本領(lǐng)域涉及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及mirna在制備促進(jìn)血管新生的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

血管新生是指內(nèi)皮細(xì)胞以出芽方式在原有血管的基礎(chǔ)上，通過增殖、遷移和重塑，從而形成新生血管的過程[1]。血管新生與生長發(fā)育、炎癥、組織損傷修復(fù)、組織缺血、腫瘤生長等多種生理和病理的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2，3]。

血管新生是一個復(fù)雜而有序的過程，主要包括內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、內(nèi)皮細(xì)胞遷移侵襲、內(nèi)皮細(xì)胞出芽、基底膜形成和新生血管成熟等多個步驟[4-6]。在這一過程中，多種細(xì)胞因子、信號通路以及基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的微環(huán)境通過調(diào)控眾多的正性與負(fù)性血管新生調(diào)節(jié)因子的平衡，使血管新生維持在生理范圍[7]。

針對腫瘤生長、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病，抑制血管新生可減緩疾病的發(fā)展。然而，當(dāng)某些原因?qū)е缕鞴倩蚪M織出現(xiàn)缺血，以及組織損傷修復(fù)過程中，通過外源手段促進(jìn)血管新生，改善局部血供情況，可有效改善組織缺血、促進(jìn)組織修復(fù)[8，9]。

mirna是一類高度保守內(nèi)源性非編碼小分子rna，長度為20-24nt。其主要通過完全或部分互補(bǔ)結(jié)合同源mrna3’-utr區(qū)，導(dǎo)致靶mrna的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。目前得到確認(rèn)的mirna超過1000個(sangermirbase)。在生長發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、形態(tài)發(fā)生、組織代謝等多種生理和病理過程，發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10]。對血管新生調(diào)控機(jī)制的研究也表明，mirna可通過調(diào)控血管新生過程中的多個步驟，影響血管的形成[11-14]。

近幾年，研究發(fā)現(xiàn)一種小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)microrna，可以通過調(diào)控這些與內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因的表達(dá)而參與內(nèi)皮細(xì)胞和血管功 能的調(diào)節(jié)。特別是一些血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性和高表達(dá)的microrna，在血管的生理和病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。mir-125是目前報導(dǎo)的與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)的microrna。mir-125家族有兩個成員mir-125a和mir-125b。在球囊損傷內(nèi)皮引起內(nèi)膜增生的血管中，mir-125表達(dá)明顯降低，而在單核巨噬細(xì)胞中，mir-125a能夠?yàn)檠趸兔芏戎鞍状碳にT導(dǎo)表達(dá)增加，并能抑制單核巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取和炎癥因子的分泌，提示mir-125a和mir-125b參與了動脈粥樣硬化疾病的血管炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷及內(nèi)膜增生等血管病理進(jìn)程[15]。

pengche等人2014中報道m(xù)ir-125a-5p通過下調(diào)rtef-1在年老小鼠中導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的損傷[16]。daij等人2015報道m(xù)ir-125a調(diào)節(jié)胃癌中vegf-a的旁分泌，從而抑制腫瘤中的血管新生[17]。

然而，目前尚未有報道m(xù)ir-125a通過促進(jìn)血管新生來治療方面的報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)一些實(shí)施方式，本公開提供mir-125a在制備促進(jìn)血管新生的藥物中的用途。

根據(jù)一些實(shí)施方式，本公開提供mir-125a在制備改善組織缺血或組織損傷的藥物中的用途。尤其是，mir-125a在治療組織缺血性疾病的藥物中的用途。在一些實(shí)施方式中，組織缺血性疾病選自：缺血性心臟病、閉塞性動脈硬化癥、缺血性腦卒中和糖尿病足。

在一些實(shí)施方式中，mir-125a對疾病的治療是指促進(jìn)缺血性組織或損傷組織中的血管新生。

在一些具體實(shí)施方式中，所述的治療或改善是指改善選自以下的至少一項(xiàng)：內(nèi)皮細(xì)胞的尖端細(xì)胞數(shù)目增加、管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分支數(shù)目增加、管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的長度增加、新生血管的數(shù)目增加。

在本說明書中，血管包括動脈、靜脈和微血管(也作毛細(xì)血管)。

在一些實(shí)施方式中，mir-125a是mirna的成熟形式，其選自mir-125a-5p和mir-125a-3p；更優(yōu)選地，mir-125a是mir-125a-5p。

在一些具體實(shí)施方式中，mir-125a的核苷酸序列如seqidno.1 所示。seqidno.1為ucccugagacccuuuaaccuguga，其登錄號為mirbaseaccessionnumbermimat0000443，見網(wǎng)頁：http://www.mirbase.org/cgi-bin/mature.pl？mature_acc＝mimat0000443。

