本發(fā)明涉及一種無機納米材料用于腫瘤治療，特別涉及一種SWCNT及其衍生物在破壞腫瘤微環(huán)境、抑制TGFβ信號通路、抑制腫瘤干細胞、降低腫瘤血管密度與腫瘤細胞增殖能力、增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性以及腫瘤治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤組織內(nèi)一群具有干細胞樣特征的腫瘤細胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及惡性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。CSC對化療藥物具有高度的耐受性，能夠躲避化療藥物的殺傷。目前，臨床上常規(guī)的腫瘤治療方法化療，只能清除普通的腫瘤細胞，卻不能有效殺傷腫瘤中的CSC，這是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗的關(guān)鍵原因。因此，迫切需要設(shè)計新的治療策略來特異性靶向并清除CSC，進而達到最終理想的治療效果。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，納米材料獨特的理化性質(zhì)使其具有更好的生物相容性、溶解性、靶向性、穿過血腦屏障和細胞膜的能力、更強的可塑性以及光熱性能等，在靶向與殺傷CSC中具有很好的應(yīng)用前景。

現(xiàn)今，納米材料常被用于藥物載體來靶向治療CSC，比如靶向CSC標志物(CD44、CD90、CD133等)或者靶向與CSC性能相關(guān)的信號通路(TGFβ、Wnt/β-catenin、Notch等)來抑制CSC的自我更新和多向分化。然而，在腫瘤的發(fā)展過程中，CSC群體數(shù)量并不是一成不變的，在特定腫瘤微環(huán)境的影響下，普通的腫瘤細胞能逐漸獲得干性去分化成CSC，進而加速腫瘤的惡性進展，使更多的腫瘤細胞獲得化療耐受性，從而逃脫傳統(tǒng)化療對其的殺傷。因此，破壞腫瘤細胞的微環(huán)境、抑制普通腫瘤細胞獲得干性可能成為更有效的治療腫瘤的方法。目前，國內(nèi)外已有實驗室開展相關(guān)研究，比如Gd@C82(OH)22納米材料能抑制上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換(EMT)，從而抑制乳腺上皮癌細胞獲得CSC特征，有效減少CSC數(shù)量并抑制腫瘤生長。

研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中TGFβ1表達水平異常高，TGFβ1信號通路對腫瘤微環(huán)境的形成和腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。已有大量研究表明，TGFβ1是一種強有力的EMT誘發(fā)劑，能夠促使上皮來源的腫瘤細胞獲得CSC特性，并與腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。骨肉瘤來源于間充質(zhì)干細胞或骨祖細胞，是一種惡性程度很高的原發(fā)性骨腫瘤。在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞不斷侵犯周圍的骨基質(zhì)，同時將骨基質(zhì)中大量的TGFβ1釋放出來，逐步形成骨肉瘤的微環(huán)境。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1也能誘導(dǎo)骨肉瘤細胞去分化、使普通的骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)變成骨肉瘤干細胞，即CSC細胞，從而加速骨肉瘤的惡性進展。骨肉瘤患者極易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后的患者預(yù)后極差且存活率低。目前，臨床上尚沒有靶向藥物抑制骨肉瘤的惡性進展。因此，TGFβ1可作為治療靶點用于骨肉瘤微環(huán)境的調(diào)控和骨肉瘤干細胞的靶向治療。

單壁碳納米管(SWCNT)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景，比如疾病的診斷與治療、生物傳感器等。在腫瘤治療中，SWCNT被廣泛用作藥物載體，用于靶向和藥物輸送，然而其本身對癌細胞的影響以及在癌癥發(fā)展中的作用還不是很清楚。在本發(fā)明中，我們以骨肉瘤為例說明SWCNT及其衍生物能在體外特異性抑制普通腫瘤細胞去分化形成CSC，減少腫瘤組織中CSC的數(shù)量和腫瘤微血管密度，進而抑制腫瘤的生長。同時SWCNT及其衍生物能顯著抑制TGFβ1信號通路，進而破壞腫瘤微環(huán)境，從而達到抑制CSC的形成和治療腫瘤的目的。目前，國內(nèi)外還沒有其他關(guān)于SWCNT及其衍生物本身能特異性靶向抑制CSC和TGFβ1信號通路的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種碳納米材料SWCNT及其衍生物用于抑制腫瘤干細胞及制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所要解決的技術(shù)問題是合成穩(wěn)定的水相懸浮的碳納米材料SWCNT及其衍生物。與傳統(tǒng)的癌癥治療藥物相比，該材料能抑制CSC的形成，降低腫瘤組織中CSC的數(shù)量、腫瘤血管密度和腫瘤細胞增殖能力等，抑制TGFβ信號通路，破壞腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤生長。該納米材料可用作CSC抑制劑用于腫瘤的治療，提高腫瘤的治療效果。

