本發(fā)明涉及組織工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：真皮替代物的研究一直是組織工程皮膚的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是復(fù)合型真皮替代物發(fā)展的基礎(chǔ)。真皮替代物作為創(chuàng)面修復(fù)過程中的支架結(jié)構(gòu)，不僅能促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，調(diào)節(jié)基底膜的形成，而且能引導(dǎo)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤增殖，沉積新的膠原和形成新的血管，從而實(shí)現(xiàn)真皮結(jié)構(gòu)重建?，F(xiàn)有的真皮替代物在一定程度上能夠模擬正常真皮的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但是除脫細(xì)胞真皮外，普遍都缺乏基底膜結(jié)構(gòu)成分。即使采用脫細(xì)胞真皮，為了去除表皮細(xì)胞層和真皮中的成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，一般需要很強(qiáng)的細(xì)胞清除劑處理，會對真皮的基底膜成分產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞。人羊膜來源于胎盤的最內(nèi)層，可在分娩時(shí)獲得，主要由三部分結(jié)構(gòu)組成：單層立方狀表皮細(xì)胞，富含細(xì)胞生長因子的厚基底膜，以及成纖維細(xì)胞散在其中的疏松網(wǎng)狀纖維基質(zhì)。羊膜基質(zhì)含有I型膠原、IV型膠原、VII型膠原、彈性蛋白和糖胺聚糖等成分，類似于人體的真皮。羊膜的基底膜主要成分為層粘連蛋白、IV型和VII型膠原，與皮膚和角膜的基底膜成分相似，是人體內(nèi)最厚的基底膜。同時(shí)，羊膜還具有促進(jìn)上皮化、抑制瘢痕增生、抗炎癥、抗血管生成、抗菌和抗病毒等生物特性，且免疫原性極低，因而被廣泛用作外科手術(shù)材料和創(chuàng)面覆蓋物，用于修復(fù)各種組織缺損。在實(shí)際應(yīng)用中，羊膜使用時(shí)既可以保留失活的表皮細(xì)胞，也可以完全去除表皮細(xì)胞。完整羊膜含有大量的細(xì)胞生長因子，有利于細(xì)胞培育過程中干細(xì)胞特性的維持。而脫細(xì)胞羊膜借助于良好的基質(zhì)和基底膜成分，能促進(jìn)培育細(xì)胞的增殖、遷移和分化。部分體細(xì)胞在脫細(xì)胞羊膜上的擴(kuò)增速度要明顯快于完整羊膜。但是，脫細(xì)胞羊膜的機(jī)械強(qiáng)度、生物穩(wěn)定性和可操作性仍然不佳。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種機(jī)械強(qiáng)度高的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜及其制備方法和應(yīng)用。一種交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的制備方法，包括如下步驟：(1)浸泡：將脫細(xì)胞羊膜浸泡于25-35mlMES緩沖液中55-65min；(2)交聯(lián)反應(yīng)：向浸泡后的羊膜所在的緩沖液中加入水溶性碳二亞胺，并使碳二亞胺的濃度為0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速28-32rpm，交聯(lián)反應(yīng)1-10min；(3)蒸餾水清洗，真空冷凍干燥，即得。在其中一個(gè)實(shí)施例中，在步驟(1)中，所述脫細(xì)胞羊膜由以下步驟制備而成：在無菌條件下，從胎盤的內(nèi)層剝下羊膜，放置到無菌生理鹽水中，反復(fù)沖洗去除羊膜表面的臟污，并去除所述羊膜的絨毛膜，用pH為7.2-7.4的PBS溶液反復(fù)漂洗；將漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH為7.2-7.4的PBS溶液浸泡8-12min此過程重復(fù)多次；用pH為7.2-7.4的PBS溶液重新沖洗后，置于含DMEM：甘油體積比為1：0.5-2的溶液中，-80℃條件下儲存6-8個(gè)月；取無感染的儲存所得羊膜，4℃條件下，置于在質(zhì)量百分比為0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育過夜；再用含有血清的DMEM培養(yǎng)基對其進(jìn)行終止消化，用pH為7.2-7.4的PBS沖洗多次，備用。在其中一個(gè)實(shí)施例中，在步驟(1)中，所述脫細(xì)胞羊膜的制備過程，還包括復(fù)蘇的步驟：將無感染的儲存6-8個(gè)月的所述羊膜預(yù)先置于-80±5℃和37±2℃環(huán)境中反復(fù)凍融2-4次后，備用。上述交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的制備方法制備而成的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜。上述交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜在制備具有創(chuàng)面修復(fù)功效的復(fù)合型皮膚替代物中的應(yīng)用。