本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及到一種響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶溶桿菌oh11生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)hsaf的方法。
背景技術(shù)：
：：目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對農(nóng)作物病蟲害的防治方法主要依賴于化學(xué)防治，而大量化學(xué)農(nóng)藥的使用不僅會對土壤、水體及大氣帶來不良影響，同時還會不可避免地引發(fā)嚴(yán)重的“3r”(殘留risidue、有害生物再猖獗resurgence、病原物的抗藥性resistance)和“三致”(致畸、致癌、致突變)危機(jī)。生物農(nóng)藥是指利用生物活體、生物代謝產(chǎn)物或生物特定基因而制成的農(nóng)藥，目前研發(fā)和應(yīng)用較多的有農(nóng)用抗生素(井岡霉素、阿維菌素等)、微生物農(nóng)藥(蘇云金桿菌、假單胞菌等)、植物源農(nóng)藥(苦參堿、除蟲菊素等)等，其具有低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，因而在近年來受到格外的關(guān)注。熱穩(wěn)定抗真菌因子(heatstableaniifungalfactor，hsaf)是一類含有四胺酸殘基的大環(huán)內(nèi)酞胺類化合物(如下式)，由graupner等于1997年首次從鏈霉菌streptomyces.sp發(fā)酵液中分離而得的，hsaf具有獨特的抗真菌機(jī)制，能抑制多種植物病原菌和原生動物，而且生物學(xué)實驗表明，hsaf的作用靶標(biāo)是鞘脂類的生物合成途徑，只對絲狀真菌有抑制，對哺乳動物和植物不起作用，這說明使用hsaf安全性高，對人體基本無毒性，可作為良好的生物源農(nóng)藥用于生物防治。盡管對hsaf生物合成的遺傳調(diào)控機(jī)制有了充分的了解，但其產(chǎn)量仍然較低(僅為30-60mg/l)，與工業(yè)化生產(chǎn)水平差距較大，阻止了其進(jìn)一步商業(yè)化推廣和應(yīng)用。為了提高h(yuǎn)saf產(chǎn)量，盡快實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，有必要進(jìn)一步對其發(fā)酵工藝進(jìn)行深入研究，通過改善發(fā)酵環(huán)境，充分發(fā)揮菌株的潛在生產(chǎn)能力，從而滿足工業(yè)化生產(chǎn)和市場的需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶溶桿菌oh11生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)hsaf的方法，對hsaf的工業(yè)化生產(chǎn)和市場需求具有重要意義。本發(fā)明的目的通過以下措施達(dá)到：一種響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶溶桿菌oh11生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)hsaf的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將菌株產(chǎn)酶溶桿菌(l.enzymogenes)oh11接入lb液體培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)后劃線于lb固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后即得活化的菌株；(2)種子液的培養(yǎng)：將步驟(1)活化的菌株接入到lb液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至od600＝1.0-2.0，即為發(fā)酵所用的種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中培養(yǎng)好的種子液按照(0.8-1.2)％的體積比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：裝液量20-24％，發(fā)酵溫度25-27℃，發(fā)酵時間56-60h，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為：黃豆粉7.80-8.10g/l，葡萄糖7.69-7.99g/l，cacl20.70-0.74g/l；(4)發(fā)酵液中hsaf提取與檢測：發(fā)酵液酸化后，加入惰性物質(zhì)和乙酸乙酯，渦旋混合振蕩萃取，離心、吸取上清液提取hsaf，并通過hplc檢測發(fā)酵液中hsaf具體產(chǎn)量。