本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

本發(fā)明提供一種SWCNT及其衍生物在特異性抑制腫瘤干細胞(CSC)方面的應(yīng)用。

另外，本發(fā)明還提供一種SWCNT及其衍生物在抑制TGFβ信號通路及破壞腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種SWCNT及其衍生物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明實施例的應(yīng)用，所述衍生物包含SWCNT-Raw與SWCNT-COOH。

本發(fā)明實施例的應(yīng)用，所述SWCNT-Raw及SWCNT-COOH的合成方法為：

1)將SWCNT-Raw和SWCNT-COOH分別溶于超純水中，用探頭式超聲儀超聲至材料充分分散，然后視情況加入終濃度為1-6M的鹽酸；

2)在超聲清洗儀中繼續(xù)超聲至材料充分分散，通過離心分離出溶液中的納米材料沉淀，然后用超純水多次清洗沉淀，最后用少量超純水重懸，利用超聲清洗儀超聲法將其分散于水中，最終獲得穩(wěn)定懸浮于水中的納米材料，且濃度約為100-150μg/mL。

本發(fā)明實施例的應(yīng)用，包括：

1)抑制CSC形成的方法，發(fā)現(xiàn)SWCNT及其衍生物能顯著抑制CSC的形成；

2)SWCNT及其衍生物能顯著提高腫瘤微環(huán)境內(nèi)腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，促進化療藥物對其的殺傷；

3)SWCNT及其衍生物能顯著降低腫瘤組織內(nèi)的CSC數(shù)量、腫瘤微血管密度和腫瘤細胞的增殖能力等，并抑制腫瘤的生長；

4)SWCNT及其衍生物能顯著抑制TGFβ信號通路及下游相關(guān)的基因的表達，進而破壞CSC賴以存在的腫瘤微環(huán)境。

借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1)本發(fā)明中所用的碳納米材料制備條件和步驟簡單，易于操作，具有產(chǎn)業(yè)化合成的前景；

2)本發(fā)明中所制備的碳納米材料具有較高的生物相容性，且能特異性抑制CSC的形成；

3)本發(fā)明中所制備的碳納米材料能顯著抑制腫瘤組織內(nèi)CSC，降低腫瘤血管密度和腫瘤細胞增殖能力等，抑制腫瘤生長；

4)本發(fā)明中所制備的碳納米材料能有效抑制TGFβ信號通路，破壞腫瘤微環(huán)境，可有望作為特異性靶向抑制CSC和TGFβ信號通路的試劑，用于腫瘤治療。

附圖說明

圖1是水相SWCNT及其衍生物水溶液(A)和TEM表征(B)。

圖2是納米材料對人成纖維細胞(A)和普通腫瘤細胞(B)的CCK8結(jié)果。

圖3是納米材料進入腫瘤細胞生物電鏡圖片，綠色箭頭所指的為細胞內(nèi)的納米材料。

圖4是納米材料抑制腫瘤細胞去分化形成CSC球囊(A)和CSC標志物蛋白表達(B)，降低細胞克隆形成能力(C)和脂肪誘導(dǎo)分化能力(D)，不影響化療藥物對普通腫瘤細胞的殺傷(E)，增加化療藥物對微環(huán)境中藥物耐受性腫瘤細胞的殺傷(F)。

圖5是低氧和酸性條件下納米材料對腫瘤細胞去分化的形成CSC球囊的影響。

圖6是納米材料對其他腫瘤細胞系去分化形成CSC球囊的影響。

圖7是納米材料給藥時間和次數(shù)(A)，對腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞增殖(Ki-67表達水平)和腫瘤血管密度(CD31)的影響(B)，以及降低組織內(nèi)CSC能力(D)。

圖8是納米材料對腫瘤細胞中TGFβ信號通路中TGFβ受體TGFβRI和下游smad2磷酸化水平(A)以及下游與CSC性能相關(guān)基因的表達的影響(B)，納米材料對腫瘤組織中TGFβRI和下游smad2磷酸化水平(C)以及下游基因的表達的影響(D)。

具體實施方式

以下通過具體較佳實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用作進一步詳細說明，但本發(fā)明并不僅限于以下的實施例。