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述復(fù)合型皮膚替代物的制備過程包括如下步驟：將上述交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜制成片狀，將片狀的所述交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的基質(zhì)所在面貼于培養(yǎng)皿的底部，置于培養(yǎng)箱中；將表皮細(xì)胞以1×105的接種量接種于所述交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的非基質(zhì)所在面，加入皮膚培養(yǎng)基G進(jìn)行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)基G的配方為：450mLDMEM/F12培養(yǎng)基、50mLFBS、0.01-1μmol/L胰島素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mLBPE和100-500μg/mL氯化鈣；每天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)6-8天，即得所述復(fù)合型皮膚替代物。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述表皮細(xì)胞由尿液細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)而成，其誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程如下：S1，從尿液中提取尿細(xì)胞；S2，將所述尿細(xì)胞培養(yǎng)為iPS細(xì)胞；S3，將所述iPS細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞；S4，將所述間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，即得所述表皮細(xì)胞。在其中一個(gè)實(shí)施例中，在步驟S1中，所述尿細(xì)胞的融合度不小于80％。在其中一個(gè)實(shí)施例中，在步驟S2中，所述iPS細(xì)胞的融合度不小于90％。在其中一個(gè)實(shí)施例中，在步驟S3中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的融合度不小于90％。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明利用水溶性碳二亞胺對脫細(xì)胞羊膜進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)處理，得到的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜保留了基底膜中的IV型膠原、VII型膠原、彈性蛋白和糖胺聚糖等成分，并保留了細(xì)胞因子的生物活性，同時(shí)機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)、抗酶降解能力提高且可操作性好。本發(fā)明獲得脫細(xì)胞羊膜作為培養(yǎng)基質(zhì)，可以促進(jìn)表皮細(xì)胞在非基質(zhì)所在表面的生長，加快表皮細(xì)胞的體外增殖速度，而且保持了良好的生物組織相容性，可作為皮膚替代物，縮短了皮膚替代物的制備時(shí)間。進(jìn)一步，本發(fā)明將表皮細(xì)胞接種于交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的非基質(zhì)所在表面培養(yǎng)獲得復(fù)合型皮膚替代物，能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合，促進(jìn)皮膚結(jié)構(gòu)重建，減輕創(chuàng)面收縮。本發(fā)明所用的表皮細(xì)胞是從尿細(xì)胞經(jīng)過一系列的誘導(dǎo)、培養(yǎng)獲得的，取材方便，對人體無傷害。附圖說明圖1為未脫細(xì)胞羊膜的基底膜結(jié)構(gòu)的電鏡圖；圖2為脫細(xì)胞羊膜的基底膜結(jié)構(gòu)的電鏡圖；圖3為交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜培養(yǎng)表皮細(xì)胞兩天后的電鏡圖；圖4為脫細(xì)胞羊膜培養(yǎng)的表皮細(xì)胞兩天后的電鏡圖；圖5為由交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜和表皮細(xì)胞制備的復(fù)合型皮膚替代物的產(chǎn)品圖片；圖6為由脫細(xì)胞羊膜和表皮細(xì)胞制備的表皮-真皮替代物的產(chǎn)品圖片；圖7為交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜修復(fù)裸鼠皮膚缺損兩周后的皮膚愈合效果圖；圖8為脫細(xì)胞羊膜修復(fù)裸鼠皮膚缺損兩周后的皮膚愈合效果圖。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。下文中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。一實(shí)施方式的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜，其制備方法包括如下步驟：(1)制備脫細(xì)胞羊膜：取剖腹產(chǎn)孕婦的胎盤，并經(jīng)血清檢測排除感染原。所用胎盤選自醫(yī)療廢棄的胎盤，經(jīng)醫(yī)院同意，并經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理會審查可以用于實(shí)驗(yàn)研究。在無菌條件下，從胎盤的內(nèi)層剝下羊膜，放置到無菌生理鹽水中，反復(fù)沖洗去除羊膜表面的血跡，并去除羊膜的絨毛膜，用pH為7.2-7.4的PBS溶液反復(fù)漂洗。將漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH為7.2-7.4的PBS浸泡8-12min，此過程重復(fù)多次。用pH為7.2-7.4的PBS溶液重新沖洗后，置于含DMEM：甘油體積比為1：0.5-2的溶液中，-80℃條件下儲存6-8個(gè)月以覆蓋感染的窗口期。