優(yōu)選的，步驟(3)中對hsaf發(fā)酵有顯著性影響因素為裝液量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵周期，其最佳條件分別為裝液量22％、26℃、58h，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為：黃豆粉8.00g/l，葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l。優(yōu)選的，步驟(3)發(fā)酵培養(yǎng)的搖床振蕩轉(zhuǎn)速為180-250rpm，更優(yōu)選200-220rpm。步驟(1)中所述的lb液體及固體平板培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10.0g/l，nacl10.0g/l，酵母粉5.0g/l；lb固體平板培養(yǎng)基另在每升lb液體培養(yǎng)液中加入2g瓊脂粉。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的過夜培養(yǎng)條件為：溫度28-35℃，更優(yōu)選28-30℃；搖床轉(zhuǎn)速180-220rpm，更優(yōu)選180-200rpm。優(yōu)選的，步驟(1)中l(wèi)b固體平板培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：28-35℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2-3天，更優(yōu)選28-30℃下培養(yǎng)2d。優(yōu)選的，步驟(2)中的振蕩培養(yǎng)條件為：溫度28-35℃，轉(zhuǎn)速150-220rpm，時間10-25h，更優(yōu)選為28-30℃，轉(zhuǎn)速180-200rpm，時間12-18h。優(yōu)選的，步驟(4)中發(fā)酵液中hsaf提取與檢測的方法為：發(fā)酵液酸化后，加入惰性物質(zhì)和乙酸乙酯，渦旋混合振蕩萃取，離心、吸取上清液提取hsaf，并通過hplc檢測，利用hsaf濃度與吸收峰面積間的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成發(fā)酵液中hsaf具體產(chǎn)量；所述惰性物質(zhì)選自溶于水而不溶于乙酸乙酯的無機(jī)鹽。優(yōu)選的，所述發(fā)酵液可以選用實驗室中常用于調(diào)節(jié)ph的酸來進(jìn)行酸化，如濃鹽酸、濃硫酸等；本發(fā)明中發(fā)酵液酸化至ph2.0-5.0，優(yōu)選酸化ph至3.0-4.5。優(yōu)選的，所述的惰性物質(zhì)為溶于水而不溶于乙酸乙酯的無機(jī)鹽，優(yōu)選為nacl、cacl2、mgcl2或na2so4中的任意一種或者幾種的組合；更優(yōu)選的為cacl2或nacl或二者的組合；本發(fā)明通過惰性物質(zhì)的加入，能顯著降低乙酸乙酯在發(fā)酵液中的溶解度，使乙酸乙酯從發(fā)酵液中游離出來，并伴隨著hsaf從發(fā)酵液中轉(zhuǎn)移到乙酸乙酯中，實現(xiàn)hsaf的分離；在整個過程中，因不存在穩(wěn)定、大量的傳質(zhì)界面，故破壞了乳化形成的基本條件，有效地克服了乳化問題。優(yōu)選的，所述的惰性物質(zhì)的單位為g，發(fā)酵液體積的單位為ml，惰性物質(zhì)添加量與發(fā)酵液體積的比為(0.1-0.3)g：1ml；優(yōu)選(0.15-0.25)g：1ml；更優(yōu)選的(0.15-0.20)g：1ml。惰性物質(zhì)添加量低于此范圍時，破乳效果不佳。本發(fā)明選用乙酸乙酯做萃取劑，萃取效率高，且易分層；優(yōu)選乙酸乙酯與發(fā)酵液體積比為0.5-1.5:1，更優(yōu)選0.8-1.2:1。乙酸乙酯與發(fā)酵液體積比在此范圍內(nèi)，可以提高萃取效率。本發(fā)明選用渦旋混合振蕩處理，有機(jī)溶劑和發(fā)酵液接觸更充分，萃取時間大大縮短，可以將萃取時間縮短至2min以內(nèi)，優(yōu)選的振蕩條件為1000-2500rpm，0.5-2min；更優(yōu)選1500-2000rpm，1-1.5min。優(yōu)選的，所述的離心是在常溫、5000-8000rpm條件下、離心5-10min。