1.一種交聯(lián)脫細胞羊膜的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)浸泡:將脫細胞羊膜浸泡于25-35ml MES緩沖液中55-65min;
(2)交聯(lián)反應(yīng):向浸泡后的羊膜所在的緩沖液中加入水溶性碳二亞胺,并使碳二亞胺的濃度為0.01-0.1mmol/mg,置于37±0.5℃的恒溫搖床上,轉(zhuǎn)速28-32rpm,交聯(lián)反應(yīng)1-10min;
(3)蒸餾水清洗,真空冷凍干燥,即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)脫細胞羊膜的制備方法,其特征在于,在步驟(1)中,所述脫細胞羊膜由以下步驟制備而成:
在無菌條件下,從胎盤的內(nèi)層剝下羊膜,放置到無菌生理鹽水中,反復沖洗去除羊膜表面的臟污,并去除所述羊膜的絨毛膜,用pH為7.2-7.4的PBS溶液反復漂洗;
將漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min,再在pH為7.2-7.4的PBS溶液浸泡8-12min,此過程重復多次;
用pH為7.2-7.4的PBS溶液重新沖洗后,置于含DMEM:甘油體積比為1:0.5-2的溶液中,-80℃條件下儲存6-8個月;
取無感染的儲存所得羊膜,4℃條件下,置于在質(zhì)量百分比為0.1%-0.5%的trypsin-EDTA水溶液中孵育過夜;
再用含有血清的DMEM培養(yǎng)基對其進行終止消化,用pH為7.2-7.4的PBS溶液沖洗多次,備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的交聯(lián)脫細胞羊膜的制備方法,其特征在于,在步驟(1)中,所述脫細胞羊膜的制備過程,還包括復蘇的步驟:
將無感染的儲存6-8個月的所述羊膜預先依次置于-80±5℃和37±2℃環(huán)境中反復凍融2-4次后,備用。
4.由權(quán)利要求1、2或3所述的交聯(lián)脫細胞羊膜的制備方法制備而成的交聯(lián)脫細胞羊膜。
5.權(quán)利要求4所述的交聯(lián)脫細胞羊膜在制備具有創(chuàng)面修復功效的復合型皮膚替代物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,所述復合型皮膚替代物的制備過程包括如下步驟:
將權(quán)利要求4所述的交聯(lián)脫細胞羊膜制成片狀,將片狀的所述交聯(lián)脫細胞羊膜的基質(zhì)所在面貼于培養(yǎng)皿的底部,置于培養(yǎng)箱中;
將表皮細胞以1×105的接種量接種于所述交聯(lián)脫細胞羊膜的非基質(zhì)所在面,加入皮膚培養(yǎng)基G進行培養(yǎng);所述培養(yǎng)基G的配方為:450mL DMEM/F12培養(yǎng)基、50mL FBS、0.01-1μmol/L胰島素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mL hEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mL BPE和100-500μg/mL氯化鈣;
每天更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)6-8天,即得所述復合型皮膚替代物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于,所述表皮細胞由尿液細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)而成,其誘導培養(yǎng)的過程如下:
S1,從尿液中提取尿細胞;
S2,將所述尿細胞培養(yǎng)為iPS細胞;
S3,將所述iPS細胞誘導培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細胞;
S4,將所述間充質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng),即得所述表皮細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于,在步驟S1中,所述尿細胞的融合度不小于80%。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于,在步驟S2中,所述iPS細胞的融合度不小于90%。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于,在步驟S3中,所述間充質(zhì)干細胞的融合度不小于90%。