本發(fā)明涉及一種含有高山火絨草(edelweiss,leontopodiumalpinum)植物細(xì)胞培養(yǎng)物提取物的抗炎和抗衰老皮膚外用劑組合物及其制造方法，更詳細(xì)地講，涉及一種含有誘導(dǎo)自高山火絨草植物體的植物細(xì)胞培養(yǎng)物、不定根培養(yǎng)物或其提取物的、具有抗衰老、美白、治愈創(chuàng)傷、抗炎、抑制皮脂、抑制粉刺、保護(hù)皮膚免受紫外線損傷、保護(hù)皮膚屏障等效果的皮膚外用劑組合物及其制造方法。
背景技術(shù)：
：隨著歲月的流逝，用以調(diào)節(jié)人體新陳代謝的各種激素的分泌逐漸減少、且免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞活性也逐漸下降，從而使人體所必需的免疫蛋白和組成人體的蛋白質(zhì)生物合成逐漸減少而引起的內(nèi)因性老化(intrinsicaging)，以及作為外因由各種污染物質(zhì)和紫外線照射引起的光老化(photoaging)，通過上述內(nèi)因性老化和光老化，皮膚變得越來越薄(發(fā)生內(nèi)因性老化的情況下)，皮膚彈性下降，隨著在紫外線照射下的暴露，表皮內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞受到紫外線的損傷。其中，皮膚老化可分成自然老化(chronologicaging)和光老化(actinicageing)，上述自然老化發(fā)生在沒有被暴露于太陽光下的部位，上述光老化是由發(fā)生在太陽光暴露部的退行性變化和自然老化聯(lián)合而引起的。自然老化的臨床特征在于可在皮膚上觀察到微細(xì)皺紋、真皮萎縮、皮下脂肪層減少等。光老化過程中，出現(xiàn)又粗又深的皺紋(coatsewrinklingandfurrowing)，皮膚因非正常彈性物質(zhì)(elastoticmaterial)的累積而變得像皮革一樣厚且松弛。在受到慢性日光損傷的皮膚上有可能出現(xiàn)下述現(xiàn)象：位于真皮上方側(cè)的膠原質(zhì)中發(fā)生非正常彈性物質(zhì)的沉著(solarelastosis)和會增加蛋白聚糖(proteoglycan)，從而使作為真皮層主要組成蛋白質(zhì)的膠原蛋白的含量顯著減少。膠原蛋白賦予皮膚韌度和張力，從而起到保護(hù)皮膚免受外部刺激或外力的損傷，膠原蛋白在真皮層中占 90％，因此膠原蛋白含量的減少與皮膚老化具有密切的關(guān)系。在構(gòu)成皮膚的細(xì)胞中，因發(fā)生內(nèi)因性老化或光老化而導(dǎo)致細(xì)胞活性的降低，且信號傳遞系統(tǒng)變得不完整，從而使作為用以分解皮膚組織的酶的基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps，matrixmetalloproteinases)的生物合成能力得到提高，同時(shí)膠原蛋白的生物合成能力卻在減少，從而使黑色素生成量增加，由此導(dǎo)致皺紋增加、皮膚彈性下降、以及皮膚黑化的現(xiàn)象。由此已知，通過細(xì)胞的增殖或增加構(gòu)成皮膚基質(zhì)物質(zhì)的方式，由此能夠使皮膚變厚的物質(zhì)、對用以分解皮膚構(gòu)成基質(zhì)物質(zhì)膠原蛋白的mmps的生物合成起到抑制作用的物質(zhì)、抑制黑色素生物合成的物質(zhì)對皺紋、彈性消失、皮膚黑化等皮膚癥狀起到緩解作用。目前，雖然正在積極進(jìn)行對具有治愈創(chuàng)傷、防止老化和抗炎效果的物質(zhì)的研究，但現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)因其毒性、低活性、用途的局限性、以及服用過量會引起副作用等的問題而在使用上受到局限，因此以開發(fā)出副作用較小的原料為重要環(huán)節(jié)，積極進(jìn)行從天然植物中提取有效成分的研究。然而，實(shí)際上，即使在采用天然植物的情況下，從安全性、穩(wěn)定性、變色可能性等方面來看，當(dāng)其使用量超過化妝品或藥品的有效濃度以上時(shí)存在較多問題，并沒有達(dá)到讓人滿意的效果。另一方面，高山火絨草屬于雙子葉植物菊目菊科的多年生草本。高山火絨草的花被為6～9片，呈白色，副花冠的高度為4mm左右并呈黃色。副花冠形狀因品種而不同，可呈白色、橘黃色和黃色。最近，利用植物性資源開發(fā)功能性食品、以及將植物資源用作化妝品材料的研究在盛行，然而針對高山火絨草的研究，現(xiàn)有技術(shù)中僅存在含有高山火絨草提取物的皮膚組織再生和毛發(fā)生長促進(jìn)劑(專利文獻(xiàn)1)，卻關(guān)于將從高山火絨草中培養(yǎng)的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物本身用以化妝品材料的研究尚不存在的水平。專利文獻(xiàn)1：pct國際專利申請公開公報(bào)wo2013180526技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請的發(fā)明人通過研究已確認(rèn)高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根的培養(yǎng)物或其提取物具有抗炎、抗老化、治愈創(chuàng)傷等的效果，并完成了本發(fā)明。由此，本發(fā)明的目的在于，提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根 培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來改善皮膚的皮膚外用劑組合物。在本發(fā)明中，上述的改善皮膚用途包括改善皺紋、治愈創(chuàng)傷、緩解并抑制和改善皮膚炎癥、抑制皮脂分泌、抑制或改善粉刺、使皮膚免受紫外線損傷、緩解和減輕或恢復(fù)受到的紫外線損傷、保護(hù)和改善皮膚屏障、皮膚美白、皮膚保濕等。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，將上述高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來改善皮膚的皮膚外用劑組合物的制造方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來改善皮膚的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來抑制或改善皮膚皺紋的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來治愈創(chuàng)傷的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來緩解或改善皮膚炎癥的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來收縮毛孔的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來抑制皮脂、皮膚保濕和皮膚美白的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來抑制或改善粉刺的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來防止皮膚免受紫外線損傷、緩解、減輕和恢復(fù)由紫外線引起的損傷的皮膚外用劑組合物。而且，本發(fā)明還提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來改善皮膚的皮膚外用劑組合物的制造方法，其特征在于，上述制造方法包括下述階段：(a)分離出高山火絨草植物的葉組織或莖組織，并將其培養(yǎng)成植物細(xì)胞或不定根；以及(b)制造出含有上 述高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)物、不定根培養(yǎng)物或其提取物的皮膚外用劑組合物。其中，本發(fā)明的特征在于，上述(a)階段為(i)分離出上述高山火絨草植物的葉組織或莖組織，并將其放在含6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-bap)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid，2,4-d)的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得植物細(xì)胞培養(yǎng)物的階段，或者是(ii)分離出上述高山火絨草植物的葉組織或莖組織，并將其放在含吲哚丁酸(iba)的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得不定根培養(yǎng)物的階段。在本發(fā)明的上述(b)階段，其特征在于，該階段還包括對從上述(a)階段獲得的高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)物或不定根培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、粉末化處理后，并將其放進(jìn)精制水中進(jìn)行混合以制造出組合物的工序；或者進(jìn)行粉末化處理后將其放進(jìn)精制水中進(jìn)行混合，然后經(jīng)過超音波提取或熱水提取處理制造出組合物的工序。根據(jù)本發(fā)明的含有高山火絨草植物細(xì)胞或不定根培養(yǎng)物或其提取物的皮膚外用劑組合物，其對皮膚細(xì)胞不僅沒有毒性，而且具有皮膚美白、改善皮膚皺紋、收縮毛孔、治愈皮膚創(chuàng)傷、抑制皮脂、抑制粉刺、讓皮膚免受紫外線損傷、保護(hù)皮膚屏障、皮膚保濕、緩解皮膚炎癥等效果。附圖說明圖1是表示實(shí)施例1中高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)(愈傷組織)結(jié)果的照片。圖2是表示高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)物的高效液相色譜(hplc)分析結(jié)果的圖表。圖3是表示為了確定高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物是否具有保濕效果而采用的aqp3mrna的相對強(qiáng)度圖表。圖4是表示為了確定高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物是否具有改善皺紋效果而采用的mmp-2mrna相對強(qiáng)度圖表。圖5是表示通過傷口愈合試驗(yàn)以確定高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物的治愈創(chuàng)傷效果的圖表。圖6是表示用以確定高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物是否對紫外線照射起到保護(hù)效果的結(jié)果圖表。圖7是表示應(yīng)用于本發(fā)明高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)物的高頻處理的高頻處理裝置結(jié)構(gòu)圖。