作為本發(fā)明一種更為具體的方案：一種響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶溶桿菌oh11生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)hsaf的方法：(1)分別進(jìn)行單因素考察，研究不同氮源、碳源和無機(jī)鹽對l.enzymogenesoh11發(fā)酵生產(chǎn)hsaf的影響，確立了最適的氮源為黃豆粉，碳源為葡萄糖，無機(jī)鹽為cacl2，且它們的最佳濃度分別為7g/l、5g/l、0.6g/l；接著，以發(fā)酵液中hsaf產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行試驗設(shè)計，按照box-behnkendesign(bbd)試驗方案進(jìn)行搖瓶實驗并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得本發(fā)明所述的培養(yǎng)基配方，通過優(yōu)化，hsaf實際產(chǎn)量可達(dá)356.34mg/l以上；(2)首先采用plackett-burman(pb)試驗對影響產(chǎn)酶溶桿菌oh11生產(chǎn)hsaf的發(fā)酵因素進(jìn)行效應(yīng)評價，篩選出影響hsaf產(chǎn)量的顯著性因素；然后利用最陡爬坡法對以上顯著因素進(jìn)行最大響應(yīng)區(qū)域逼近，確定響應(yīng)面分析的中心點；最后通過bbd響應(yīng)面設(shè)計試驗，建立以hsaf產(chǎn)量為響應(yīng)值的多元二次回歸方程模型，從中分析得到最適的發(fā)酵條件；通過進(jìn)一步優(yōu)化后的hsaf產(chǎn)量達(dá)到440.26mg/l，比(1)優(yōu)化后(356.34mg/l)又進(jìn)一步提高了23.56％；其中，所述的pb試驗中發(fā)酵因素包括接種量(x1)、裝液量(x2)、初始ph值(x3)、培養(yǎng)溫度(x4)、搖床轉(zhuǎn)速(x5)、發(fā)酵周期(x6)6個因素；對hsaf產(chǎn)量有顯著性效應(yīng)的因素為x2、x4和x6；其中，所建立的多元二次回歸方程模型為：y＝-19495.70+603.09x2+525.02x4+236.42x6-12.13x2x4+0.70x2x6-3.74x4x6-7.38x22-1.43x42-1.33x62，式中x2為裝液量、x4為培養(yǎng)溫度、x6為發(fā)酵周期。其中，所述的pb試驗、最陡爬坡試驗和bbd試驗均在500ml搖瓶上進(jìn)行，培養(yǎng)基成分為(1)優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配方；優(yōu)化后的方法包括以下步驟：(1)菌株活化：將菌株l.enzymogenesoh11接入lb液體培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)后劃線于lb固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后即得活化的菌株；(2)種子液的培養(yǎng)：將步驟(1)活化的菌株接入到lb液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至od600＝1.0-2.0，即發(fā)酵所用的種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中培養(yǎng)好的種子液按照(0.8-1.2)％的體積比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)條件為：裝液量20-24％，發(fā)酵溫度25-27℃，發(fā)酵時間56-60h，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為：黃豆粉7.80-8.10g/l，葡萄糖7.69-7.99g/l，cacl20.70-0.74g/l。(4)發(fā)酵液中hsaf提取與檢測。本發(fā)明具有如下突出的效果：(1)本發(fā)明中得到的培養(yǎng)基原料來源廣、成本低、比較適合工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明中明確了對hsaf產(chǎn)量有顯著性效應(yīng)的因素為裝液量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵周期，對后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。(3)本發(fā)明中純化的hsaf純度＞95％，對缺乏hsaf標(biāo)準(zhǔn)品的市場是一個極大的補(bǔ)足。(4)利用本發(fā)明方案最終能使hsaf產(chǎn)量提高到440.26mg/l，是對照10％tsb(29.24mg/l)的15倍，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。附圖說明圖1hplc檢測圖，(a)發(fā)酵液中hsaf；(b)純化的hsaf；圖2為hsaf濃度與吸收峰面積間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3(a)不同氮源對hsaf發(fā)酵的影響(b)黃豆粉濃度對hsaf發(fā)酵的影響；圖4(a)不同碳源對hsaf發(fā)酵的影響(b)葡萄糖濃度對hsaf發(fā)酵的影響；圖5(a)不同無機(jī)鹽對hsaf發(fā)酵的影響(b)cacl2濃度對hsaf發(fā)酵的影響；圖6黃豆粉、葡萄糖及cacl2間的交互作用對hsaf產(chǎn)量的影響；圖7不同有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液中hsaf過程的現(xiàn)象；圖8添加惰性物質(zhì)時hsaf萃取過程的現(xiàn)象。