本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種全新的丙泊酚聚乙二醇綴合前藥(peg-丙泊酚)的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丙泊酚(propofol),化學(xué)名稱為2,6-二異丙基苯酚，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的短效靜脈全身麻醉藥品，在國內(nèi)外靜脈麻醉藥物市場處于領(lǐng)先和主導(dǎo)地位。在臨床使用上，同其它麻醉藥物相比，丙泊酚顯示了其起效快速、蘇醒快速而完全、藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)可控、適應(yīng)癥廣泛、禁忌癥少、普通病人和高危病人使用安全有效等特點。但因異丙基的位阻影響，丙泊酚水溶性很差，目前國內(nèi)外普遍以丙泊酚配制成水包油乳劑應(yīng)用于臨床，該制劑的保存期較短，并且對細菌和真菌污染敏感進而導(dǎo)致術(shù)后感染。由于該制劑呈濃厚白色，不能通過肉眼觀察小瓶檢測到細菌或真菌感染。而且這種乳劑用于注射麻醉時，容易引起疼痛，較大的油滴會引起栓塞，且會加重丙泊酚引起的低血脂或因污染導(dǎo)致細菌感染及過敏反應(yīng)等。另外，丙泊酚的酚羥基容易發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生降解雜質(zhì)。利用丙泊酚(2，6-二異丙基苯酚)中的羥基，通過化學(xué)反應(yīng)使其成為一系列水溶性的衍生物，既可以提高丙泊酚的穩(wěn)定性，又可以增加水溶性。這類藥物通過注射進入體內(nèi)后，可按設(shè)計要求以一定的水解速度釋放出2，6-二異丙基苯酚，產(chǎn)生麻醉、鎮(zhèn)痛和催眠效應(yīng)，從而克服2，6-二異丙基苯酚水溶性差、穩(wěn)定性差的缺點。因此，長期以來，人們一直試圖對丙泊酚進行前體化改造，以期得到具有良好水溶性和穩(wěn)定性的丙泊酚前體藥物。前藥是指一種經(jīng)體內(nèi)化學(xué)或酶代謝，能釋放出有藥效活性的代謝物或原藥的化合物。前藥的選擇主要集中在載體的選擇上，結(jié)構(gòu)設(shè)計要求前藥必須在一定的時間范圍里能夠順利地將前藥水解或酶解并釋放原有的藥物活性，并且還要求分解開的前藥連接臂和載體本身都必須是無毒無生物活性的物質(zhì)。聚乙二醇(peg)是美國fda批準(zhǔn)的少數(shù)幾個可用于靜脈給藥的合成聚合物之一，peg修飾技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一項新型給藥技術(shù)，主要應(yīng)用于注射給藥系統(tǒng)。它是一種將聚乙二醇活化后鏈接到藥物分子或表面的技術(shù)。聚乙二醇修飾后得到的聚乙二醇-藥物衍生物在體內(nèi)又會緩慢釋放出藥物小分子而產(chǎn)生療效。藥物小分子經(jīng)聚乙二醇修飾后，主要具有以下優(yōu)點：1、增加藥物的水溶性；2、降低藥物毒性；3、延長藥物循環(huán)半衰期，減少用藥次數(shù)，降低醫(yī)療費用；4、提高藥物穩(wěn)定性；5、改變藥物代謝動力學(xué)特性，拓寬適應(yīng)癥。丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液制劑技術(shù)要求很高，乳劑的ph、乳劑輔料來源和質(zhì)量、粒徑分布、游離脂肪酸與過氧化值、有關(guān)物質(zhì)等需要嚴格控制。脂肪乳注射液還存在臟器損傷、注射疼痛、微生物污染、儲存穩(wěn)定性差、包裝要求高、難以國產(chǎn)化等一系列問題，這些問題主要是化合物本身的水溶性差造成的。丙泊酚聚乙二醇綴合物(peg-丙泊酚)成功解決了丙泊酚水溶性差和穩(wěn)定性差的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提高丙泊酚的水溶性、穩(wěn)定性，提供一種新的丙泊酚前藥，即丙泊酚聚乙二醇綴合前藥(peg-丙泊酚)以及peg-丙泊酚的制備方法。它增加了溶解性和穩(wěn)定性，并且在體內(nèi)分解為活性的丙泊酚，發(fā)揮藥效，同時也避免了因丙泊酚溶解性差而導(dǎo)致的注射疼痛以及栓塞等問題。丙泊酚聚乙二醇綴合前藥(peg-丙泊酚)具有如下結(jié)構(gòu)：單臂：雙臂：四臂：上述前藥結(jié)構(gòu)中，單臂、雙臂peg-丙泊酚中n是20～500的整數(shù)，優(yōu)選n是50～200，代表聚乙二醇的聚合度。(aa)w、(aa)v代表相同或不同的氨基酸或氨基酸縮合形成的小分子寡肽，做為連接基團。w、v是0～12的整數(shù)，代表氨基酸數(shù)量，優(yōu)選w、v是1，(aa)優(yōu)選甘氨酸。