符號說明100高頻細(xì)胞培養(yǎng)器200生物反應(yīng)器210殼體211注入口212高頻安裝部220上部蓋子230高頻端子231端子部232密封部件233連接線240水平支撐板241固定孔250固定棒260緩沖部件300高頻供給器310操作部320顯示部330電平指示儀400空氣供給器420排出口440空氣軟管500振動(dòng)記錄器510振動(dòng)操作部520振動(dòng)顯示部530連接線具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的皮膚外用劑組合物及其制造方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種將高山火絨草的植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用來改善皮膚的皮膚外用劑組合物。本發(fā)明中“皮膚改善用”是指改善皮膚的狀態(tài)，如可包括有炎癥時(shí)可緩解、預(yù)防和減輕炎癥、抗老化、改善和抑制皮膚皺紋、治愈創(chuàng)傷、收縮毛孔、增加皮膚彈性、抑制由紫外線引起的損傷、抑制皮脂、抑制粉刺、皮膚美白、保護(hù)或改善皮膚屏障和皮膚保濕等功能。本發(fā)明中“含有有效成分”是指，作為皮膚外用劑組合物，能夠顯示出如上所述的改善皮膚效果，即如改善皺紋、通過抗氧化功能的創(chuàng)傷治愈、抗炎等多種效果的有效含有量。本發(fā)明中的高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)物，其通過將高山火絨草植物體的一部分、如切割整個(gè)或部分莖或葉后放進(jìn)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方式來獲得。如上所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)是涉及植物組織培養(yǎng)的一種技術(shù)，對小的活體植物組織在體外(invitro)進(jìn)行無菌培養(yǎng)后，根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，對植物細(xì)胞、器官和植物體進(jìn)行增殖處理的技術(shù)。由此看出，植物組織培養(yǎng)是利用了植物本身所具有的基本特性。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是以植物所具有的獨(dú)特特性、即從植物 體細(xì)胞再生為完整植物體的植物細(xì)胞全能性(totipotency)為基礎(chǔ)的技術(shù)。即，如果將植物單細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)、葉和根的切片放進(jìn)添加有特定營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，則從它們的細(xì)胞和組織能夠再生出植物體。植物之所以具有這樣的植物細(xì)胞全能性(totipotency)是植物所具有的附著特性和為長期生存而在惡劣環(huán)境以及免遭草食動(dòng)物采食而采取的戰(zhàn)略。由此可以看出，植物是具有能夠再生出被失去器官的能力的。從母本植株中分離出的植物組織細(xì)胞在適宜培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)可再生為完整的植物體的潛力，即具有全能性的植物雖然在植物胚胎學(xué)等方面具有學(xué)術(shù)重要性，但在化妝品原料等實(shí)用化方面也具有很大的應(yīng)用價(jià)值?！爸参锛?xì)胞培養(yǎng)物”是指，將切割自植物體的組織放進(jìn)含植物生長激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)、或者使某種植物創(chuàng)傷、或者用植物生長激素處理傷口時(shí)所生成的特殊組織或細(xì)胞塊。一般來說，愈傷組織作為失去正常的器官形成或組織分化能力的無定形組織或細(xì)胞塊，大部分由薄壁組織組成。廣義上來講，也包括由土壤桿菌(agrobacterium)等的感染引起的植物腫瘤組織。由此，根據(jù)本發(fā)明，從高山火絨草的莖、葉等任何一個(gè)部位都可以實(shí)施誘導(dǎo)培養(yǎng)，但作為一具體實(shí)施例，切割高山火絨草的莖和葉的部分組織、或切割由高山火絨草種子發(fā)芽而成的幼苗的子葉后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的植物細(xì)胞；對高山火絨草的任何組織進(jìn)行部分切割后，放進(jìn)已調(diào)整好植物生長激素和細(xì)胞分裂素含量的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，則也可以形成植物細(xì)胞。培養(yǎng)不定根時(shí)，雖然其與植物細(xì)胞培養(yǎng)的過程相同，但為了誘導(dǎo)出不定根，需要不同地進(jìn)行植物激素的組合。在本發(fā)明中，上述高山火絨草植物細(xì)胞或不定根培養(yǎng)物、及其提取物的含量可以為組合物總重量的0.1～10重量％。這樣的比例也只能是優(yōu)選范圍內(nèi)的比例，例如，在下述實(shí)施例中，雖然包括0.1、0.5、1重量％或2重量％情況下的試驗(yàn)結(jié)果，但在5％、10％的情況下也具有優(yōu)異效果，這已得到確認(rèn)，同時(shí)也得到在10％的情況下細(xì)胞生存率也不受影響的事實(shí)。除此之外，在20％、30％以上的情況下，也具有優(yōu)異的改善皮膚效果、改善皺紋、治愈創(chuàng)傷和抗炎功能，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。在本發(fā)明中，上述“皮膚改善用”包括抗炎、抗老化、改善皮膚皺紋、治 愈創(chuàng)傷、增加皮膚彈性、抑制由紫外線引起的損傷、抑制皮脂、抑制粉刺、皮膚美白、保護(hù)或改善皮膚屏障等。在本發(fā)明中，可以使用上述高山火絨草的植物細(xì)胞或不定根培養(yǎng)物(培養(yǎng)體)自身、或?qū)ε囵B(yǎng)物進(jìn)行過濾后使用、或?qū)⑴囵B(yǎng)物破碎后使用，也可以對培養(yǎng)物進(jìn)行干燥粉末化處理后，溶解在精制水中使用。在本發(fā)明中，“提取物”是指，被粉末化的上述高山火絨草植物細(xì)胞或不定根培養(yǎng)物的提取物，或者是通過冷水提取法、熱水提取法、乙醇提取法、荷荷芭油提取法等以往公知的多種提取法獲得的提取物。在本發(fā)明中，對于提取方法沒有特別的限制，例如可以使用冷浸提取法、超音波提取法、回流提取法、熱水提取法、荷荷巴油提取法等。在此，當(dāng)采用熱水提取方式時(shí)，用開水蒸餾器在80～100℃溫度下加熱8～48小時(shí)，從而獲得熱水提取物。采用冷水提取時(shí)，例如可通過下述方式得到提取物：將整個(gè)上述培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的干燥粉末放進(jìn)15～25℃的冷水中進(jìn)行混合后進(jìn)行3天的提取處理，從而獲得冷水提取物?；蛘撸赏ㄟ^用水、有機(jī)溶劑或它們的混合溶劑進(jìn)行提取的方式來制造。所得到的提取液可以直接使用，或?qū)μ崛∫哼M(jìn)行濃縮和/或干燥處理后使用。采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取時(shí)，可使用甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、乙烯、丙酮、己烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲亞砜(dmso)、1,3-丁二醇、丙二醇或它們的混合有機(jī)溶劑，并在不破壞藥材有效成分或破壞程度最低的條件下，于室溫或加溫情況下進(jìn)行提取處理。根據(jù)所提取的不同的有機(jī)溶劑，藥材有效成分的提取程度和損失程度均會有一些差異，因此需使用適宜的有機(jī)溶劑。特別是在本發(fā)明，適宜使用乙醇提取物，優(yōu)選為20～50％的乙醇提取物，作為一具體實(shí)施例優(yōu)選50％乙醇提取物，其提取方法如實(shí)施例所記載，與50％乙醇混合后，進(jìn)行3天的攪拌處理而得到。在本發(fā)明中，可以對上述提取物進(jìn)行濃縮或稀釋處理后使用，也可以使用提取物的蒸餾液。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種將高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物作為有效成分含有的用以改善皮膚的皮膚外用劑組合物的制造方法，該制造方法包括下述階段：(a)分離出高山火絨草植物的葉組織 或莖組織，并將其培養(yǎng)成植物細(xì)胞或不定根；以及(b)制造出含有上述高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)物、不定根培養(yǎng)物或其提取物的皮膚外用劑組合物。上述(a)階段為通過分離自高山火絨草植物的部分組織來獲得植物組織培養(yǎng)物的過程，即獲得植物細(xì)胞培養(yǎng)物或不定根培養(yǎng)物的過程。在本發(fā)明中，也可以從上述高山火絨草植物體中分離出葉或莖組織來使用。在本發(fā)明中，為了從上述被分離的組織誘導(dǎo)出植物細(xì)胞培養(yǎng)物、不定根培養(yǎng)物，可以選擇適宜的培養(yǎng)基。具體來說，在上述(a)階段，為了培養(yǎng)高山火絨草的植物細(xì)胞或不定根，可以選擇適宜的培養(yǎng)基。只要是本領(lǐng)域中常用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基均可以使用，對此沒有限制。針對植物，通常主要使用ms培養(yǎng)基、b5培養(yǎng)基，作為其一例，ms培養(yǎng)基(1l為標(biāo)準(zhǔn))的成分由nh4no31650mg、kno31900mg、cacl2·2h2o440mg、mgso4·7h2o370mg、kh2po4170mg,、ki0.83mg、h3bo36.2mg、mnso4·4h2o22.3mg、znso4·7h2o8.6mg、na2moo4·2h2o0.25mg、cuso4·5h2o0.025mg、cocl2·6h2o0.025mg,、feso4·7h2o27.8mg、na2edta·2h2o37.3mg、肌醇(myoinositol)100mg、煙酸(nicotinicacid)0.5mg、鹽酸吡哆醇(pyridoxine-hcl)0.5mg、鹽酸硫胺素(thiamine-hcl)0.5mg、甘氨酸(glycine)2mg、蔗糖(sucrose)30000mg組成。從植物的葉子、植物的莖等誘導(dǎo)出植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，ms基本培養(yǎng)基的組成成分幾乎沒有什么差異，但誘導(dǎo)植物細(xì)胞、不定根時(shí)，作為最重要成分的植物生長激素的種類是不同的。根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞培養(yǎng)、采用葉或莖組織進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將其放在含6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-bap)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-d)的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以得到植物細(xì)胞培養(yǎng)物。