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實施例1：hsaf發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素考察取出-80℃超低溫冰箱中的l.enzymogenesoh11菌株甘油管，冰上融化后倒入含5mllb培養(yǎng)液的菌種瓶中，28℃下200rpm過夜培養(yǎng)后用接種環(huán)蘸取菌液在固體平板上劃線，于30℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)2d。劃取平板上的單菌落菌株于50mllb培養(yǎng)液中，28℃下200rpm振蕩培養(yǎng)12h至od600＝1.5，即得到種子液。按照1.0％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150rpm下培養(yǎng)48h，每組實驗設(shè)三個平行。單因素試驗是在5g/l酵母粉、2.5g/l葡萄糖和0.5g/lnacl作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行的，只需要替換相應(yīng)考察對象即可，其他不變。(1)氮源的篩選：選取(nh4)2so4、nh4cl、nano3、尿素、酵母粉、玉米粉、牛肉膏、黃豆粉8種原料作為培養(yǎng)基中的唯一氮源，考察不同氮源對hsaf合成的影響。由圖3(a)所示，以黃豆粉作為唯一氮源時，發(fā)酵液中hsaf的含量最高，達(dá)到258.34mg/l，其次是牛肉膏，而使用無機(jī)氮源如(nh4)2so4、nh4cl、nano3、尿素僅有少量hsaf產(chǎn)生。由此可見，黃豆粉是最適合l.enzymogenesoh11合成hsaf的氮源，進(jìn)一步，對其添加比例進(jìn)行了考察，如圖3(b)所示，隨著黃豆粉比例的增加，hsaf的濃度逐漸增大，在7g/l時達(dá)到最高。(2)碳源的篩選：選取6種不同碳源(可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘油)考察其對hsaf合成的影響。由圖4(a)所示，添加麥芽糖和葡萄糖時，hsaf的產(chǎn)量基本一致，均高于其他兩種碳源。又由于葡萄糖作為一種工業(yè)發(fā)酵中最常用的碳源，不僅來源廣泛，而且價格低廉，因此這里選用葡萄糖作為最佳碳源。接著，對葡萄糖的添加比例進(jìn)行了研究，如圖4(b)所示，hsaf產(chǎn)量在添加5g/l葡萄糖時達(dá)到最大，為268.56mg/l，隨后出現(xiàn)緩慢地下降。(3)無機(jī)鹽的篩選：分別添加nacl、mgcl2、cacl2、mnso4、znso4、feso4、kh2po4考察不同無機(jī)鹽對hsaf合成的影響，添加量均為0.2g/l，每組設(shè)3個重復(fù)。由圖5(a)可知，除了k2hpo4對hsaf的合成產(chǎn)生不利的影響，其余無機(jī)鹽都能一定程度地促進(jìn)hsaf的發(fā)酵過程，特別是添加cacl2能夠極大地刺激hsaf的合成，hsaf的產(chǎn)量為所取無機(jī)鹽中最大，故選用無水cacl2作為最佳無機(jī)鹽。通過對cacl2添加比例進(jìn)行了考察，如圖5(b)，發(fā)現(xiàn)不同濃度cacl2對hsaf合成的影響不是很顯著，在0.6g/l比例是比其他條件稍微有所提高。實施例2：hsaf發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化根據(jù)單因素試驗選取各自最高值作為bbd試驗設(shè)計的中心點(即0水平)，建立因素水平表。并以l.enzymogenesoh11代謝產(chǎn)物hsaf的濃度為響應(yīng)值，利用designexpert軟件根據(jù)bbd設(shè)計原則進(jìn)行優(yōu)化，如表1所示。表1hsaf發(fā)酵培養(yǎng)基成分bbd試驗設(shè)計及其結(jié)果根據(jù)表1的響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到發(fā)酵液中hsaf產(chǎn)量對黃豆粉(x1)、葡萄糖(x2)、cacl2(x3)濃度的二次多項回歸擬合方程：y＝-334.00+67.50x1+6.25x2-36.25x3-10.00x1x2-5.00x1x3+22.50x2x3-69.75x12-97.25x22-52.25x32，r2＝0.9863。通過統(tǒng)計軟件designexpert對試驗結(jié)果的分析，得出各發(fā)酵配方的最佳方案為：黃豆粉8.00g/l，葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l，此時hsaf理論值最大值為350.65mg/l。