本發(fā)明屬于醫(yī)藥及食品化工技術領域，具體涉及一種基于黑曲霉細胞催化柚皮苷水解制備柚皮素的方法。

背景技術：

柚皮素(naringenin)是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗纖維化等多種藥理活性，因此常被用作食品添加劑或輔助藥物。近年來研究表明，它還具有抗心律失常、鎮(zhèn)咳、預防動脈粥樣硬化、免疫調節(jié)脂肪代謝、抗衰老、保護肝功能以及類雌激素等多種功能活性。

自然界中，柚皮素一般以柚皮苷的形式存在于自然界薔薇科、蕓香科、柑橘屬植物中，其來源廣泛，但是含量均極其低，而且提取十分困難。為提高柚皮素提取率，陳雪峰等采用超臨界co2萃取技術從桃葉中提取分離出柚皮素，平均得率可達2.18%，獲得了品質優(yōu)良的柚皮素提取物產品，但是萃取物中含有大量的葉綠素，導致產品外觀顏色為綠色，產物純度極低（陳雪峰,劉迪,李欣.超臨界co2萃取桃葉中柚皮素的工藝研究[j].食品科學,2007,28(1):106-109.）。除了直接提取法之外，通過化學法催化柚皮苷去糖基化反應也是制備柚皮素的重要方式。相比較于柚皮素，柚皮苷在自然界中分布非常廣泛，在蕓香科植物柚、葡萄柚、胡柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮中都有存在。在結構上，柚皮苷是由柚皮素和糖環(huán)連接而成。目前，常用的通過柚皮苷水解方法制備柚皮素的方法,采用強酸作為催化劑進行。如，劉亞萍等報道使用2%的硫酸試劑在直火加熱條件下催化柚皮苷水解反應，柚皮素得率較低（劉亞萍.柚皮素的制備方法研究[j].光譜實驗室,2008,25(6):1292-1294.）；專利cn102453011a提出，使用低級醇或低級酮溶液萃取柚皮苷，采用酸法使得溶液中的柚皮苷在酸性條件下發(fā)生酸水解獲得柚皮素，所得柚皮素產率較低，純度為99%。但采用該方法時，柚皮苷的水解過程中普魯寧和柚皮素共存,必須對水解產物進行分離去除普魯寧，才能獲得柚皮素。不僅如此，化學法由于條件苛刻，引入溶劑多，對設備條件要求高，且容易對環(huán)境造成污染。針對化學法的不足，有研究進行了綠色的酶催化劑在柚皮素制備中的應用。專利cn105838622a提出，可利用黑曲霉hc306發(fā)酵產胞外酶，從發(fā)酵液中分離提純酶，經提純分離后，獲得了一種胞外糖苷酶，該酶可以催化柚皮苷水解獲得柚皮素。該方法具有生物催化過程反應條件溫和、綠色等優(yōu)勢，但采用純酶作為催化劑，需要經微生物培養(yǎng)、發(fā)酵、提取、純化等一系列步驟獲取，工藝復雜；成本高，難以付諸于大規(guī)模工業(yè)化使用。

目前為止還沒有利用微生物整細胞直接催化蘆丁水解反應高選擇性合成柚皮素的相關報道。

技術實現要素：

針對目前柚皮素制備方法上存在的缺點和不足，本發(fā)明提供了一種基于黑曲霉細胞催化柚皮苷水解制備柚皮素的方法；該方法采用黑曲霉細胞為催化劑，柚皮苷為反應原料，實現柚皮素的高選擇性合成。該方法具有條件溫和、產物得率高、環(huán)境友好，成本低等優(yōu)點,克服了傳統化學催化法需要在高溫高壓下，由酸或堿催化完成,對設備要求高,且對環(huán)境造成污染的缺點；同時，也克服了純酶催化技術需要經微生物培養(yǎng)、發(fā)酵、提取、純化等一系列步驟獲取，工藝復雜、成本高等缺點，直接采用微生物整細胞進行反應，簡單易得，且黑曲霉細胞及反應介質都可以重復利用，大大降低制備成本，有利于工業(yè)化生產；采用該技術可有效推動柚皮素在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中的廣泛應用。