在各個(gè)激素組合的比例中，6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-bap)和2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-d)的比例特征為1:0.4～0.8或1:0.5～0.6。即，相對于100重量份的6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-bap)，2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-d)占40～80重量份或50～60重量份。例如，6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-bap)和2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-d)的含量可以優(yōu)選為0.5～1mg/ml和0.3～0.6mg/ml。另一方面，培養(yǎng)不定根時(shí)，將其放在含吲哚丁酸(indole-3-butyricacid，iba)的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，由此獲得不定根培養(yǎng)物。例如，可以在含0.2～1mg/mliba的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)獲得不定根培養(yǎng)物。在本發(fā)明的上述(a)階段中，還可以包括用uva處理3～6小時(shí)，或往150um～400um培養(yǎng)基內(nèi)添加莽草酸進(jìn)行培養(yǎng)的工序。在本發(fā)明中，為了提高治愈創(chuàng)傷、抗老化、抗炎、抑制皮脂、改善粉刺、皮膚免受紫外線損傷、保護(hù)和改善皮膚屏障、皮膚美白、皮膚保濕等效果，也可以包括用引誘劑處理的工序。更詳細(xì)地說，這樣的引誘劑處理包括uva處理、莽草酸處理、高頻處理，而且也使酚類化合物、類胡羅卜素、類黃酮的含量增加。其詳細(xì)條件如下，還可以包括下述工序：1)uva:按照用作為物理引誘劑的uv-a熒光燈(20w，sankyodenki，japan)每天處理0.5h～8h的方式進(jìn)行培養(yǎng)。2)莽草酸：將200～600m莽草酸(shikimicacid)添加到ms培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。3)高頻處理：將已培養(yǎng)好的植物細(xì)胞或不定根，在50～500khz的條件下以5～30分鐘的間隔進(jìn)行2～6次的高頻處理。特別是，本發(fā)明中的高頻處理可以采用本領(lǐng)域中通常所使用的器具(itc株式會社、neo株式會社等)、或韓國專利申請第10-2012-0127017號(大韓民國專利公開10-2014-0060201號)所公開的高頻處理裝置。本發(fā)明中，對于如上所述的高頻處理裝置，只要是能夠發(fā)生和處理200-1500khz高頻的裝置均可以適用。本發(fā)明中，培養(yǎng)出上述高山火絨草的植物細(xì)胞或不定根后，利用高頻發(fā)生裝置優(yōu)選在100～400khz頻率下，一天當(dāng)中以15分鐘的間隔處理四次，并將該處理方式重復(fù)一周或兩周。具體來說，對于在上述韓國專利申請第10-2012-0127017號所公開的高頻處理裝置，其構(gòu)成如圖7所示，以下對其制造過程和高頻處理過程進(jìn)行詳 細(xì)說明。首先準(zhǔn)備由下述組件構(gòu)成的生物反應(yīng)器200，該生物反應(yīng)器200包括：具有規(guī)定大小的殼體210、在上述殼體210上方按照可拆卸的方式配置的上部蓋子220、配置于上述殼體210兩側(cè)同一線上的高頻端子230、支撐上述殼體210的水平支撐板240、具有規(guī)定高度且支撐上述水平支撐板240的固定棒250。而且，按照離上述生物反應(yīng)器200有一定間隔的方式設(shè)置高頻供給器300，該高頻供給器300由用以生成高頻的工作部(未圖示)、啟動(dòng)/結(jié)束工作和調(diào)節(jié)高頻的操作部310、顯示當(dāng)前狀態(tài)和工作狀態(tài)的顯示部320和表示頻率狀態(tài)的電平指示儀330組成。然后，按照離上述高頻供給器300有一定間隔且呈規(guī)定大小的方式設(shè)置的空氣供給器400，該空氣供給器400包括：配置于內(nèi)部的空氣生成部(未圖示)，配置在前方用以排出空氣的排出部420、向上述排出部420傳輸空氣的空氣軟管440。而且，如果在上述空氣供給器400的一側(cè)配置振動(dòng)記錄儀500，則完成了高頻細(xì)胞培養(yǎng)器100的組裝，其中，上述振動(dòng)記錄儀500包括：用以改變和記錄振動(dòng)的振動(dòng)工作部(未圖示)、用來調(diào)整開啟/結(jié)束工作和各種功能的振動(dòng)操作部510、顯示當(dāng)前狀態(tài)的振動(dòng)顯示部520、以及與上述高頻供給器300相連接的連接線530。在此，上述高頻細(xì)胞培養(yǎng)器100的組裝順序可以按照與上述情況不同的方式來構(gòu)成。接下來，觀察通過上述方式組成的高頻細(xì)胞培養(yǎng)器100的使用狀態(tài)，情況如下：首先，打開構(gòu)成上述生物反應(yīng)器200的、處于堵塞殼體210注入口211狀態(tài)的上部蓋子220，并向上述殼體210的內(nèi)部供給培養(yǎng)液和細(xì)胞培養(yǎng)，然后利用上部蓋子220關(guān)閉上述注入口211。接著，通過構(gòu)成上述高頻供給器300的操作部300調(diào)整好高頻設(shè)定值后，利用連接線233，將高頻傳送到生物反應(yīng)器200的高頻端子230上。同時(shí)，通過空氣軟管440將發(fā)生在上述空氣供給器400內(nèi)的空氣輸送到上述生物反應(yīng)器200的空氣注入部213。然后，被收納在上述殼體210內(nèi)部的細(xì)胞培養(yǎng)會受到通過高頻端子230傳輸?shù)母哳l影響，使用者通過顯示部320和電平指示儀330可以獲得實(shí)時(shí)供給的高頻信息。同時(shí)，振動(dòng)記錄儀500對傳送到上述高頻供給器300的生物反應(yīng)器200的振動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行記錄。對于上述高頻細(xì)胞培養(yǎng)器100，在生物反應(yīng)器200的培養(yǎng)結(jié)束后，操作部310通過高頻供給器300對作為物理引誘劑的高頻進(jìn)行調(diào)整，同時(shí)振動(dòng)記錄部500經(jīng)過振動(dòng)顯示部520的確認(rèn)后進(jìn)行處理。在培養(yǎng)植物細(xì)胞、不定根時(shí)，采用上述高頻細(xì)胞培養(yǎng)器的情況下，例如，生物反應(yīng)器的反應(yīng)體積為1l、功率為20w、用以細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成成分為ms培養(yǎng)基粉末4.4g、蔗糖30g、芐基腺嘌呤2mg、iaa2mg、緩沖用mes(ph5.8)，在上述培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一周后進(jìn)行高頻處理，然后將經(jīng)過上述處理的樣品回收后進(jìn)行6～10小時(shí)的真空干燥處理。然后，以50％乙醇為溶劑，實(shí)施1個(gè)小時(shí)的超音波提取和30分鐘的渦流處理(vortexing)，對充分分離出次級代謝產(chǎn)物的上清液進(jìn)行離心處理后得到樣品，所有樣品均采用高效液相色譜儀(hpls，waters650eadvancedproteinpurificationsystem)分析方式，此時(shí)使用gemini5uc18110a色譜柱(4.6*250mm,5micron，phenomenex公司)。流動(dòng)相溶劑的濃度梯度設(shè)為水(含0.1％tfa(三氟乙酸，trifluoroaceticacid))：乙腈(acetonnitrile，含0.1％tfa)，在開始的0～45分鐘，將濃度梯度設(shè)為10:0，之后的45～50分鐘，將濃度梯度變換成1:9，并在流速1ml/min條件下對樣品進(jìn)行分析，此時(shí)檢測器采用uv檢測器(230nm)。在本發(fā)明的上述(b)階段，將包括通過(a)階段培養(yǎng)而獲得的植物細(xì)胞或不定根培養(yǎng)物自身的組合物制成適宜形態(tài)的皮膚外用劑組合物，或者通過公知的提取方法，對上述培養(yǎng)物進(jìn)行提取處理后獲得提取物狀態(tài)的產(chǎn)物，并將其制造成適宜形態(tài)的皮膚外用劑組合物。例如，在上述(b)階段，對通過(a)階段獲得的高山火絨草植物細(xì)胞或不定根培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、粉末化處理后，將其與精制水混合在一起制成組合物；或者是對通過(a)階段獲得的高山火絨草植物細(xì)胞或不定根培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、粉末化處理后將其混合在精制水中后，還可以包括實(shí)施冷水提取、熱水提取、采用荷荷巴油等植物性油的提取、采用無機(jī)溶劑的提取、或者采用如乙醇等的酒精等有機(jī)溶劑的提取處理制造出組合物的工序。作為另一例，也可以采用對獲得自(a)階段的培養(yǎng)物進(jìn)行熱風(fēng)干燥后，通過粉末化處理使水分蒸發(fā)的方式來制造。另外，根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物具 有優(yōu)異的酪氨酸酶抑制力，因此可應(yīng)用于皮膚美白。另外，根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物均可以應(yīng)用在收縮毛孔方面。另外，根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物，具有抑制皮脂分泌、抑制或改善粉刺、保護(hù)皮膚免受紫外線損傷、治愈創(chuàng)傷、皮膚保濕、保護(hù)或改善皮膚屏障等的效果。另外，根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物具有通過抑制inos活性達(dá)到抗炎效果，即具有緩解、減輕和抑制炎癥等的效果。在本發(fā)明中，上述皮膚外用劑組合物可以為化妝品組合物或藥劑組合物。上述化妝品組合物中，化妝品制劑可包括可接受的載體。在此，“化妝品制劑中可接受的載體”是指，可包含在化妝品制劑中的、本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化合物或組合物，或者是將來需要開發(fā)的化合物或組合物，這些化合物或組合物與人體皮膚接觸時(shí)不發(fā)生異常毒性、不穩(wěn)定性或刺激性，可適用于人體。相對于本發(fā)明的皮膚外用劑組合物，上述載體含量占整個(gè)組合物重量的約1重量％～99.99重量％，優(yōu)選占組合物重量的90％～99.9％。