本發(fā)明的一種碳納米材料SWCNT及其衍生物包含水相SWCNT-Raw和SWCNT-COOH，MWCNT為對照材料，SWCNT-Raw，SWCNT-COOH以及MWCNT的合成方法為：

1)將5-10mg SWCNT-Raw，SWCNT-COOH和MWCNT分別溶于超純水10-20mL中，用探頭式超聲儀超聲分散后，加入終濃度為1-6M的鹽酸；

2)在超聲清洗儀中繼續(xù)超聲分散后，通過離心分離出溶液中的納米材料沉淀，然后用超純水多次清洗沉淀，最后用超純水重懸，利用超聲清洗儀超聲法將其分散于水中，最終獲得穩(wěn)定懸浮于水中的納米材料，且濃度約為100-150μg/mL。

使用透射電子顯微鏡(TEM)方法表征本發(fā)明中制備的納米顆粒；細胞CCK8實驗檢測材料的生物學相容性；通過細胞自我更新、細胞免疫熒光、脂肪細胞誘導(dǎo)分化、化療藥物敏感性等方法檢測該納米材料抑制腫瘤細胞去分化形成CSC能力；利用小鼠腫瘤模型、腫瘤組織免疫組化、腫瘤組織免疫熒光等方法分析該納米材料抑制腫瘤組織中CSC和對腫瘤的治療效果；通過RT-PCR、Western blot等試驗研究該納米材料對TGFβ1信號通路的抑制作用。

具體檢測結(jié)果分別如下：

1)合成納米材料的TEM表征

合成的懸浮于水中的納米材料的TEM圖片(圖1)表明，分散于水中的SWCNT-Raw與SWCNT-COOH納米顆粒長度為1-3μm，外徑尺寸為1-2nm。

2)生物相容性分析

CCK8實驗結(jié)果表明，0-10μg/mL的SWCNT-Raw及SWCNT-COOH處理的人成纖維細胞和普通腫瘤細胞均保持較高的存活率(圖2)，說明該納米材料具有很好的生物相容性。

3)納米材料進細胞分析

細胞生物電鏡實驗結(jié)果表明，SWCNT-Raw及SWCNT-COOH能進入腫瘤細胞內(nèi)(圖3)。

4)腫瘤細胞去分化形成CSC檢測

利用TGFβ1誘導(dǎo)無血清培養(yǎng)的腫瘤細胞(MNNG/HOS)去分化形成CSC，誘導(dǎo)過程中貼壁細胞會逐漸轉(zhuǎn)變并形成CSC球囊。SWCNT(SWCNT-Raw和SWCNT-COOH)能顯著抑制CSC球囊的形成并抑制CSC標志物的表達，且SWCNT處理的細胞自我更新能力(克隆形成能力)、分化為脂肪細胞的能力以及化療藥物敏感性與普通腫瘤細胞相似(圖4)，表明SWCNT有效抑制了TGFβ1誘導(dǎo)的腫瘤細胞去分化形成CSC過程。

在低氧或者酸性微環(huán)境中，SWCNT仍然能抑制TGFβ1誘導(dǎo)的腫瘤細胞去分化形成CSC過程(圖5)。在其他腫瘤細胞系(Saos-2和MG63)中，SWCNT有同樣的抑制效果(圖6)。對照材料MWCNT則對去分化過程沒有影響。

5)體內(nèi)腫瘤模型實驗檢測

將MNNG/HOS細胞肌肉注射至小鼠腿部，待腫瘤直徑大小在1cm左右，將SWCNT直接注射到腫瘤組織內(nèi)，處理31天后，將腫瘤組織取出并進行相關(guān)檢測。SWCNT能顯著抑制腫瘤的生長，并降低組織內(nèi)腫瘤細胞的增殖、腫瘤微血管密度和CSC群體數(shù)量(圖7)。

6)TGFβ1信號通路分析

體外細胞培養(yǎng)和TGFβ1誘導(dǎo)CSC實驗結(jié)果顯示，SWCNT能顯著抑制TGFβ1信號通路過程和下游基因的表達水平(圖8)。體內(nèi)腫瘤模型實驗結(jié)果說明SWCNT能抑制腫瘤組織中TGFβ1信號通路過程和下游基因的表達水平(圖8)。