本發(fā)明的原理是采用直接完整黑曲霉細胞作為生物催化劑，選擇性催化水解柚皮苷分子中的糖苷鍵，將柚皮苷水解為經濟價值更高、藥理活性更好的柚皮素。該方法采用生物催化劑，可一步法實現柚皮素的制備合成，方法簡單，環(huán)境友好，操作安全，極具工業(yè)應用價值。

本發(fā)明的目的通過以下技術方法得以實現。

一種基于黑曲霉細胞催化柚皮苷水解制備柚皮素的方法，包括如下步驟：

（1）在緩沖溶液中加入有機溶劑或者離子液體，混勻后加入柚皮苷，再加入黑曲霉細胞作為催化劑催化柚皮苷水解反應；

（2）反應結束后，將反應液過濾，再將濾液減壓蒸餾得到粗產物，粗產物分離提純得到柚皮素。

優(yōu)選的，步驟（1）所述緩沖溶液為醋酸緩沖溶液或者檸檬酸緩沖溶液。

優(yōu)選的，步驟（1）所述緩沖溶液的ph值為3.0~7.0。

優(yōu)選的，步驟（1）所述有機溶劑為甲醇、乙醇、丙醇、四氫呋喃、二甲基亞砜或吡啶。

優(yōu)選的，步驟（1）所述離子液體為[bmim]bf4、[emim]bf4、[bmim]cl、[emim]cl、[bmim]br或[hmim]br。

優(yōu)選的，步驟（1）所述有機溶劑或離子液體與緩沖溶液的體積比為1:1~5:1。

優(yōu)選的，步驟（1）所述柚皮苷與黑曲霉細胞的干重比為1:0.5~1:10，進一步優(yōu)選為1:1~1:10。

優(yōu)選的，步驟（1）所述水解反應的溫度為20~50℃。

優(yōu)選的，步驟（1）所述水解反應的時間為0~48小時，進一步優(yōu)選為6~48小時。

優(yōu)選的，步驟（2）所述粗產物用溶劑萃取法進行分離純化，采用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下減壓蒸干乙酸乙酯后,再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥,即得柚皮素。

相對于現有技術，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果：

（1）與現有提取法制備柚皮素的技術相比，本發(fā)明制備柚皮素的原料經濟易得，成本低，柚皮素產率高。

（2）與現有化學法催化柚皮苷水解制備柚皮素的技術相比，本方法采用黑曲霉細胞作為生物催化劑，避免了酸堿、重金屬等有毒、高污染的化學催化劑的使用，且反應條件溫和、對制備設備和環(huán)境的要求低、環(huán)境友好。

（3）與現有的酶催化制備技術相比，本方法采用直接采用微生物細胞作為催化劑，省略了純酶催化劑需要微生物細胞發(fā)酵、分離提取及固定化等多步制備過程，大大降低了制備成本，有利于工業(yè)化應用。

（4）本發(fā)明的方法簡單易操作，產物單一，產物純度高，細胞催化劑及反應介質可回收重復使用，成功實現了從低成本、存量大的底物簡單地經過一步法水解反應，生成高經濟價值、自然界存量小的柚皮素，制備方法有利于工業(yè)化應用。

具體實施方式

為更好理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明做進一步地詳細說明，需說明的是，本發(fā)明的實施方式不限于此，這些實施例不構成對本發(fā)明保護范圍的限制。

實施例1

在10ml帶塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，總體積為2ml的甲醇與0.2mol/lph為3.0的檸檬酸緩沖溶液的混合物（甲醇與緩沖液體積比為1:1），混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25(廣東省微生物研究所)作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:0.5）啟動反應，20℃、振蕩速率60r/min的條件下，反應48h。反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液在40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。反應柚皮苷轉化率為34%，產物柚皮素純度為98%。

實施例2

在10ml帶塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，總體積為2ml的二甲基亞砜與0.2mol/lph為5.0的醋酸緩沖溶液的混合物（二甲基亞砜與緩沖液體積比為5:1），混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:5）啟動反應，35℃、振蕩速率220r/min的條件下，反應24h。反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。反應柚皮苷轉化率為68%，產物柚皮素純度為98%。

實施例3

在10ml帶塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，總體積為2ml的離子液體[bmim]bf4與0.2mol/lph為5.0的檸檬酸緩沖溶液的混合物（[bmim]bf4與緩沖液體積比為1:1），混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:10）啟動反應，40℃、振蕩速率140r/min的條件下，反應48h。反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。反應柚皮苷轉化率為98%，產物柚皮素純度為98%。