然而，上述比率可根據(jù)本發(fā)明所制造出的后述皮膚外用劑組合物的不同劑型、或其具體適用部位(臉、脖子等)、或優(yōu)選的適用量等而不同，因此無論從哪個(gè)方面來看，上述比率不能理解為限制本發(fā)明范圍的因素。作為上述載體，可舉出酒精、油、表面活性劑、脂肪酸、硅油、潤濕劑、保濕劑、粘性改性劑、乳劑、穩(wěn)定劑、紫外線散射劑、紫外線吸收劑、成色劑、香料等。用作上述酒精、油、表面活性劑、脂肪酸、硅油、潤濕劑、保濕劑、粘性改性劑、乳劑、穩(wěn)定劑、紫外線散射劑、紫外線吸收劑、成色劑、香料等而使用的化合物/組合物等均已在本領(lǐng)域中公知，因此只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可以選擇適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)/組合物來使用。作為本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明的皮膚外用劑組合物除了包括上述高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物之外，還可以包括甘油、丁二醇、丙二醇、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚、乙醇和三乙醇胺等，也可以根據(jù)需 要包括微量的防腐劑、香料、著色劑、精制水等。根據(jù)本發(fā)明的皮膚外用劑組合物可制成多種形態(tài)，例如可以制成為化妝水、精華素、凝膠、乳液、護(hù)膚液、霜(水包油型、油包水型、多相)、溶液、懸浮液(無水和水系)、無水生成物(油或醇系)、凝膠、面膜、剝撕式面膜、粉末或明膠等有皮膜的膠囊(軟膠囊、硬膠囊)劑型等形態(tài)。本發(fā)明的皮膚的概念不僅指臉，也包括頭皮、全身的皮膚，作為能夠適用于上述頭皮的皮膚外用劑組合物，可舉出洗發(fā)露、護(hù)發(fā)素、焗油膏、頭發(fā)生長劑等，作為可適用于全身的沐浴露等的用途，能夠制成多種形態(tài)的組合物。含有本發(fā)明高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物的皮膚外用劑組合物的制造方法并不限定于上述制造方法，只要是具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的通常知識的人員都可以知道通過對上述制造方法進(jìn)行部分變形的方式也可以制造出含有本發(fā)明高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物的皮膚外用劑組合物。特別是，除了在本發(fā)明特別公開的制造方法以外，上述皮膚外用劑組合物還可以通過常用的制造方法制造出一般乳劑型和可溶化劑型狀態(tài)的組合物。被制造成皮膚外用劑組合物時(shí)，作為乳化劑型化妝品可舉出營養(yǎng)化妝水、精華素等，作為可溶化劑型可舉出柔膚化妝水。而且，本發(fā)明的組合物含有皮膚科學(xué)上可允許的介質(zhì)和基劑，由此可以制造出皮膚科學(xué)上通常用于局部或全身的輔助劑形式的皮膚外用劑組合物。而且，還可以提供適宜用作化妝品的劑型，例如以溶液、凝膠、固體或者面糊無水生成物，將油相分散于水相而獲取的乳液、懸浮液、微乳液、微膠囊、微?；蛘唠x子型(脂質(zhì)體)、非離子型的囊泡分散劑的形態(tài)，面霜、化妝水、乳液、粉底、軟膏、噴霧或者遮瑕棒的形態(tài)提供。并且本發(fā)明的組合物可以被制成泡沫(foam)形態(tài)、或者制成還包括被壓縮的推進(jìn)劑的氣霧劑組合物的形態(tài)。另外，本發(fā)明的皮膚外用劑組合物還可以含有如脂肪物質(zhì)、有機(jī)溶劑、溶解劑、濃縮劑及膠化劑、軟化劑，抗氧化劑，懸浮劑、穩(wěn)定化劑、發(fā)泡劑(foamingagent)、芳香劑、表面活性劑、水、離子型或者非離子型柔化劑、 填充劑、金屬離子封鎖劑及螯合劑、保存劑、維生素、阻斷劑、濕潤劑、精油、染料、顏料、親水性或者親油性活性劑、脂類囊泡、或者與通常使用于化妝品的其他任意成分一樣、通常使用在化妝品學(xué)或皮膚科學(xué)領(lǐng)域中的輔助劑。而且，上述成分可以按照化妝品學(xué)或者皮膚科學(xué)領(lǐng)域里通常所使用的量來進(jìn)行添加。如上所述的本發(fā)明的皮膚外用劑組合物，包括皮膚收斂、抗炎、治愈創(chuàng)傷、抗老化等功能性化妝品的形態(tài)。如果本發(fā)明的組合物為藥學(xué)組合物，則在下述實(shí)施例中可起到改善皮膚狀態(tài)的藥學(xué)組合物的功能。上述藥學(xué)組合物，除了作為有效成分的高山火絨草植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物之外，還可以包括“藥學(xué)上可允許的載體”，這樣的載體可選自由稀釋劑、潤滑劑、結(jié)合劑、崩解劑、甜味劑、穩(wěn)定劑和防腐劑組成的組中。上述藥學(xué)組合物還可以包括添加劑。作為上述添加劑可包括香料、維生素和抗氧化劑。作為上述載體，只要是藥學(xué)上可允許的載體均可以使用，例如作為稀釋劑可為乳糖、糊精、木薯(tapioca)淀粉、玉米淀粉、大豆油、微晶纖維素、或者為甘露醇，作為潤滑劑可為硬脂酸鎂或滑石，作為結(jié)合劑可為聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基纖維素。而且，作為崩解劑，可以為羧甲基纖維素鈣、淀粉乙醇酸鈉、波拉克林鉀、或交聚維酮，作為甜味劑可以為白糖、果糖、山梨糖醇或阿斯巴甜，作為穩(wěn)定劑可以為羧甲基纖維素鈉、β-環(huán)糊精或黃原膠，作為防腐劑可以為對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸鉀。上述藥劑學(xué)組合物可被制成在本
技術(shù)領(lǐng)域：
大家所公知的常用藥學(xué)劑型。上述藥學(xué)組合物能夠被制劑成口服給藥制劑、注射劑、栓劑、透皮給藥制劑和鼻腔給藥制劑的劑型進(jìn)行給藥。例如，上述劑型可以為如液體、懸浮劑、散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑或提取物的口服給藥劑型。以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。但是下述的實(shí)施例僅僅是一種例示并不限定本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)可以理解，本發(fā)明的范圍并不限定在這些實(shí)施例上。特別是在下述實(shí)施例中，雖然對高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物或其提取物的功能進(jìn)行了確定，但對于非提取物的培養(yǎng)物自身來說也具有同 樣的效果，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。實(shí)施例1實(shí)施例1-1根據(jù)本發(fā)明的從高山火絨草中的植物細(xì)胞誘導(dǎo)將本發(fā)明中所使用的高山火絨草種子(通過網(wǎng)購購買，原產(chǎn)地：荷蘭)浸泡在70％乙醇中30秒，然后用滅菌水洗滌、用消毒液(30％rox+tween20)消毒20分鐘，再用滅菌水洗滌3次，種子發(fā)芽后，利用鋒利的刀一下子割傷高山火絨草的葉，并將其放進(jìn)含有6-芐氨基嘌呤1mg/l、2,4-d0.3mg/l、3％蔗糖和瓊脂8g/l的基礎(chǔ)ms(murashigeandskoog1962，duchefa公司制造，catno.m0221)培養(yǎng)基內(nèi)，并在溫度25℃、濕度70％的生長條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)出初期植物細(xì)胞。采用1n的氫氧化鈉(naoh)將各個(gè)培養(yǎng)基的ph值調(diào)整為5.8。繼代培養(yǎng)的間隔時(shí)間設(shè)為2周(圖1)。實(shí)施例1-2根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物體不定根的誘導(dǎo)為了從高山火絨草的植物細(xì)胞誘導(dǎo)出不定根，往ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加蔗糖30g/l、蛋白石(gelite)2.0g/l，并投入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)iba(indole-3-butyricacid)0.5mg/l，然后放在25±2℃培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行4周的培養(yǎng)。從被誘導(dǎo)出的不定根頂端部切出1cm左右，并將其接種在向1/2ms培養(yǎng)基內(nèi)添加0.5mg/liba(indole-3-butyricacid)、蔗糖50g/l而形成的液體培養(yǎng)基內(nèi)。然后放在25±2℃培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行4周的培養(yǎng)。采用不銹鋼濾網(wǎng)對所得到的不定根進(jìn)行過濾以分離出培養(yǎng)基，并用干凈的紙巾充分除去水分，之后在60℃溫度下進(jìn)行2天的干燥處理后用于試驗(yàn)。采用1n的氫氧化鈉(naoh)將各個(gè)培養(yǎng)基的ph值調(diào)整為5.8。實(shí)施例1-3根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根的批量生產(chǎn)為了批量生產(chǎn)出無菌誘導(dǎo)自高山火絨草植物體后經(jīng)過培養(yǎng)而獲得的高山火絨草植物細(xì)胞和高山火絨草不定根，如上所述，若批量生產(chǎn)出高山火絨草植物細(xì)胞，則在含有6-芐氨基嘌呤1mg/l、2,4-d0.3mg/l的ms培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，若批量生產(chǎn)出高山火絨草不定根，則在含有0.5mg/liba(indole-3-butyricacid)、蔗糖50g/l的1/2ms培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，然后將上述 培養(yǎng)基放在溫度25±2℃培養(yǎng)室內(nèi)，并在濕度70％、20l氣球型生物反應(yīng)器(由三星科學(xué)株式會社制造)的空氣供給量為0.1vvm左右的條件下培養(yǎng)5周。實(shí)施例1-4對根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根的引誘劑處理對獲得自上述實(shí)施例1-3的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物實(shí)施下述的引誘劑處理。對上述獲得的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器中在添加有1mg/l的玉米素(zeatin)、0.2mg/l的生長調(diào)節(jié)物的ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)在25℃溫度下培養(yǎng)5周，然后連接高頻波形發(fā)生裝置而在100～400khz的頻率下以15分鐘的間隔一天之內(nèi)進(jìn)行4次高頻處理，并將上述處理重復(fù)進(jìn)行一周或兩周。