取無感染的儲存所得羊膜，置于-80±5℃和37±2℃環(huán)境中反復(fù)凍融2-4次后，在4℃條件下，置于在質(zhì)量百分比為0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育過夜。再用含有血清的DMEM培養(yǎng)基對其進(jìn)行終止消化，用pH為7.2-7.4的PBS溶液沖洗多次，備用。(2)制備交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜將上述(1)中所得的脫細(xì)胞羊膜浸泡于25-35mlMES緩沖液中55-65min。向浸泡后的羊膜所在的緩沖液中加入碳二亞胺，并使水溶性碳二亞胺的濃度為0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速為28-32rpm，交聯(lián)反應(yīng)1-10min。蒸餾水清洗，真空冷凍干燥，即得。上述方法制備而成的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜在制備具有創(chuàng)面修復(fù)功效的復(fù)合型皮膚替代物中的應(yīng)用。一實(shí)施方式的復(fù)合型皮膚替代物，其制備方法包括如下步驟：(1)誘導(dǎo)形成表皮細(xì)胞S1，從尿液中提取尿細(xì)胞：收集尿液，添加2mL兩性霉素(青霉素和鏈霉素的混合液，兩者濃度均為為500μg/ml)。如不立刻進(jìn)行后續(xù)操作，則將尿液存儲于4℃冰箱，并于當(dāng)天完成后續(xù)操作。把收集的尿液進(jìn)行離心，去上清液，收集位于離心管底部的混懸液1-5mL。將收集的混懸液全部合并后，加入收集所得液體6-10體積的含有兩性霉素的PBS(兩性霉素與PBS溶液的體積比為5:95)，輕輕混勻，吸去上清，得底部混懸液。對6孔板進(jìn)行預(yù)處理，即將需要用的孔預(yù)先用0.1％明膠包被處理20min以上的，再吸出0.1％的明膠。將獲得的底部混懸液置于6孔板的預(yù)處理后的孔中，并向該孔中加入2mL培養(yǎng)液A和3μLPrimocin(原代細(xì)胞抗生素)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃條件下培養(yǎng)，待尿細(xì)胞貼壁生長后，吸去培養(yǎng)液A，用PBS洗一遍，再更換培養(yǎng)液A繼續(xù)培養(yǎng)。其中，培養(yǎng)液A的配方為：REGM培養(yǎng)基與MEF培養(yǎng)基以1：1的比例混合。當(dāng)尿細(xì)胞融合度達(dá)到80％，則可進(jìn)行后續(xù)傳代培養(yǎng)。S2，將尿細(xì)胞培養(yǎng)為iPS細(xì)胞：將表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28，各1-5μg混合后共同導(dǎo)入尿細(xì)胞中。再將含有表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的尿細(xì)胞置于預(yù)先用matrigel包被的6孔板中，用培養(yǎng)液A培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第2d(天)，將培養(yǎng)基更換為培養(yǎng)液B。以后，每天更換新鮮培養(yǎng)液B使克隆繼續(xù)增殖。其中，培養(yǎng)液B為mTesR1培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后第7d，鏡下觀察形態(tài)，挑取與人胚胎干細(xì)胞相近細(xì)胞，并接種于用matrigel包被的12孔板中，培養(yǎng)液B培養(yǎng)獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。S3，將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞：棄除原有iPS細(xì)胞培養(yǎng)液B，加DMEM/F12培養(yǎng)液清洗一遍，棄除，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g轉(zhuǎn)速下離心5min，收集細(xì)胞沉淀，以1：3的比例置于已被Matrigel包被處理的6孔板中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；待iPS細(xì)胞長至6孔板體積的70％-80％時(shí)，PBS沖洗一遍后，更換間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基C，并每兩天更換一次培養(yǎng)基。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基C的配方為：450mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50mLFBS、1-5mmol/LL-谷酰胺、50-100μg/LbFGF和10-8mol/L地塞米松。培養(yǎng)4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進(jìn)行消化，采用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基D重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種至0.1％明膠預(yù)先包被處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基D的培養(yǎng)液配方為：450mLDMEM/F12培養(yǎng)基、50mLFBS、10-50ng/mLhEGF、1-6ng/mLHGF、1-4ng/mLbFGF、1-10ng/mLPDGF、1-10ng/mLIGF和2-10ng/mLTGF-β。