在一些實(shí)施方式中，mir-125a制備成基因藥物的形式。技術(shù)人員知曉，任何現(xiàn)有的以及將來的適用于將核酸分子導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因藥物形式都能夠用來實(shí)施本申請。在一些具體的實(shí)施方式中，基因藥物是轉(zhuǎn)染型的基因藥物，因此這樣的藥物包含轉(zhuǎn)染試劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)染試劑是脂質(zhì)體，包括但不限于lipofectamine2000。

在一些具體實(shí)施方式中，mir-125a的轉(zhuǎn)染濃度為50nmol/l至200nmol/l范圍；優(yōu)選100nmol/l。

附圖說明

圖1a：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cd31染色。標(biāo)尺代表50μm。

圖1b：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞hoechst染色。標(biāo)尺代表50μm。

圖1c：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cd31染色與hoechst染色疊加。標(biāo)尺代表50μm。

圖2：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺代表200μm。

圖3a：轉(zhuǎn)染mir-125a和nc后，ang1和flk1的表達(dá)水平。□：nc；■：mir-125a。

圖3b：轉(zhuǎn)染mir-125a和nc后，vash1和tsp1的表達(dá)水平?！酰簄c；■：mir-125a。

圖4a：轉(zhuǎn)染nc對照后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖4b：轉(zhuǎn)染mir-125a后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖5a、5b和5c：轉(zhuǎn)染有nc對照的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。5a：cd34染色，5b：hoechst染色，5c：cd34與hoechst疊加。標(biāo)尺代表50μm。

圖5d、5e和5f：轉(zhuǎn)染有mir-125a的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。5d：cd34染色，5e：hoechst染色，5f：cd34與hoechst疊加標(biāo)尺代表50μm。

具體實(shí)施方式

以下提供了本公開實(shí)施方式中所使用的具體材料及其來源。但是， 應(yīng)當(dāng)理解的是，這些僅僅是示例性的，并不意圖限制本發(fā)明，與如下組織、細(xì)胞、試劑和儀器的類型、型號、品質(zhì)、性質(zhì)或功能相同或相似的材料均可以用于實(shí)施本發(fā)明。

實(shí)施例1：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

無菌條件下取長度為15cm至20cm新生兒臍帶(經(jīng)知情同意)，立即于超凈工作臺內(nèi)減去臍帶兩段的止血鉗夾痕并修齊斷面，找到管壁較薄，官腔較大的臍靜脈。

用注射器輕輕插入靜脈腔內(nèi)，用鑷子固定，pbs反復(fù)清洗靜脈腔至流出的液體物色透明。

用注射器將0.1％的膠原酶p注入靜脈腔內(nèi)，直至臍靜脈充盈飽滿，兩端用止血鉗夾緊，37℃消化12分鐘。

去下止血鉗，用含有10％fbs的dmem/f12沖洗臍靜脈。

收集培養(yǎng)基于離心管內(nèi)，300g離心5分鐘，棄上清，加入m200培養(yǎng)基(購自gibco；m-200-500)，將細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，至于37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

24小時后換新鮮m200培養(yǎng)基，之后每隔3至4天換新鮮m200培養(yǎng)基，直至細(xì)胞生長至80％融合狀態(tài)。

實(shí)施例2：內(nèi)皮細(xì)胞表型及功能鑒定

1.免疫熒光鑒定：

當(dāng)實(shí)施例1中的細(xì)胞生長至80％融合狀態(tài)時，用pbs洗滌細(xì)胞3次。采用預(yù)冷的4％多聚甲醛將細(xì)胞固定10min，pbs蕩洗3次，每次5min。10％羊血清室溫(22至28℃)封閉30min，加入cd31抗體(稀釋度1∶100，購自：bd)，對照組以pbs代替cd31抗體，置于室溫孵育2小時。pbs洗滌4次，每次5min。加入fitc標(biāo)記的羊抗兔igg二抗(稀釋度1∶100)，37℃避光孵育30min。pbs洗滌4次，每次10min。熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

2.matrigel體外成管實(shí)驗(yàn)：將matrigel膠(購自bd)按每孔200μl加至預(yù)冷的24孔板中，不要有氣泡；將24孔板37℃孵育15分鐘，每孔細(xì)胞數(shù)約1×10⁵個，37℃孵育8至10h，于倒置顯微鏡觀察并拍照。

實(shí)施例3：mirna的轉(zhuǎn)染

1.試劑：

(1)轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000(invitrogen)；

(2)待轉(zhuǎn)染的mirna：

mir-125a粉末為美國lifetechnologies公司合成；

采用公知技術(shù)合成與mir-125a長度相似的無關(guān)序列(seqidno.2：uucuucgaacgugucacgutt)作為nc對照。

2.待轉(zhuǎn)染的mirna儲備液配置：

將裝有待轉(zhuǎn)染的mirna的管低速離心5min，按照lipofectamine2000(invitrogen)說明書加入opti-mem溶解mirna，震蕩并瞬時離心配成20μm的儲備液。