在上述培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一周、且經(jīng)過高頻處理的上述樣品被回收后，對樣品進(jìn)行3～5天的真空干燥處理。對作為根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草的植物細(xì)胞、不定根培養(yǎng)物的次級代謝產(chǎn)物的類胡羅卜素、類黃酮和酚類化合物的含有量的測定方法如下：根據(jù)aoac法檢測出類胡羅卜素的總量。即，往經(jīng)過冷凍干燥處理的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根試料中加入丙酮：核酸(3:7v/v)混合液后進(jìn)行提取處理，然后用蒸餾水洗滌經(jīng)過濾而得到的提取液，并將上述提取液注入到由活性氧化鎂：硅藻土(1:9v/v)的混合物而制成的柱層析內(nèi)，然后進(jìn)行吸引的同時(shí)，用丙酮：核酸(1:9v/v)的混合液測量436nm處的吸光度。類黃酮總含量通過基于比色法(colorimetric)的sakanaka等(2005)方法來進(jìn)行測定。往高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物、以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液0.25ml內(nèi)添加1.25ml蒸餾水，然后再添加5％(w/v)nano2溶液0.075ml。6分鐘后，往上述混合液內(nèi)添加10％(w/v)alcl3溶液0.15ml后放置5分鐘，之后再添加1nnaoh溶液0.5ml。繼續(xù)添加蒸餾水直至混合液的最終體積達(dá)到2.5ml，然后測定波長510nm處的吸光度。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用了(+/-)兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液(catechinstandardsolution，sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)，用mgg-1dw表示類黃酮的總含量。酚類總含量采用下述方法來進(jìn)行測定：采用基于folin-ciocalteu法 (folin和ciocalteu，1927)的ali等(2006a)提出的方法來測定酚的總含量，其中在folin-ciocalteu法，folin-ciocalteu試劑被高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物中所含有的酚類物質(zhì)還原而發(fā)出鉬藍(lán)色。在提取液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液0.05ml中添加蒸餾水2.55ml后，繼續(xù)添加2n福林酚試劑溶液(10timedilution；sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)0.1ml。6分鐘后，往上述混合液中添加20％(w/v)na2co3溶液0.15ml，并在黑暗狀態(tài)下放置30分鐘后，測定波長760nm處的吸光度。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用了沒食子酸(garlicacid)，用mgg-1dw表示酚的總含有量。表1(單位：mgg-1)根據(jù)上述表1所示的結(jié)果可知，實(shí)施高頻處理后類胡蘿卜素、類黃酮和酚類的含量在增加，這作為一種信號與抗炎和抗老化功能相關(guān)聯(lián)，最終確認(rèn)本發(fā)明的組合物具有抗老化效果。除了本發(fā)明的高山火絨草以外，對山參不定根進(jìn)行如上所述的高頻處理時(shí)，其有效成分的峰值反而卻減少，由此可知高頻處理不是對所有植物細(xì)胞都具有提高效能的作用。實(shí)施例1-5根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物的制造通過實(shí)施例1-3得到高山火絨草植物細(xì)胞和不定根的培養(yǎng)物后，用干凈的紙巾除去水分，然后將其放進(jìn)干燥器內(nèi)，在60℃溫度下進(jìn)行2天的干燥處理。將高山火絨草植物細(xì)胞和不定根的培養(yǎng)物的干燥粉末50g放進(jìn)容器內(nèi)后添加1l的精制水，并在90～120℃溫度下進(jìn)行48小時(shí)的熱水提取處理。提取處理結(jié)束后，用濾網(wǎng)進(jìn)行過濾以除去固體成分，并將經(jīng)過過濾而得到的 高山火絨草植物細(xì)胞和不定根提取物用于本發(fā)明中。作為對照試驗(yàn)，通過相同的熱水提取方法獲得高山火絨草提取物后進(jìn)行比較。實(shí)施例1-6針對根據(jù)本發(fā)明的高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物的hplc成分分析采用高效液相色譜儀(hpls)，對高山火絨草植物細(xì)胞和不定根的培養(yǎng)提取物進(jìn)行成分分析。分析條件如下：表2對高山火絨草植物體(熱水提取和70％乙醇提取)和高山火絨草植物細(xì)胞的熱水提取物進(jìn)行分析的結(jié)果可知，雖然通過高山火絨草植物體的熱水提取和70％乙醇提取看起來得到了相似成分的圖案，但在高山火絨草植物細(xì)胞的熱水提取中，經(jīng)過引誘劑處理，能夠使表現(xiàn)出抗氧化功能、抗老化功能的綠原酸(chlorogenicacid)成分含量增加(圖2)。試驗(yàn)例1：高山火絨草的植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的細(xì)胞毒性(cytotoxicity)為了觀察皮膚細(xì)胞對實(shí)施例1～3中所制造的組合物的生存率，從美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(atcc，americantypeculturecollection)分株引進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞(humanskinfibroblast,ccd-986sk)，并對其進(jìn)行了培養(yǎng)。將各個(gè)細(xì)胞的濃度設(shè)成1×104cells/ml后，將其接種在24孔(well)培養(yǎng)板 上。所使用的培養(yǎng)基為含有10％fbs的dmem(dubelcco’smodifiedeagle’smedium，brl，usa)培養(yǎng)基。將細(xì)胞放進(jìn)含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行48小時(shí)的培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物占培養(yǎng)容器表面積的25～30％時(shí)，將細(xì)胞放進(jìn)由實(shí)施例1～3制造的組合物含量占0.1～5％的、另一個(gè)fbs-freedmem培養(yǎng)基內(nèi)，再進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，添加3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt，sigmam5655，usa)溶液(2.5mg/ml)50ul后，再進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)，然后除去上清液，在每個(gè)孔加入200ul的二甲基亞砜(dmso,sigmad2650,usa)溶液后攪拌20分鐘，由此形成結(jié)晶甲瓚(formazan)，將上述結(jié)晶融化后，使用96孔板，每孔取100ul，并通過酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)方式檢測出570nm處的吸光度。對于皮膚細(xì)胞的生存率狀況，以使用純水的對照組的吸光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，通過下述數(shù)學(xué)式算出來后用百分比來表示生存率狀況，其結(jié)果如表3所示。數(shù)學(xué)式1細(xì)胞增殖效果(％)＝[(試驗(yàn)組吸光度-對照組吸光度)/對照組吸光度]×100表3如表3所示，采用上述人皮膚成纖維細(xì)胞檢查培養(yǎng)提取物對細(xì)胞毒性的影響的結(jié)果呈0.5％、2.0％和5.0％濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物均沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。即，對細(xì)胞生存率沒有影響。相反，在高山 火絨草提取物的情況下，根據(jù)處理濃度表現(xiàn)出20～30％的細(xì)胞毒性率。試驗(yàn)例2：高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的抗氧化效果(abts自由基清除能力)利用abts試劑的抗氧化能力的測定方法如下：通過與過硫酸鉀的反應(yīng)而生成的abts自由基，被提取物中的抗氧化物質(zhì)所清除，從而使自由基所特有的青綠色褪去，利用上述abts試劑特征，通過對vandenberg等方法的變形來進(jìn)行測定。1.0mm的aaph(2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽)與用100mmpbs緩沖液溶解的2.5mmabts(2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)混合后，放在68℃的恒溫槽內(nèi)進(jìn)行12分鐘的反應(yīng)。取按不同濃度進(jìn)行稀釋的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根的培養(yǎng)提取物20ul和abts溶液980ul，將其放進(jìn)37℃溫度的水槽內(nèi)反應(yīng)10分鐘，同時(shí)測定在735nm處逐漸減少的吸光度，此時(shí)，作為陽性對照組，使用了水溶性維生素e(trolox)0.1％。對于abts自由基的清除能力，通過下述數(shù)學(xué)式2來進(jìn)行計(jì)算，其結(jié)果如表4所示。數(shù)學(xué)式2abts自由基清除能力(％)＝(blanko.d.-sampleo.d.)/blanko.d.×100表4從上述表4中可知，在0.1～5.0％濃度條件下，隨著本發(fā)明組合物高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的含量的增加，其抗氧化能力也在增加，而且通過高頻處理的組合物，其抗氧化能力會進(jìn)一步得到提高。