實施例1

將SWCNT-Raw，SWCNT-COOH和MWCNT 5-10mg分別溶于超純水中，用探頭式超聲儀超聲分散后，加入終濃度為1-6M的鹽酸。在超聲清洗儀中繼續(xù)超聲分散后，通過離心分離出溶液中的納米材料沉淀，然后用超純水多次清洗沉淀，最后用少量超純水重懸，利用超聲清洗儀超聲法將其分散于水中，最終獲得穩(wěn)定懸浮于水中的納米材料，且濃度約為100-150μg/mL。

將骨肉瘤細胞MNNG/HOS培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，當細胞處于對數(shù)生長期時，分別加入5-10μg/mL SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT孵育24小時，收集細胞并將細胞置于2％戊二醛中放置過夜。隨后，細胞經(jīng)1％的四氧化三鋨后固定1小時，梯度酒精脫水后制備超薄電鏡切片。超薄切片經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，置于透射電鏡下觀察。如圖3所示，SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT均可在MNNG/HOS細胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)(綠色箭頭所示)，這說明三種納米材料都可以很好的被腫瘤細胞所吸收。

實施例2

根據(jù)已有的研究報道，普通的骨肉瘤細胞能在TGFβ1的作用下發(fā)生去分化，形成CSC。我們以骨肉瘤細胞MNNG/HOS為例，說明SWCNT及其衍生物對骨肉瘤細胞去分化及CSC形成的抑制作用。將MNNG/HOS培養(yǎng)在含有4ng/mLTGFβ1的無血清培養(yǎng)基中，同時分別添加不同濃度的SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT進行處理。如圖4A所示，5天后，SWCNT-Raw和SWCNT-COOH能夠顯著抑制球囊樣CSC的形成，并且這種抑制作用隨著SWCNT納米材料濃度的升高而增強。而作為對照材料的MWCNT則沒能顯示出對骨肉瘤細胞去分化以及CSC形成的抑制作用。如圖4B所示，與對照組(Control)相比，SWCNT-COOH能夠顯著抑制MNNG/HOS細胞表達骨肉瘤CSC的標志基因c-Kit、stro-1、TRA-1-60、SSEA1和SSEA4。如圖4C所示，TGFβ1處理后MNNG/HOS細胞的克隆形成能力顯著強于處理前的普通MNNG/HOS細胞(Adherent)，但是加入SWCNT-COOH后，TGFβ1對MNNG/HOS細胞克隆形成能力的提升作用被顯著抑制。同時，也顯著抑制了TGFβ1處理后的MNNG/HOS細胞分化成脂肪細胞的能力(圖4D)。這些結(jié)果說明，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH能夠有效抑制TGFβ1作用的MNNG/HOS細胞獲得CSC特性，比如CSC表面標志基因的表達、自我更新能力以及多向分化能力。

將SWCNT-Raw、SWCNT-COOH或者相同體積的超純水(對照)分別與不同劑量的化療藥物阿霉素(adriamycin)共同處理貼壁培養(yǎng)的MNNG/HOS細胞24小時后，利用CCK8試劑分析活細胞的數(shù)量。結(jié)果如圖4E所示，SWCNT及其衍生材料并不影響普通MNNG/HOS細胞對化療藥物的敏感性。隨后，將SWCNT-Raw與TGFβ1、SWCNT-COOH與TGFβ1、TGFβ1或者相同體積的超純水(對照)處理無血清培養(yǎng)的MNNG/HOS細胞，5d后TGFβ1能促使細胞去分化形成CSC，同時在各組加入不同劑量的化療藥物。處理24小時后，利用CCK8試劑分析活細胞的數(shù)量。結(jié)果如圖4F所示，與對照組(Control)相比，TGFβ1使MNNG/HOS細胞去分化形成CSC后，大大提升了細胞對化療藥物阿霉素的耐受性，而SWCNT及其衍生物顯著降低了TGFβ1誘導(dǎo)的MNNG/HOS細胞的化療耐受性。這些結(jié)果說明，SWCNT及其衍生材料能夠破壞骨肉瘤細胞的微環(huán)境，從而提升腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，增強治療效果。

實施例3

將MNNG/HOS細胞培養(yǎng)在含有TGFβ1的pH 6.4無血清培養(yǎng)基中模擬腫瘤內(nèi)酸性的微環(huán)境；將MNNG/HOS細胞培養(yǎng)在含有TGFβ1的PH7.4無血清培養(yǎng)基中的同時培養(yǎng)在3％O₂的低氧培養(yǎng)箱中，模擬腫瘤內(nèi)低氧的微環(huán)境；在培養(yǎng)基中分別加入SWCNT-Raw、SWCNT-COOH進行處理，對照組(Control)中加入相同體積的超純水。3天或5天后，如圖5所示，與對照組(Control)相比，SWCNT及其衍生物在酸性和低氧兩種條件下均能夠顯著抑制MNNG/HOS細胞去分化形成球囊狀CSC。這說明，SWCNT的對腫瘤細胞去分化和腫瘤干細胞的形成的抑制作用不僅僅限于正常條件下，也適用于腫瘤內(nèi)酸性和低氧的極端微環(huán)境。