按照以上最佳配方，重復(fù)3次實驗，結(jié)果顯示該配方能使hsaf產(chǎn)量提高到356.34mg/l，與理論值十分接近，證明本發(fā)明方案具有可行性。并且通過響應(yīng)面及其等高線圖對不同因素間的交互關(guān)系進(jìn)行分析。由圖6(a為黃豆粉與葡萄糖交互作用的響應(yīng)面圖；b為黃豆粉與cacl2交互作用的響應(yīng)面圖；c為葡萄糖與cacl2交互作用的響應(yīng)面圖；)可知，黃豆粉與葡萄糖、葡萄糖與cacl2間的交互作用及其顯著，對hsaf產(chǎn)量有較大影響，因此在發(fā)酵過程中需嚴(yán)格控制兩者的濃度及其比例；而黃豆粉與cacl2間的交互影響不明顯。實施例3pb試驗篩選影響hsaf搖瓶發(fā)酵的顯著性影響因子根據(jù)l.enzymogenesoh11發(fā)酵特性及本實驗室研究基礎(chǔ)選取6個培養(yǎng)因素(接種量、裝液量、初始ph、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵周期)作為pb試驗考察的因素，每個因素分別取高(+1)低(-1)兩個水平，以發(fā)酵液中hsaf濃度為響應(yīng)值設(shè)計12組試驗，如表2所示。利用designexpert軟件對pb試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，獲得各發(fā)酵因素對hsaf濃度影響的顯著性順序為：發(fā)酵周期(x6)＞培養(yǎng)溫度(x4)＞裝液量(x2)＞初始ph(x3)＞接種量(x1)＞搖床轉(zhuǎn)速(x5)；其中發(fā)酵周期(p＝0.0034)、培養(yǎng)溫度(p＝0.0098)和裝液量(p＝0.0444)顯著影響hsaf的濃度(p＜0.05)，因此這3個因素作為進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化的因素。表2hsaf發(fā)酵條件的pb試驗設(shè)計及結(jié)果實施例4bbd試驗設(shè)計hsaf搖瓶發(fā)酵條件與結(jié)果分析采用bbd試驗設(shè)計三因素三水平共17個實驗點的響應(yīng)面分析試驗，具體過程同實施例2。通過designexpert8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合并對方程做顯著性檢驗及方差分析，獲得hsaf濃度對裝液量(x2)、培養(yǎng)溫度(x4)和發(fā)酵周期(x6)的多元二次回歸方程為：y＝-19495.70+603.09x2+525.02x4+236.42x6-12.13x2x4+0.70x2x6-3.74x4x6-7.38x22-1.43x42-1.33x62，r2＝0.9939。且最適合的發(fā)酵條件為裝液量為22％、培養(yǎng)溫度為26℃、發(fā)酵周期為58h，此時模型能夠取得最大值，為436.50mg/l。為了檢驗該模型的有效性，按照上述最優(yōu)發(fā)酵條件在搖瓶中進(jìn)行重復(fù)實驗，同時以初始發(fā)酵條件作為對照，最終獲得hsaf實際產(chǎn)量為440.26mg/l，與理論預(yù)測值相接近，表明該模型十分可靠，能夠很好地預(yù)測實際發(fā)酵情況，對于今后的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。而且采用本發(fā)明發(fā)酵方法，hsaf產(chǎn)量是常規(guī)條件下(10％tsb，29.24mg/l)的15倍。實施例5優(yōu)化后的生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)hsaf的方法響應(yīng)面法優(yōu)化后產(chǎn)酶溶桿菌oh11生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)hsaf的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將菌株產(chǎn)酶溶桿菌oh11接入lb液體培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)后劃線于lb固體平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后即得活化的菌株；(2)種子液的培養(yǎng)：將步驟(1)活化的菌株接入到lb液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至od600＝1.0-2.0，即發(fā)酵所用的種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中培養(yǎng)好的種子液按照(0.8-1.2)％的體積比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