試驗(yàn)例3：高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的前膠原蛋白生物合成增加試驗(yàn)將人皮膚成纖維細(xì)胞(humanskinfibroblast)放進(jìn)溫度37℃、5％co2且能夠維持一定濕度的細(xì)胞培養(yǎng)器內(nèi)，將其用含有10％fbs、青霉素(50u/ml)、鏈霉素(50/ml)的dmem(dubelcco'smodifiedeagle'smedium,gibco，usa)培養(yǎng)基后，以1x105cell/ml的密度、每孔500ul的方式分株到48孔板后進(jìn)行24小時(shí)的分株培養(yǎng)。將對照組(dmem培養(yǎng)基)、以及含有0.1～5％濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根的培養(yǎng)提取物的培養(yǎng)基放到溫度37℃、5％co2培養(yǎng)器內(nèi)進(jìn)行48小時(shí)培養(yǎng)。經(jīng)過48小時(shí)后，從各培養(yǎng)基的上清液各取20ul，用i型前膠原羧基端肽試劑盒(picp，takara，catno.mk101)檢測新合成的膠原蛋白含量。并根據(jù)下述數(shù)學(xué)式進(jìn)行計(jì)算后，將其結(jié)果表示在表中。數(shù)學(xué)式3膠原蛋白生物合成的增加率(％)＝{試驗(yàn)組膠原蛋白量/對照組膠原蛋白量}·1×100表5從上述表5中可知，隨著本發(fā)明組合物高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的含量的增加，膠原蛋白的生物合成量也在增加，而且還可以了解到即使經(jīng)過高頻處理，這種膠原蛋白的生物合成量也在進(jìn)一步增加。由此可知，本發(fā)明的組合物對膠原蛋白的合成具有優(yōu)異的增進(jìn)效果。試驗(yàn)例4：由高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的aqp3表達(dá)增加而產(chǎn)生的保濕效果將人角質(zhì)形成細(xì)胞株(hacat)與dmem(dubelcco'smodifiedeagle'smedium)、10％胎牛血清(fatalbovineserum，fbs)、1％抗菌-抗真菌劑(gibco,cat.#15240-062)一起放進(jìn)100mm/60.1cm的培養(yǎng)皿后，在溫度37℃、5％co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)80％以上的人角質(zhì)形成細(xì)胞融合(confluence)時(shí)，以1×104cells/well的密度分株在96孔板上，并在細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直至細(xì)胞融合度達(dá)到80％以上，如果細(xì)胞融合度達(dá)到80％以上，則換成dmem自由培養(yǎng)基(不含fbs)來處理試驗(yàn)物質(zhì)。結(jié)束物質(zhì)處理后，再培養(yǎng)24小時(shí)，然后觀察各個(gè)物質(zhì)對水通道蛋白3(aquaporin3)表達(dá)的影響。試驗(yàn)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr法，其試驗(yàn)順序如下：rna分離采用了實(shí)時(shí)細(xì)胞一步法緩沖液套裝(fastlanecellone-stepbufferset，qiagencat.#216213)。用fcw(細(xì)胞洗滌緩沖液)來洗滌去除了培養(yǎng)基的細(xì)胞后，添加50ul的細(xì)胞處理混合物(在添加有fcpl緩沖液的fcpw中添加gdanwipeout緩沖液的混合物)，在室溫下進(jìn)行5分鐘培養(yǎng)(incubation)后轉(zhuǎn)移到新的e-管，并在75℃溫度下使其反應(yīng)5分鐘。為了分析出與保濕功能相關(guān)的基因-水通道蛋白3，將上述提取的rna作為模板(template)，按照2xquantitectsybrgreenrt-pcrmastermix手冊，用實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析儀(商品名:rotor-geneq，由qiagen公司制造)進(jìn)行分析。試驗(yàn)中所使用的引物(primer)通過qiagen公司制造的quantitectprimerassays(aquaporin3,cat.#qt00212996)和gapdh(cat.#qt01192646)進(jìn)行了規(guī)范化。實(shí)時(shí)熒光定量pcr的條件如下：數(shù)學(xué)式4：表達(dá)率(fold)＝(試樣處理組的表達(dá)率)/(對照組的表達(dá)率)根據(jù)圖3可知，隨著本發(fā)明的組合物高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物含量的增加，與保濕效果相關(guān)聯(lián)的aqp-3(aquaporin-3)遺傳基因的生物合成量也在增加，而且通過高頻處理，這樣的基因生物合成功能得到進(jìn)一步提高。試驗(yàn)例5：基于高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的mmp-2表達(dá)抑制的皺紋改善效果皮膚皺紋是因膠原蛋白的合成和分解的不均衡而引起的，一般來講，皮膚上ⅰ型膠原合成與其分解酶mmp-1處于平衡狀態(tài)。然而，在出現(xiàn)光老化的皮膚上，ⅰ、ⅲ型膠原合成下降，mmp-1活性增強(qiáng)。這樣的基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrixmetalloproteinases，mmps)作為蛋白分解酶具有分解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix)的功能，在正常情況下與治愈傷口或組織再生過程相關(guān)聯(lián)。為了確認(rèn)本發(fā)明組合物是否具有抑制mmp-2生成的效果，進(jìn)行了下述試驗(yàn)。將人皮膚成纖維細(xì)胞(ccd-986sk，fibroblast)與dmem(dubelcco’smodifiedeagle’smedium)、10％胎牛血清(fatalbovineserum，fbs)、1％抗菌-抗真菌劑(gibco,cat.#15240-062)一起放進(jìn)100mm/60.1cm的培養(yǎng)皿后，在溫度37℃、5％co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)100％以上的人皮膚成纖維細(xì)胞融合(confluence)時(shí)，以 1×104cells/well的密度的細(xì)胞分株接種在96孔板上，并在細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行分株培養(yǎng)，直至細(xì)胞融合度達(dá)到80％以上，如果細(xì)胞融合度達(dá)到80％以上，則除去培養(yǎng)基后，用10～15mj/cm2的uvb進(jìn)行照射以誘導(dǎo)出皺紋，然后換成dmem自由培養(yǎng)基(不含fbs的培養(yǎng)基)來處理試驗(yàn)物質(zhì)。結(jié)束物質(zhì)處理后，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)24小時(shí)，然后觀察各個(gè)物質(zhì)對作為uvb照射而引起皺紋的關(guān)聯(lián)基因mmps表達(dá)的影響。試驗(yàn)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr法，其試驗(yàn)順序如下：rna分離采用了實(shí)時(shí)細(xì)胞一步法緩沖液套裝(qiagencat.#216213)。用fcw(細(xì)胞洗滌緩沖液)來洗滌去除培養(yǎng)基的細(xì)胞后，添加50ul的細(xì)胞處理混合物(在添加有fcpl緩沖液的fcpw中添加gdanwipeout緩沖液的混合物)，在室溫下進(jìn)行5分鐘的培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移到新的e-管，并在75℃溫度下使其反應(yīng)5分鐘。為了分析出與皺紋形成相關(guān)的基因，將上述提取的rna作為模板，按照2xquantitectsybrgreenrt-pcrmastermix手冊，用實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析儀(商品名:rotor-geneq，由qiagen公司制造)進(jìn)行分析。使用qiagen公司的quantitectprimerassays(mmp-2,cat.#qt00088396)，而且相對表達(dá)率利用作為管家基因(housekeepinggenes)的gapdh(cat.#qt01192646)來進(jìn)行了規(guī)范化。實(shí)時(shí)熒光定量pcr的條件如下：數(shù)學(xué)式5：表達(dá)率(fold)＝(試樣處理組的表達(dá)率)/(對照組的表達(dá)率)根據(jù)圖4可知，對mmp-2生物合成的抑制效果，通過0.5～5.0％濃度的高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物的處理，表現(xiàn)出對mmp-2生物合成基因表達(dá)的優(yōu)異的抑制效果，而且通過高頻處理，仍然具有對mmp-2生物合成基因表達(dá)的優(yōu)異的抑制效果。試驗(yàn)例6：通過抑制inos活性來檢測抗炎效果的試驗(yàn)生成自raw264.7細(xì)胞株的一氧化氮(no)的量在細(xì)胞培養(yǎng)液中以no2-的形態(tài)存在，因此利用griess試劑進(jìn)行了測定。通過1g的脂多糖(lps)形成活性化狀態(tài)的raw264.7細(xì)胞株中，為了檢測出對一氧化氮(no)生成的抑制效果，對含有通過上述實(shí)施例1而獲得的0.1～5.0％濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根細(xì)胞培養(yǎng)提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行處理的試驗(yàn)組、以及對照組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)處理后，將griess試劑與細(xì)胞培養(yǎng)上清液按照細(xì)胞培養(yǎng)上清液100ul、griess試劑(1％sulfanilamidein5％phosphoricacid,1％-naphthylamideinh2o)100ul進(jìn)行混合，使其在96孔板進(jìn)行10分鐘的反應(yīng)，然后檢測540nm處的吸光度。關(guān)于no2-濃度的測定，采用了稀釋硝酸鈉后測定吸光度的方式，最后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。表6如表6所示，inos的活性通過0.5～5.0％濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物處理，與對照組相比阻礙no生成，且顯示出極其優(yōu)異的抑制炎癥的效果。