實施例4

將骨肉瘤細胞株Saos-2、MG-63分別培養(yǎng)在含有TGFβ1的無血清培養(yǎng)基中，同時在實驗組中分別添加SWCNT-Raw、SWCNT-COOH進行處理，對照組(Control)中加入相同體積的超純水。5天后，如圖6所示，與對照組(Control)相比，SWCNT及其衍生物在能夠顯著抑制Saos-2與MG-63細胞去分化形成球囊狀CSC。這說明，SWCNT及其衍生材料能夠抑制多種骨肉瘤細胞去分化，對骨肉瘤細胞去分化形成CSC的抑制作用具有普遍適用性。

實施例5

將4×10⁶MNNG/HOS細胞接種在4～5周大小的BALB/c裸鼠腿部肌肉中，使其成瘤。待腫瘤最大直徑達1.0cm左右時，按照圖7A所示的時間軸，將6μg SWCNT-COOH、MWCNT與超純水(Control)分別直接注射至腫瘤內(nèi)。每隔一天對小鼠進行稱重，并測量小鼠腫瘤的體積。結(jié)果如圖7B所示，SWCNT-COOH組小鼠腫瘤的體積增長明顯小于MWCNT組和超純水對照組(圖8C)，而MWCNT組與對照組無顯著性差異。這說明SWCNT-COOH能夠特異性抑制小鼠體內(nèi)骨肉瘤的生長。

隨后，我們對小鼠腫瘤組織進行HE染色和免疫組化分析，結(jié)果如圖7C所示，SWCNT-COOH處理組腫瘤組織內(nèi)壞死區(qū)周圍CD31⁺血管(綠色箭頭)密度顯著低于MWCNT組和超純水對照組，同時顯著降低了細胞增殖標志基因Ki67的表達。更為重要的是，SWCNT-COOH處理組腫瘤組織內(nèi)壞死區(qū)周圍CSC表面標志基因c-Kit、stro-1、TRA-1-60、SSEA1和SSEA4的表達顯著降低(圖7D)，這說明SWCNT-COOH顯著降低了腫瘤組織干細胞池內(nèi)CSC的數(shù)量。

實施例6

為了進一步闡明SWCNT及其衍生物對骨肉瘤微環(huán)境中TGFβ1信號通路的影響，我們將MNNG/HOS細胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，并進行以下處理：

1)添加相同體積超純水，2)添加TGFβ1和相同體積超純水，3)添加TGFβ1和SWCNT-COOH，4)添加TGFβ1和SWCNT-Raw，5)添加TGFβ1和MWCNT，24小時后，收集細胞采用western blot的實驗方法檢測TGFβ1受體TGFβR1以及下游效應(yīng)分子Smad2的磷酸化活性。

如圖8A所示，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH顯著降低了TGFβR1和Smad2的磷酸化活性。此外，我們進一步分析了TGFβ1信號通路下游與細胞轉(zhuǎn)化和干細胞特性密切相關(guān)的基因Hey1、Snail1和Sanil2的表達。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖8B)，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH顯著降低了MNNG/HOS細胞中TGFβ1誘導(dǎo)的Hey1、Snail1和Sanil2的表達。隨后，我們進一步分析了SWCNT在體內(nèi)對TGFβ1信號通路活性的影響。將SWCNT-COOH、MWCNT以及超純水處理后的小鼠腫瘤組織進行Western blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，SWCNT-COOH顯著降低了腫瘤組織中TGFβR1和Smad2的磷酸化活性(圖8C)，且TGFβ1信號通路下游與細胞轉(zhuǎn)化和干細胞特性密切相關(guān)的基因Hey1、Snail1和Sanil2的表達也顯著降低(圖8D)。而對照材料MWCNT則不會影響TGFβ1受體及其下游效應(yīng)分子、靶基因的表達。這說明，SWCNT-COOH能特異性地破壞骨肉瘤細胞的微環(huán)境，抑制腫瘤細胞中TGFβ1信號通路的活性。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，故凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾,均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。