上述前藥結(jié)構(gòu)中，四臂peg-丙泊酚中a、b、c、d是10～200的整數(shù)，優(yōu)選a、b、c、d是20～120，代表聚乙二醇的聚合度。(aa)w、(aa)v、(aa)x、(aa)y代表相同或不同的氨基酸或氨基酸縮合形成的小分子寡肽，做為連接基團。w、v、x、y是0～12的整數(shù)，代表氨基酸數(shù)量，優(yōu)選w、v、x、y是1。(aa)優(yōu)選甘氨酸。peg-丙泊酚通過一定的技術(shù)手段合成，舉例以下結(jié)構(gòu)：單臂：雙臂：四臂：本發(fā)明舉例peg-丙泊酚結(jié)構(gòu)式，有單臂、雙臂、四臂，如上所示(包括但不限于如上的結(jié)構(gòu))，為便于理解，本發(fā)明主要論述四臂peg-丙泊酚的制備方法及用途。本發(fā)明實施例合成了四臂peg-丙泊酚和四臂peg-甘氨酸丙泊酚。發(fā)明的另一目的在于提供peg-丙泊酚的制備方法及用途。四臂peg-丙泊酚的制備：丙泊酚與聚乙二醇四臂酸直接縮合反應(yīng)成酯。四臂peg-甘氨酸丙泊酚：丙泊酚與甘氨酸反應(yīng)成酯，然后丙泊酚甘氨酸酯再與聚乙二醇四臂酸結(jié)合。具體實施方式以下實施例用來說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明。實施例1(四臂peg-丙泊酚的制備)：將四臂聚乙二醇乙酸(平均分子量20000，分布系數(shù)1.05)20.0g(1.0mmol)，二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)0.1g(0.5mmol)，在室溫下溶于180ml無水二氯甲烷中，攪拌，加入丙泊酚1.07g(6.0mmol)和0.01g(0.1mmol)dmap,常溫反應(yīng)16h，將生成沉淀過濾，將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，添加100ml異丙醇(ipa)重結(jié)晶，過濾，產(chǎn)物真空干燥，得四臂聚乙二醇-丙泊酚酯18.3g。maldi-tof(mn＝20758，pd＝1)；1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ：7.24-7.14(m，12h)，4.49(s，8h)，3.85-3.41(m，1790h),2.92-2.86(m，8h),1.47(s，9h),1.19(d，j＝6.8hz，48h)。實施例2(四臂peg-甘氨酸丙泊酚的制備)：丙泊酚8.9g(0.05mol)和17.4g(0.10mol)n-叔丁氧羰基甘氨酸，溶解在100ml無水二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(dmap)1.2g(0.01mol)，在氮氣保護下滴加二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)10.3g(0.05mol)的二氯甲烷(100ml)溶液,滴畢,氮氣保護反應(yīng)過夜。過濾除去反應(yīng)產(chǎn)生的固體，濾液用水(200ml)洗滌,無水硫酸鈉干燥。濃縮至干,殘留物經(jīng)硅膠柱純化,制得丙泊酚-n-叔丁氧羰基甘氨酸酯16.4g。lc_ms[m+1]+：336；1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ7.23-7.15(m，3h)，5.11(bs，1h)，4.24(d，j＝5.2hz，2h),2.96-2.81(m，2h),1.47(s，9h),1.19(d，j＝6.8hz，12h)。丙泊酚-n-叔丁氧羰基甘氨酸酯(由上步制的)16.4g(49mmol)溶解在150ml二氯甲烷中，添加50ml三氟乙酸，室溫攪拌反應(yīng)過夜。tlc監(jiān)測反應(yīng)完全。減壓濃縮溶液，加入300ml二氯甲烷溶解，再濃縮至干，反復(fù)幾次，除去絕大部分三氟乙酸。加入異丙醚300ml，沉淀，過濾收集沉淀，真空干燥，制得丙泊酚-甘氨酸酯10.6g。lc_ms[m+1]+：236；1hnmr(400mhz，dmso-d6)：δ8.50(s，2h)，7.30-7.22(m，3h)，4.32(s，2h),3.01-2.90(m，2h),1.13(d，j＝6.8hz，12h)。四臂聚乙二醇-乙酸(平均分子量20000,分布系數(shù)1.04)20.0g(1.0mmol)、丙泊酚-甘氨酸酯1.88g(8.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(dmap)0.98g(8.0mmol)、1-羥基苯并三唑(hobt)1.08g(8.0mmol)，溶于200ml二氯甲烷中，在氮氣保護下滴加二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)1.65g(8.0mmol)的二氯甲烷(16ml)溶液,滴畢,氮氣保護反應(yīng)過夜。