而且通過實(shí)驗(yàn)可知，即使在經(jīng)過高頻處理的情況下，也顯 示基于優(yōu)異的inos活性的炎癥抑制效果。試驗(yàn)例7：毛孔收縮效果試驗(yàn)(體外試驗(yàn))為了檢測出本發(fā)明高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物組合物的毛孔收縮效果，以通過上述實(shí)施例1所制造的組合物為對象，作為代替皮膚的蛋白質(zhì)使用了血紅蛋白，由此進(jìn)行了檢測毛孔收縮效果的試驗(yàn)。利用0.9％磷酸鹽緩沖生理鹽水(0.1mm,ph7.4)制造出血紅蛋白溶液(0.05g/50ml)，并向2ml血紅蛋白溶液中加入通過上述實(shí)施例1而制造的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根細(xì)胞培養(yǎng)提取物2ml，然后進(jìn)行30秒的振蕩混合處理，接著在轉(zhuǎn)速3500rpm的條件下進(jìn)行10分鐘的離心分離，取其上清液1ml，加入2ml的精制水后，在波長407nm條件下，用紫外可見光譜法進(jìn)行了測定。作為對照組，添加了2ml的磷酸鹽緩沖生理鹽水(pbs)。表7測定含有0.5～5.0％濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物組合物的組成物中血紅蛋白的沉淀量，由此評價(jià)毛孔收縮效果，判斷標(biāo)準(zhǔn)為血紅蛋白的沉淀(％)越高，其毛孔收縮效果更優(yōu)秀。即，通過與高山火絨草提取物的比較，確定高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的毛孔收縮效果極佳，而且通過實(shí)驗(yàn)可知，即使在進(jìn)行高頻處理的情況下，也具有優(yōu)異的 毛孔收縮效果。試驗(yàn)例8：皮脂抑制效果試驗(yàn)為了確定高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物對皮脂的抑制效果，選出10名被試驗(yàn)者，4周后利用皮膚油脂測試儀(sebummetersm810)對皮膚的皮脂分泌量進(jìn)行測定。該試驗(yàn)在22±2℃、40±5％濕度下進(jìn)行。如果是油性皮膚，則測定值為220ug/cm2以上，如果是正常皮膚，則測定值為100～220ug/cm2。作為對照組使用了精制水，其試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。表8如上述表8所示的結(jié)果，與對照組相比，2％高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物具有極其優(yōu)良的抑制皮脂分泌的效果，而且即使在經(jīng)過高頻處理的情況下，仍然具有優(yōu)異的抑制皮脂分泌效果。試驗(yàn)例9：改善粉刺的效果以有粉刺的男女10名為被試驗(yàn)者，早晚各一次連續(xù)4周在臉上均勻抹上由實(shí)施例1制造的2％濃度的高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物化妝水。對于判斷粉刺的改善效果來說，根據(jù)被試驗(yàn)者的感覺程度，參考了下述判斷標(biāo)準(zhǔn)，用1～3分來評價(jià)試驗(yàn)之前的狀態(tài)后，再評價(jià)粉刺的治愈效果，并將其結(jié)果表現(xiàn)在表中。<試驗(yàn)前狀態(tài)的評價(jià)>1＝有一點(diǎn)點(diǎn)粉刺2＝有一些粉刺3＝粉刺嚴(yán)重<粉刺治愈效果判斷>-：幾乎沒有效果+：有一點(diǎn)效果++：減輕很多+++：完全治愈表9測試對象試驗(yàn)前狀態(tài)經(jīng)過2周后的效果經(jīng)過4周后的效果測試對象12++測試對象21+++測試對象31-+測試對象42--測試對象52+++測試對象62++測試對象73+++++測試對象82-++測試對象93++測試對象102+++如上述表9可知，使用了4周含有2％高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物的柔膚化妝水后，大部分測試對象的粉刺均得到了改善，而且即使在經(jīng)過高頻處理的情況下，也具有上述的粉刺改善效果。試驗(yàn)例10：針對紫外線照射的細(xì)胞保護(hù)效果作為用以uv照射的光源使用了放射出302nm波長紫外線的紫外線交聯(lián)儀cl-1000(ultra-violetproducts，ca)。將作為皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的hacat細(xì)胞以1x105cells/ml濃度放進(jìn)24孔板后，放在培養(yǎng)器內(nèi)進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基并用磷酸緩沖液進(jìn)行洗滌。添加500ul磷酸緩沖液后，以10mj/cm的劑量照射紫外線，然后換成不含fbs的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，并將通過實(shí)施例1獲得的高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物、不定根培養(yǎng)提取物試樣處理成1％濃度，然后在上述新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。在此，添加5mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt， sigma)后，放進(jìn)培養(yǎng)器內(nèi)培養(yǎng)3小時(shí)后形成甲臜(formazan)，用dmso溶解甲臜(formazan)后將其移動(dòng)到96孔板，并通過酶標(biāo)儀(elisareader)測定595nm處的吸光度，然后與紫外線照射后未用試劑處理的對照組比較細(xì)胞生存率。表10為了評價(jià)植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物對角質(zhì)形成細(xì)胞的保護(hù)效果，將人皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，hacat)露出在20mj/cm劑量的紫外線照射下后，進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)，并實(shí)施能夠確定細(xì)胞生存率的mtt細(xì)胞存活率分析(mttassay)，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，隨著高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物濃度的增加，細(xì)胞生存率(cellvialbility)也在增加。由此可以確定：高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物在紫外線照射下具有細(xì)胞保護(hù)效果，且在經(jīng)過高頻處理的情況下，也具有良好的細(xì)胞保護(hù)功能。試驗(yàn)例11：采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)傷治愈、抗老化效果將人角質(zhì)形成細(xì)胞株(hacat)與dmem(dubelcco’smodifiedeagle’s medium)、10％胎牛血清(fatalbovineserum，fbs)、1％抗菌-抗真菌劑(gibco)一起放進(jìn)100mm/60.1cm2的培養(yǎng)皿后，在溫度37℃、5％co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)90％以上的人角質(zhì)形成細(xì)胞融合(confluence)時(shí)，在100mm/60.1cm2的培養(yǎng)皿以1.5×105cells/12孔板的密度分株后進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)，然后換成dmem自由培養(yǎng)基(不含fbs)，在各個(gè)孔內(nèi)利用200p探針劃出#形狀的劃痕，然后用高山火絨草提取物、高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物和不定根提取物來處理劃痕。處理后的0小時(shí)時(shí)間段內(nèi)，用顯微鏡照下細(xì)胞圖像，并在溫度37℃、5％co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。物質(zhì)處理后進(jìn)行18-20小時(shí)的繼續(xù)培養(yǎng)，然后去除培養(yǎng)基并加入定像液(4％多聚甲醛)，并在常溫下進(jìn)行15分鐘的培養(yǎng)(incubation)，結(jié)束后用pbs洗滌3次。固定細(xì)胞(fixedcells)可以在4℃下保存一個(gè)月左右。用顯微鏡照下傷口愈合程度后利用imagej的程序進(jìn)行計(jì)算。作為陽性對照組使用了300ng/ml表皮生長因子(egf)。通過傷口愈合實(shí)驗(yàn)，觀察試驗(yàn)物質(zhì)是否促進(jìn)細(xì)胞增生(proliferation)和細(xì)胞遷移(migration)，從而進(jìn)行對抗老化功能的評價(jià)。作為陽性對照組，使用了300ng/ml表皮生長因子(egf)。用1％濃度的從高山火絨草植物體誘導(dǎo)的植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物進(jìn)行處理后的試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，可確定用高山火絨草植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物和不定根培養(yǎng)提取物處理的皮膚細(xì)胞均表現(xiàn)出貼著底部長出來，從而使愈合面積增加，而且在經(jīng)過高頻處理的情況下，也具有良好的愈合效果(如圖5)。試驗(yàn)例12：關(guān)于確定皮膚屏障保護(hù)機(jī)制的試驗(yàn)通過確定高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物對皮膚屏障的保護(hù)機(jī)制，確認(rèn)是否具有強(qiáng)化或改善皮膚屏障的功能。人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(humanepidermalkeratinocyte)與dmem(dubelcco’smodifiedeagle’smedium)、10％胎牛血清(fatalbovineserum，fbs)、1％抗菌-抗真菌劑(gibco,cat.