3.細(xì)胞準(zhǔn)備：

取實(shí)施例1中第3代對數(shù)生長期且70％-80％匯合的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

4.轉(zhuǎn)染過程：

用opti-mem分別稀釋待轉(zhuǎn)染的mirna和lipofectamine2000，輕輕混勻后室溫放置5min；

將lipofectamine2000稀釋液緩慢逐滴加入待轉(zhuǎn)染的mirna稀釋液中，輕輕混勻獲得mirna和lipofectamine2000混合液，室溫孵育20min；

從培養(yǎng)箱取出待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，用dpbs液(杜氏磷酸緩沖液)洗3遍，吸凈洗液后每孔加入1.5mlopti-mem；

將孵育好的mirna-lipofectamine2000混合液緩慢逐滴入含有待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染量：mirna終濃度為100nmol/l，輕搖混勻后放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

轉(zhuǎn)染6h后，去除轉(zhuǎn)染工作液，用dpbs洗3遍；

更換m200培養(yǎng)基；24h后，去除培養(yǎng)基，用dpbs洗3遍，隨后可更進(jìn)行血管新生檢測。

實(shí)施例4：mir-125a促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管新生

分別取實(shí)施例1第3代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(未經(jīng)轉(zhuǎn)染)、實(shí)施例3所獲得的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染有mir-125a、或轉(zhuǎn)染有nc對照)以2×10⁴細(xì)胞/cm²的密度接種于t25培養(yǎng)瓶，貼壁培養(yǎng)48小時后，觀察細(xì)胞達(dá)70％-80％匯合后，收集細(xì)胞。

1.實(shí)時熒光定量pcr檢測血管新生相關(guān)基因

按照takara公司m-mlv產(chǎn)品說明書推薦的條件：合成cdna，在無菌無酶0.2mlep管中加入：2μg總rna、2μloligo(dt)18(500μg/ml)、3μldntp(10mmol/l)、1μlrna酶抑制劑(40u/μl)、1μlm-mlv、6μl5×m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(含dtt)，depc水補(bǔ)至30μl；

混勻后，42℃反轉(zhuǎn)錄60min，75℃滅活10min，-20℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

按照takara公司sybrpremixextaqtm試劑盒說明書，在0.1ml快速光學(xué)96孔反應(yīng)板內(nèi)加入：10μl2×sybrgreenimastermix、1μlcdna模板、0.8μl上游引物f、0.8μl下游引物r(引物序列見表1)、0.4μlrox校正染料，depc水補(bǔ)至20μl；

混勻后，貼上相應(yīng)的光學(xué)反應(yīng)膜，在steponeplustm實(shí)時定量pcr儀上運(yùn)行real-timepcr反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火，延伸30sec，循環(huán)40次。

實(shí)驗(yàn)中使用的引物，均跨越內(nèi)含子，并經(jīng)blast驗(yàn)證其特異性，引物序列見下表1，根據(jù)溶解曲線分析結(jié)果證實(shí)產(chǎn)物的特異性，每對引物的反應(yīng)均包括一個無模板的對照。

表1.rt-pcr引物

2.檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成能力

將matrigel膠按每孔200μl加至預(yù)冷的24孔板，不要有氣泡；將24孔板37℃孵育15分鐘，每孔細(xì)胞數(shù)約1×10⁵個，37℃孵育8至10小時，于倒置顯微鏡觀察并拍照。

3.結(jié)果：

3.1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(未經(jīng)轉(zhuǎn)染)cd31染色為陽性(圖1a)，體外可以形成管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2)。該結(jié)果表明，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在體外三維結(jié)構(gòu)中可以形成新生血管。

3.2.mir-125a促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管新生

(1)圖3a和3b為qrt-pcr檢測血管新生相關(guān)基因(圖3a為促進(jìn)血管新生相關(guān)基因、圖3b為抑制血管新生相關(guān)基因)。

具體而言，從圖3a中可見，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-125a后，促進(jìn)血管新生相關(guān)基因ang1及flk1表達(dá)升高。圖3b顯示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-125a后，抑制血管新生相關(guān)基因vash1及tsp1表達(dá)降低。這種差異表明mir-125a與nc相比，可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。

(2)圖4a和4b為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-125a后血管新生能力結(jié)果(圖4a為nc對照組、圖4b為mir-125a組)。具體而言，從圖4a和圖4b中可見，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-125a后，形成的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量和長度明顯增加。這種結(jié)果再次證明mir-125a與nc相比，可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。

(3)mir-125a轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞中尖端細(xì)胞的比例明顯增多(圖5a至圖5f)。這一結(jié)果表明mir-125a與nc相比，可以促進(jìn)尖端細(xì)胞形成，進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。

綜上結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染mir-125a后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力增加。

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