本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及具有抗腫瘤作用的重樓生物堿的提取物及其制法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：重樓原名蚤休，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品。重樓為百合科植物云南重樓parispolyphyllasmithvar.yunnanensis(franch.)hand.-mazz.或七葉一枝花parispolyphyllasmithvar,chinensis(franch.)hara的干燥根莖。秋季采挖，除去須根，洗凈，曬干。主產(chǎn)于云南，四川、廣西、陜西、江西、江蘇等省區(qū)。重樓味苦，性微寒；有小毒。歸肝經(jīng)。具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚的作用，用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，跌撲傷痛，驚風(fēng)抽搐。重樓藥材呈結(jié)節(jié)狀扁圓柱形，略彎曲，長(zhǎng)5～12cm，直徑1.0～4.5cm。表面黃棕色或灰棕色，外皮脫落處呈白色；密具層狀突起的粗環(huán)紋，一面結(jié)節(jié)明顯，結(jié)節(jié)上具橢圓形凹陷莖痕，另一面有疏生的須根或疣狀須根痕。頂端具鱗葉和莖的殘基。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面平坦，白色至淺棕色，粉性或角質(zhì)。氣微，味微苦、麻?，F(xiàn)代研究表明，重樓含有多種化學(xué)成分，主要為甾體皂苷類成分，約占總化合物數(shù)目的80％，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物。重樓具有抑制腫瘤及其減輕癌性疼痛的作用，其發(fā)揮作用的是皂苷類成分。未有研究表明重樓的生物堿類成分的生理活性。因此，提供重樓生物堿類成分的抗腫瘤研究，為其綜合利用提供依據(jù)，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供具有抗腫瘤作用的重樓生物堿的提取物，解決了現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有對(duì)重樓生物堿類成分的制備及利用的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明還提供了具有抗腫瘤作用的重樓生物堿的提取物的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供重樓生物堿的提取物在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的具有抗腫瘤作用的重樓生物堿的提取物，該提取物由重樓藥材經(jīng)酸性溶液提取后，再堿化沉淀，將所述沉淀溶解上大孔樹脂，用醇洗脫制得。本發(fā)明所述的提取物的制備方法，包括以下步驟：步驟1：取重樓藥材，加入酸性水溶液，浸泡后，加熱提取，過(guò)濾，收集濾液備用；步驟2：調(diào)節(jié)所述濾液的ph值至堿性，冷藏，靜置，離心，收集沉淀，用水沖洗至洗出液呈中性；步驟3：將洗滌至中性的沉淀加乙醇溶解后，加入大孔吸附樹脂吸附24－48小時(shí)，過(guò)濾，收集大孔吸附樹脂裝柱，然后依次用水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液洗脫，收集70％乙醇洗脫液；步驟4：將所述70％乙醇洗脫液濃縮，低溫干燥，即得。進(jìn)一步地，取重樓藥材，加入5倍藥材質(zhì)量的酸性水溶液，室溫浸泡48－72小時(shí)后，于50－60℃加熱提取3－5次，每次2－4小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液備用；進(jìn)一步地，所述酸性水溶液為鹽酸溶液，硫酸溶液，磷酸溶液中的一種，所述酸性水溶液中氫離子濃度為4－6mol/l。進(jìn)一步地，所述步驟2中調(diào)節(jié)濾液的ph值大于8。進(jìn)一步地，所述步驟2中調(diào)節(jié)濾液的ph值為10－14。進(jìn)一步地，所述大孔吸附樹脂的型號(hào)為ab-8、d301或d201，其用量按每克重樓藥材計(jì)，為0.02－0.04g。進(jìn)一步地，所述步驟3中的水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液的用量按每克重樓藥材計(jì)為1－2ml，所述洗脫速度按每克大孔樹脂計(jì)為0.2－0.4ml/min。進(jìn)一步地，所述步驟4中的低溫干燥為冷凍干燥。本發(fā)明所述的提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明工藝簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)便，所得提取物抗腫瘤效果確切。本發(fā)明采用酸提堿沉法進(jìn)行生物堿的提取與分離，再采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附與分離，實(shí)現(xiàn)了重樓藥材中生物堿的提取與純化，工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，且對(duì)環(huán)境友好。