#15240-062)一起放進(jìn)100mm/60.1cm2的培養(yǎng)皿后，在溫度37℃、5％co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)80％以上的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞融合(confluence)時(shí)，以3×105cells/well的密 度將其放進(jìn)12孔板內(nèi)進(jìn)行48小時(shí)的分株培養(yǎng)，然后用紫外線照射器照射uvb40mj/cm后，在含有不同濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，采用細(xì)胞裂解緩沖液(0.1％十二烷基硫酸鈉(sds)、1％np40、150mmnacl、0.5％脫氧膽酸鈉、50mmtris-cl(ph7.5))使其溶出后，利用bca(bicinchoninicacid)定量法測定出蛋白質(zhì)量。添加20ug相同量的蛋白質(zhì)，用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離后，移動(dòng)到硝酸纖維素膜(nitrocellulosemembrane)上。然后用含有5％脫脂乳的tbst(10mmtrishcl,ph8.0,150mmnacl,0.1％tween20)緩沖液使上述細(xì)胞膜反應(yīng)1小時(shí)后，再與緊密連接蛋白o(hù)ccludin(invitrogen公司,美國)、緊密連接蛋白claudin-1(abcam,usa)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，santacruz，usa)一次抗體進(jìn)行反應(yīng)。作為二次抗體使用了辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔igg抗體(santacruz，usa)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊igg抗體(santacruz,usa)并使其反應(yīng)1小時(shí)。然后，用tbst緩沖液洗滌，通過化學(xué)發(fā)光液檢測試劑盒(eclsolutionkit，amersham,uk)使其顯色后進(jìn)行分析。為了觀察高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物對緊密連接蛋白的量變情況，利用角質(zhì)形成細(xì)胞確認(rèn)蛋白質(zhì)的量變。如下所述，在紫外線照射下，已確定角質(zhì)形成細(xì)胞的緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1的蛋白量減少，紫外線照射后，用不同濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物處理上述角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)所減少的occludin和claudin-1的蛋白量在增加，而且即使在經(jīng)過高頻處理的情況下，也看出上述減少的蛋白質(zhì)生成量表現(xiàn)出增加趨勢(圖6)。試驗(yàn)例13：確認(rèn)皮膚屏障功能的試驗(yàn)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(humanepidermalkeratinocyte)與dmem(dubelcco’smodifiedeagle’smedium)、10％胎牛血清(fatalbovineserum，fbs)、1％抗菌-抗真菌劑(gibco，cat.#15240-062)一起放進(jìn)100mm/60.1cm2的培養(yǎng)皿后，在溫度37℃、5％co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)80％以上的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞融合(confluence)時(shí)，以3×105cells/well的密度將其放進(jìn)12孔板內(nèi)進(jìn)行24小時(shí)的分株培養(yǎng)，然后放進(jìn)含不同濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行 24小時(shí)培養(yǎng)。當(dāng)80％以上的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞融合(confluence)時(shí)，以1×104cells/well的密度將其放進(jìn)96孔板內(nèi)進(jìn)行分株后，用含不同濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物處理細(xì)胞。然后，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-timepcr)法確認(rèn)中間絲聚合蛋白(filaggrin)基因的表達(dá)。對于rna分離和cdna合成采用實(shí)時(shí)細(xì)胞一步法緩沖液套裝(qiagencat.#216213)。用fcw(細(xì)胞洗滌緩沖液)洗滌已除去培養(yǎng)基的細(xì)胞后，添加50細(xì)胞處理混合物(在添加有緩沖液fcp的緩沖液fcpw中，加入gdnawipeout緩沖液的混合物)，然后在室溫下進(jìn)行5分鐘繁殖后，移動(dòng)到新的e-管，并在75℃條件下反應(yīng)5分鐘。為了對中間絲聚合蛋白(filaggrin)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，將上述合成的cdna作為模板，按照2xquantitectsybrgreenrt-pcrmastermix手冊，用實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析儀(商品名:rotor-geneq，由qiagen公司制造)進(jìn)行分析。用于試驗(yàn)的中間絲聚合蛋白引物(filaggrinprimer)為由qiagen公司制造的cat.#qt01192646，表達(dá)率通過管家基因(housekeepinggenes，gapdh,cat.#qt01192646)實(shí)現(xiàn)了規(guī)范化。實(shí)時(shí)熒光定量pcr的條件如下。表達(dá)率(fold)＝(試樣處理組的表達(dá)率)/(對照組的表達(dá)率)表11中間絲蛋白(filaggrin)的表達(dá)增加通過高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的正常分化，并促進(jìn)在皮膚上轉(zhuǎn)換成自然保濕因子的、中間絲蛋白(filaggrin)在皮膚內(nèi)的表達(dá)，由此可知具有改善皮膚屏障的功能。即，對高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的中間絲蛋白基因表達(dá)的進(jìn)行檢測，并將其結(jié)果表示在表11中，從表11可知，高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的基因表達(dá)率使基因表達(dá)量顯著增加，而且即使在進(jìn)行高頻處理的情況下，這樣的基因表達(dá)量也表現(xiàn)出增加。試驗(yàn)例14：基于酪氨酸酶(tyrosinase)活性抑制的美白效果的確認(rèn)試驗(yàn)(體外試驗(yàn))為了確認(rèn)高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物是否具有美白效果，進(jìn)行了高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物對黑色素形成起重要作用的、酪氨酸酶活性的影響試驗(yàn)。將磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer)分株成每孔50ul放進(jìn)96孔板內(nèi)，然后往每孔內(nèi)添加不同濃度的高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物試樣10ul。之后，精制水中添加蘑菇酪氨酸酶(mushroomtyrosinase)直至其濃度達(dá)到50ug/ml后，取20ul加入到每孔內(nèi)。之后每孔再添加2.5mm左旋多巴(l-dopa)20l進(jìn)行混合，然后在37℃溫度下使其發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)每隔10分鐘測定475nm處的吸光度，該測定大概進(jìn)行1小時(shí)左右。作為陽性對照組添加了250um曲酸(kojicacid)。表12通過高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物的處理，酪氨酸酶活性表現(xiàn)下降，由此可以確定酪氨酸酶活性的降低導(dǎo)致抑制黑色素形成，因此具有美白功能。即，如表12所示，通過高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物對酪氨酸酶活性的測定結(jié)果可知，高山火絨草植物細(xì)胞和不定根培養(yǎng)提取物確定具有降低酪氨酸酶活性的功能，而且即使在經(jīng)過高頻處理的情況下，仍然具有上述的美白功能。實(shí)施例2皮膚外用劑組合物的制造采用將本發(fā)明的高山火絨草植物、不定根培養(yǎng)提取物作為有效成分含有的化妝品，制造出營養(yǎng)化妝水、面霜、精華素等乳化劑型的化妝品、以及柔膚化妝水等可溶化劑型的化妝品。制造例2-1：化妝水根據(jù)下述處方，通過常用的化妝水制造方法制造出化妝水。表13制造例2-2：精華素根據(jù)下述處方，通過常用的精華素制造方法制造出化妝水。表14制造例2-3：乳液根據(jù)下述處方，通過常用的乳液制造方法制造出乳液。表15原料名稱重量％(w/w)十六十八醇0.8自乳化單硬脂酸1.0蜂蠟0.5硬脂酸0.5液體石蠟7.0角鯊?fù)?.0澳洲堅(jiān)果油3.0異辛酸十六烷基酯2.0二甲基硅氧烷0.3山梨醇酐單硬脂酸酯0.5聚乙二醇單硬脂酸酯1.2甘油4.0丙二醇4.0甜菜堿4.0羧基聚合物0.12三乙醇胺0.15防腐劑0.25香料適量著色剤適量高山火絨草植物、不定根培養(yǎng)提取物5.0精制水達(dá)到100制造例2-4：面霜根據(jù)下述處方，通過常用的面霜制造方法制造出面霜。表16原料名稱重量％(w/w)十六十八醇3.0自乳化單硬脂酸1.5親油性單硬脂酸1.5蜂蠟0.5液體石蠟8.0角鯊?fù)?.0異辛酸十六烷基酯4.0精制荷荷芭油4.0二甲基硅氧烷0.3山梨醇酐單硬脂酸酯1.0聚乙二醇單硬脂酸酯1.2甘油6.0丙二醇4.0甜菜堿4.0黃原膠0.06三乙醇胺0.10防腐劑0.25香料適量著色剤適量高山火絨草植物、不定根培養(yǎng)提取物7.0精制水達(dá)到100制造例2-5：凝膠根據(jù)下述處方，通過常用的凝膠制造方法制造出凝膠。表17原料名稱重量％(w/w)甘油4.0丙二醇4.0乙醇10氫化蓖麻油聚氧乙烯醚0.1羧基聚合物0.30三乙醇胺0.30防腐劑適量香料適量著色剤適量高山火絨草植物、不定根培養(yǎng)提取物1.0精制水達(dá)到100如上所述，對本
發(fā)明內(nèi)容中的特定部分進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)可以理解，上述具體技術(shù)僅僅是優(yōu)選具體實(shí)施方式而已，并不限定本發(fā)明的范圍。由此，本發(fā)明權(quán)利要求和它們的等同物均被定義在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12