過濾除去固體物質(zhì)，多余溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，殘余物添加400ml異丙醇(ipa)重結(jié)晶，過濾，產(chǎn)品經(jīng)真空干燥，得到四臂聚乙二醇-甘氨酸-丙泊酚18.4g。maldi-tof(mn＝21120，pd＝1)；1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ7.64(bs,4h)，7.24-7.12(m,12h)，4.44-4.38(m，8h),4.09(s，8h)，3.85-3.38(m，1792h)，2.96-2.88(m，8h),1.19(d，j＝6.8hz，48h)。試驗1：peg-丙泊酚與丙泊酚的溶解度比較試驗根據(jù)2015版《中國藥典》，對實施例進行溶解性的考察：精確稱取樣品(實施例1的產(chǎn)物)和丙泊酚各適量，分別加入純化水后，每隔5min強力振搖30s，并進行觀察，若30min內(nèi)無肉眼可見溶質(zhì)顆粒即視為完全溶解，結(jié)果見表1。表1、peg-丙泊酚與丙泊酚的溶解度比較試驗結(jié)果從上述實驗結(jié)果得出，本發(fā)明的丙泊酚聚乙二醇綴合物水中易溶，相對丙泊酚來說，水溶性明顯增加。試驗2：peg-丙泊酚與丙泊酚耐氧化穩(wěn)定性比較眾所周知，丙泊酚的酚羥基極易被氧化成醌。稱取丙泊酚適量，制成每ml含有50mg丙泊酚的乙醇溶液，另分別稱取實施例中的peg-丙泊酚適量，用乙醇制成每ml約含50mg丙泊酚(peg-丙泊酚的載藥量按3.45％計算)的溶液，在強光下放置30天，觀察溶液顏色變化，結(jié)果見表2。表2、peg-丙泊酚與丙泊酚耐氧化穩(wěn)定性實驗結(jié)果結(jié)論：由試驗可知，丙泊酚經(jīng)peg化后，光穩(wěn)定性明顯增加。試驗3：注射用peg-丙泊酚的穩(wěn)定性試驗將樣品(實施例2的產(chǎn)物)溶于水中，配制成濃度為147mg/ml(相當(dāng)于丙泊酚5mg/ml)的水溶液，加入甘露醇適量，用0.22微米濾膜過濾，濾液分裝于10ml西林瓶中(4ml/支)，冷凍干燥，壓蓋。凍干后的樣品分別在光照、高溫條件下放置10天，加速條件(溫度40℃，濕度75％)放置3月，參照丙泊酚原料的檢測方法，利用高效液相色譜儀檢測是否有游離的丙泊酚，結(jié)果表3。儀器：島津lc-16高效液相色譜儀檢測波長：278nm柱溫：40℃流速：1.0ml/min流動相：流動性a:磷酸二氫鈉溶液(取磷酸二氫鈉一水合物2.76g,加水900ml使溶解，用85％磷酸調(diào)節(jié)ph值至3.0，用水稀釋至1000ml)為流動相a；流動相b；乙腈。時間min流動相a％流動相b％06040226040383070403070411090451090466040表3、注射用peg-丙泊酚穩(wěn)定性試驗結(jié)果實驗條件0天高溫60℃10天光照4500lx10天加速3月游離丙泊酚(％)未檢出0.581.420.87結(jié)論：由以上試驗結(jié)果可知，穩(wěn)定性良好。試驗3：peg-丙泊酚的體外水解試驗精密稱取peg-甘氨酸丙泊酚(實施例2的產(chǎn)物)適量，用水制成每ml約含丙泊酚0.1mg的溶液，用naoh溶液調(diào)ph值9～11，混合均勻，室溫分別于0h、0.5h、1h、1.5h、4h、8h、12h時取溶液適量，hplc法檢測游離丙泊酚的濃度(外標(biāo)法)。結(jié)果見表4。表4、peg-丙泊酚在堿性溶液中的分解速度結(jié)果表明，peg-丙泊酚在水中可以分解為活性物丙泊酚。試驗4：peg-丙泊酚的初步藥效學(xué)試驗(靜脈注射給藥)將雌雄各半的健康大鼠60只，隨機分成兩組(n＝30)，一組注射給藥peg-丙泊酚(實施例2產(chǎn)物)，另一組注射給藥陽性對照藥物得普利麻(diprivantm)。采用序貫法測定peg-丙泊酚和得普利麻(diprivantm)的麻醉的半數(shù)有效量ed50。試驗中經(jīng)大鼠尾靜脈注射給藥，以小鼠前爪翻正反射消失作為判斷麻醉終點的指標(biāo)；小鼠前爪翻正反射恢復(fù)為麻醉恢復(fù)指標(biāo)。結(jié)果表明：本發(fā)明藥物試驗組的ed50為195.4mg/kg,95％可信區(qū)間為188～211mg/kg(相當(dāng)于丙泊酚6.4～7.2mg/ml)，得普利麻(diprivantm)對照組的ed50為5.96mg/kg,95％可信區(qū)間為5.78～7.15mg/kg。在ed50的測定過程中，觀察到本發(fā)明藥物試驗組的翻正反射消失時間為3.23±1.14min，蘇醒時間為110.1±32.2min，其起效時間和恢復(fù)時間均長于得普利麻(diprivantm)對照組(起效時間為10.2±1.2秒，恢復(fù)時間為8.9±4.7min)。試驗結(jié)果表明：本發(fā)明的丙泊酚聚乙二醇綴合物(peg-丙泊酚)具有確切、可逆的麻醉作用，而且半衰期長。當(dāng)前第1頁12