：裝液量22％，發(fā)酵溫度26℃，發(fā)酵時間58h，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為：黃豆粉8.00g/l，葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l；(4)發(fā)酵液中hsaf提取與檢測，可以包括三個步驟：①高純度hsaf產(chǎn)品的制備：取1l發(fā)酵液加入濃hcl調(diào)節(jié)ph至2.5，投放166.7gcacl2并按照與發(fā)酵液等比例加入1l乙酸乙酯，按照每瓶200ml/1l分裝后于漩渦振蕩儀上1500r/min萃取2min，4℃、8000rpm離心3min，吸取上清液后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃蒸干得到hsaf粗品。加入100ml甲醇充分溶解后通過hplc收集22.5min特征吸收峰，冷凍干燥后即得hsaf純品，純度為96.5％，如圖1(b)所示。制備條件為：反相柱：intersustainswiftc185μm,250×20mm，進(jìn)樣量：2ml，紫外吸收值：318nm，流動相：溶液a(0.025％tfa水溶液)和溶液b(0.025％tfa乙腈溶液)，流速：15ml/min；進(jìn)樣程序：0-10min，將溶液b從5％至25％；25min，增長到80％b；26min，增長到100％；30min返回到5％，溶液a和b總比例為100％。餾分收集程序：20.0min，unlock；20.6min，lock，收集水平：50000μv；②hsaf濃度與吸收峰面積間標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)備稱取3.3mghsaf純品加入3.3ml甲醇溶液中，配置成1000mg/l母液，并依次稀釋750mg/l、600mg/l、500mg/l、400mg/l、250mg/l、100mg/l、50mg/l不同梯度濃度，最后通過hplc分析柱檢測，進(jìn)樣量為20μl，檢測條件為，紫外吸收值：318nm，反相柱：intersustainswiftc185μm,250×4.6mm，流動相：溶液a(0.025％tfa水溶液)和溶液b(0.025％tfa乙腈溶液)，流速：1ml/min；進(jìn)樣程序：0-10min，將溶液b從5％至25％；25min，增長到80％b；26min，增長到100％；30min返回到5％，溶液a和b總比例為100％。記錄峰面積，以配置溶液中hsaf的濃度為縱坐標(biāo)(y)，吸收峰面積為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，可得hsaf濃度與峰面積間的線性方程為y＝4e-05x+12.46，r2＝0.9996；③發(fā)酵液中hsaf含量的檢測：取3ml發(fā)酵液加入濃hcl調(diào)節(jié)ph至2.5，投放0.5gcacl2并按照與發(fā)酵液等比例加入3ml乙酸乙酯，2000r/min下混合震蕩2min充分混勻發(fā)酵液與有機(jī)相，4℃、8000rpm離心3min，吸凈乙酸乙酯相，重復(fù)萃取三次后，各取1ml上清液與通風(fēng)櫥中吹干，最后加入500μl甲醇溶解后用于hplc分析。通過方法(2)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出萃取液中hsaf濃度，再換算成發(fā)酵液中hsaf的具體產(chǎn)量，檢測條件同方法②。本實施例中，步驟①或③中采用乙酸乙酯雖然產(chǎn)生了乳化層，但乙酸乙酯中hsaf濃度能到達(dá)到322.8mg/l，明顯優(yōu)于同樣條件下選用醇類溶劑、乙酸丁酯或二氯甲烷作為萃取劑，如圖7和表3所示。表3有機(jī)溶劑對hsaf萃取效率的影響本實施例中步驟①或③中加入cacl2可有效破除萃取過程中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象，并且能夠進(jìn)一步提高萃取液中hsaf的含量，以步驟③中取3ml發(fā)酵液進(jìn)行萃取為例，第一次萃取液中濃度就可達(dá)到336.8mg/l，同時，以充分萃取后得到的hsaf含量為發(fā)酵液中hsaf總量(通過三次萃取至發(fā)酵液中不再產(chǎn)生hsaf為止，每次萃取液中hsaf含量為336.8mg/l，36.3mg/l，5.7mg/l，對應(yīng)的體積分別為2.8ml，3ml，3ml。與此，計算出發(fā)酵液中hsaf總含量為356.3mg/l)，通過計算發(fā)現(xiàn)添加cacl2能夠使第一次萃取效率達(dá)到88.2％，比對照提高了1.83倍。而相同條件下加入商業(yè)化破乳劑(ppb)，對本研究中乳化問題效果不明顯，如圖8和表4所示。表4添加不同無機(jī)鹽對hsaf萃取效率的影響當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12