本發(fā)明所得提取物經(jīng)藥理試驗(yàn)結(jié)果表明，具有明顯的抑制腫瘤作用，克服了只有重樓皂苷為重樓抑制腫瘤生長(zhǎng)的技術(shù)偏見(jiàn)，為重樓的綜合利用提供了依據(jù)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1重樓生物堿提取物的制備方法，包括以下步驟：步驟1：取重樓藥材1000g，加入加入4mol/l鹽酸溶液5000ml溶液，室溫浸泡48小時(shí)后，于60℃加熱提取5次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液備用；步驟2：調(diào)節(jié)所述濾液的ph值為10－14，于4℃冷藏，靜置24小時(shí)，離心，收集沉淀，用水沖洗至洗出液呈中性；步驟3：將洗滌至中性的沉淀加乙醇溶解后，加入大孔吸附樹脂40g吸附48小時(shí)，過(guò)濾，收集大孔吸附樹脂裝柱，然后依次用1000ml水、1000ml30％乙醇水溶液、1000ml50％乙醇水溶液、1000ml70％乙醇水溶液洗脫，洗脫速度按每克大孔樹脂計(jì)為0.2ml/min收集70％乙醇洗脫液；步驟4：將所述70％乙醇洗脫液濃縮冷凍干燥，得提取物24.5g。實(shí)施例2重樓生物堿提取物的制備方法，包括以下步驟：步驟1：取重樓藥材1000g，加入加入3mol/l硫酸溶液5000ml溶液，室溫浸泡72小時(shí)后，于50℃加熱提取3次，每次4小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液備用；步驟2：調(diào)節(jié)所述濾液的ph值為14，于4℃冷藏，靜置48小時(shí)，離心，收集沉淀，用水沖洗至洗出液呈中性；步驟3：將洗滌至中性的沉淀加乙醇溶解后，加入大孔吸附樹脂20g吸附24小時(shí)，過(guò)濾，收集大孔吸附樹脂裝柱，然后依次用2000ml水、2000ml30％乙醇水溶液、2000ml50％乙醇水溶液、2000ml70％乙醇水溶液洗脫，洗脫速度按每克大孔樹脂計(jì)為0.4ml/min收集70％乙醇洗脫液；步驟4：將所述70％乙醇洗脫液濃縮冷凍干燥，得提取物22.7g。實(shí)施例3重樓生物堿提取物的抗腫瘤作用。受試樣品：取實(shí)施例1所得提取物作為樣品。對(duì)照樣品：阿霉素。劑量選擇與受試物給予方式：根據(jù)該樣品的人體推薦用量，人口服推薦劑量為每人(成人)每日3次，每次50mg，成人體重按60kg計(jì)算，折合劑量為0.83mg/kgbw，設(shè)2.1mg/kgbw(低劑量組)、4.2mg/kgbw(中劑量組)、8.3mg/kgbw(高劑量組)(分別相當(dāng)于人體推薦用量的2.5、5、10倍)劑量的試驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)一個(gè)模型組對(duì)照組和一個(gè)空白對(duì)照組。動(dòng)物：spf級(jí)bablc小鼠，雌性，體重18.0-20.0g。方法：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的emt-6細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化脫壁后，終止消化，加入rpmi-1640培養(yǎng)液，制成懸液，將懸液接種至小鼠左前肢腋窩皮下0.2ml/只，待腫瘤長(zhǎng)到1cm3時(shí)剝離，剪碎，按比例加入生理鹽水(1g:3ml)，再在玻璃勻漿器內(nèi)研磨，經(jīng)80-100目篩網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。將制備好的細(xì)胞懸液按0.2ml/只接種于50只bablc小鼠左前腋窩下。小鼠隨機(jī)分組，每組10只。試驗(yàn)藥物分高、中、低組，對(duì)照藥物組，空白模型組。于接種后的第二天開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥1周，于接種后第5天開(kāi)始測(cè)量腫瘤體積，待模型組平均瘤重大于1.0g(瘤體積約為0.5cm3)時(shí)停止試驗(yàn)，處死小鼠并稱重，剝?nèi)∧[瘤，計(jì)算抑瘤率。對(duì)emt-6乳腺癌小鼠移植瘤體積的影響表組別5d6d7d8d9d樣品低劑量0.021±0.0230.067±0.036**0.184±0.055**0.372±0.046**0.425±0.036**樣品中劑量0.030±0.0190.074±0.041**0.215±0.074**0.399±0.051**0.439±0.048**樣品高劑量0.025±0.0310.073±0.048**0.191±0.061**0.376±0.057**0.411±0.041**模型對(duì)照組0.048±0.1430.214±0.1520.361±0.0920.549±0.0650.729±0.035陽(yáng)性對(duì)照組0.009±0.029**0.026±0.021**0.108±0.077**0.247±0.099**0.366±0.058**注：**與模型組比較，p＜0.01。由上表可知，本發(fā)明具有抗腫瘤作用。上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式之一，不應(yīng)當(dāng)用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計(jì)思想和精神上作出的毫無(wú)實(shí)質(zhì)意義的改動(dòng)或潤(rùn)色，其所解決的技術(shù)問(wèn)題仍然與本發(fā)明一致的，均應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12