脫液用量對(duì)樹(shù)脂解吸附的影響取吸附飽和的樹(shù)脂柱，用2bv蒸餾水洗去雜質(zhì)，80％乙醇-丙酮(1:1)混合液以2bv/h進(jìn)行洗脫，每隔1bv收集洗脫液測(cè)定生物堿濃度，確定洗脫劑用量。由圖11可見(jiàn)，隨著洗脫液用量的增加，樹(shù)脂累積解吸率逐漸增加，當(dāng)洗脫液用量達(dá)到6bv時(shí)，累積解吸率達(dá)到86.6％，累積解吸率幾乎不再增加，收集的洗脫液中也幾乎檢測(cè)不到生物堿，說(shuō)明解吸附已基本完成，因此，洗脫液用量確定為6bv。實(shí)施例15提取純化后單面針總生物堿體外抑菌研究通過(guò)響應(yīng)面所得最佳提取工藝提取的單面針總生物堿分離純化后，用無(wú)菌蒸餾水將濃縮液稀釋為0.10，0.15，0.2，0.25，0.30，0.35，0.40mg/ml7組濃度梯度，另作陽(yáng)性與陰性對(duì)照進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表6。表6單面針總生物堿提取濃縮液最小抑菌濃度和最小殺菌濃度注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值?！?”表示有菌生長(zhǎng)；“++”表示細(xì)菌生長(zhǎng)較茂盛；“+++”表示細(xì)菌生長(zhǎng)茂盛；“－”表示無(wú)菌生長(zhǎng)。分離純化后的單面針總生物堿對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念球菌3種供試菌的最小抑菌濃度分別為0.35，0.20，0.25mg/ml，最低殺菌分別是0.30，0.25，0.30mg/ml。3種菌中白色念珠菌具有較強(qiáng)的抗藥生物膜特征，以往的抗生素和殺菌劑很難穿透真菌生物膜接觸到念珠菌表面發(fā)揮作用，而白蘚堿對(duì)白色念珠菌生物膜具有抑制作用使白色念珠菌生長(zhǎng)停滯，因此，間接說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件下提取的單面針總生物堿中白蘚堿含量、純度較高，此提取純化工藝穩(wěn)定可靠。以上實(shí)施方式僅用于說(shuō)明本發(fā)明，并非對(duì)本發(fā)明的限制，相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
：的普通技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下,還可以做出各種變化和變型,因此所有等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇,本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12