實施例4

在10ml帶塞三角瓶中加入10mg柚皮苷，再加入總體積為2ml的離子液體[emim]bf4與0.2mol/lph為7.0的檸檬酸緩沖溶液的混合物（[emim]bf4與緩沖液體積比為5:1），混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:5）啟動反應，50℃、振蕩速率140r/min的條件下，反應6h。反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。反應柚皮苷轉化率為36%，產物柚皮素純度為97%。

實施例5

在2個5ml帶塞三角瓶中分別加入10mg柚皮苷，編號①、②，①中加入總體積為1ml的[bmim]bf4與緩沖溶液([bmim]bf4與緩沖液體積比為1:1)進行溶解，②中加入總體積為1ml的[emim]bf4與緩沖溶液([emim]bf4與緩沖液體積比為1:1)進行溶解，緩沖溶液為0.2mol/lph值為5.0的檸檬酸緩沖溶液，混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:10）啟動反應，20℃、振蕩速率140r/min的條件下，反應48h，反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為98%，產物柚皮素純度為95%；[emim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為99%，產物柚皮素純度為98%；。

實施例6

在2個5ml帶塞三角瓶中分別加入10mg柚皮苷，編號①、②，①中加入總體積為1ml的[bmim]bf4與緩沖溶液([bmim]bf4與緩沖液體積比為3:1)進行溶解，②中加入總體積為1ml的[emim]bf4與緩沖溶液([emim]bf4與緩沖液體積比為2:1)進行溶解，緩沖溶液為0.2mol/lph值為7.0的檸檬酸緩沖溶液，混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:5）啟動反應，20℃、振蕩速率60r/min的條件下，反應48h，反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為96%，產物柚皮素純度94%；[emim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為97%，產物柚皮素純度為97%。

實施例7

在2個5ml帶塞三角瓶中分別加入10mg柚皮苷，編號①、②，①中加入總體積為1ml的[bmim]bf4與緩沖溶液([bmim]bf4與緩沖液體積比為3:1)進行溶解，②中加入總體積為1ml的[emim]bf4與緩沖溶液([emim]bf4與緩沖液體積比為1:1)進行溶解，緩沖溶液為0.2mol/lph值為3.0的醋酸緩沖溶液，混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:5）啟動反應，20℃下、振蕩速率140r/min的條件下，反應48h，反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為87%，產物柚皮素純度96%；[emim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為89%，產物柚皮素純度為98%；。

實施例8

在2個5ml帶塞三角瓶中分別加入10mg柚皮苷，編號①、②，①中加入總體積為1ml的[bmim]bf4與緩沖溶液([bmim]bf4與緩沖液體積比為5:1)進行溶解，②中加入總體積為1ml的[emim]bf4與緩沖溶液([emim]bf4與緩沖液體積比5:1)進行溶解，緩沖溶液為0.2mol/lph值為7.0的檸檬酸緩沖溶液，混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:10）啟動反應，35℃、振蕩速率220r/min的條件下，反應48h，反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為85%，產物柚皮素純度97%；[emim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為89%，產物柚皮素純度為98%；。

實施例9

在2個5ml帶塞三角瓶中分別加入10mg柚皮苷，編號①、②，①中加入總體積為1ml的[bmim]bf4與緩沖溶液([bmim]bf4與緩沖液體積比為1:1)進行溶解，②中加入總體積為1ml的[emim]bf4與緩沖溶液([emim]bf4與緩沖液體積比為1:1)進行溶解，緩沖溶液為0.2mol/lph值為7.0的醋酸緩沖溶液，混合均勻后加入黑曲霉細胞gim3.25作為催化劑（底物柚皮苷與黑曲霉細胞干重比為1:10）啟動反應，20℃、振蕩速率220r/min的條件下，反應48h，反應結束后，反應液過濾去除菌體，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液，40℃下再次減壓蒸干乙酸乙酯后，再加入甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在40℃下減壓干燥，即得柚皮素。[bmim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為94%，產物柚皮素純度98%；[emim]bf4反應液中柚皮苷轉化率為99%，產物柚皮素純度為97%。