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細(xì)胞并按照1：3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。S4，將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)形成表皮細(xì)胞：棄除上述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液D，加DMEM/F12培養(yǎng)液清洗一遍，棄除清洗液，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g轉(zhuǎn)速下離心5min，收集細(xì)胞沉淀，以1：3的比例進(jìn)行傳代，傳至已被Matrigel包被處理的6孔板中。待間充質(zhì)干細(xì)胞長至6孔板體積的70％-80％時(shí)，pH為7.2-7.4的PBS溶液沖洗一遍后，更換表皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基E，并每兩天更換一次培養(yǎng)基E。其中，表皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基E的培養(yǎng)液配方為：450mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50mLFBS、10-40μg/LKGF、20-80μg/LTGF-β、6-15μg/LPDGF-AB、10-25μg/LVEGF、1-7μg/LIL-2和0.1-0.75μg/ml氫化可的松。培養(yǎng)4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進(jìn)行消化，采用表皮細(xì)胞培養(yǎng)基F重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。其中，表皮細(xì)胞培養(yǎng)基F的配方為：450mLDMEM/F12培養(yǎng)基、50mLFBS、0.1-1ng/mL氫化可的松、1×10-10mol/L霍亂毒素、0.01-0.1ng/mL胰島素、1×10-7mol/L三碘甲狀腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、10-25ng/mLhEGF、5-15μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μMY-27632和0.01-0.5mg/mL羧甲基殼聚糖。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細(xì)胞并按照1：3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。(2)將上述制備的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜制成片狀，將片狀的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的基質(zhì)所在面貼于培養(yǎng)皿的底部，置于培養(yǎng)箱中。(3)將(1)中誘導(dǎo)形成的表皮細(xì)胞以1×105的接種量接種于交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的非基質(zhì)所在面，加入皮膚培養(yǎng)基-培養(yǎng)液G進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液G的配方為：450mLDMEM/F12培養(yǎng)基、50mLFBS、0.01-1μmol/L胰島素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mLBPE和100-500μg/mL氯化鈣。每天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)6-8天，即得。在本實(shí)施方式中表皮細(xì)胞是從尿細(xì)胞經(jīng)過一系列的誘導(dǎo)、培養(yǎng)獲得的，取材方便，對人體無傷害，屬于優(yōu)選的情況。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種脫細(xì)胞羊膜，其制備過程如下：(1)取剖腹產(chǎn)孕婦的胎盤，并經(jīng)血清檢測排除HIV、梅毒、HBV和HCV等感染。(2)在無菌條件下從胎盤的內(nèi)層剝下羊膜，置于無菌生理鹽水中，反復(fù)沖洗，除去羊膜表面的血跡，并用鑷子鈍性去除羊膜的絨毛膜。(3)將羊膜用pH為7.3的PBS溶液反復(fù)漂洗多遍后，用抗生素溶液浸泡5分鐘，PBS溶液浸泡10分鐘，此過程重復(fù)3次。(4)PBS溶液重新沖洗后將羊膜放入含DMEM和甘油的體積比為1：1的溶液中，-80℃條件下儲存6個(gè)月以覆蓋感染的窗口期。(5)檢測無病毒感染的儲存后的羊膜，從-80℃到37℃反復(fù)凍融三次，之后置于0.25％的trypsin-EDTA水溶液中，在4℃條件下，孵育過夜。(6)用含有血清的DMEM對孵育過夜后的羊膜進(jìn)行終止消化，之后用PBS溶液沖洗三次。實(shí)施例2本實(shí)施例提供一種交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜，其制備過程如下：將實(shí)施例1制得的脫細(xì)胞羊膜浸泡于30mLMES緩沖液中1h，之后加入EDC，并使其在MES緩沖液中的濃度為0.05mmol/mg，置于恒溫?fù)u床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速為30rpm，37℃條件下，交聯(lián)反應(yīng)5min，蒸餾水清洗，真空冷凍干燥，即得。實(shí)施例3本實(shí)施例提供一種復(fù)合型皮膚替代物，其制備過程如下：(1)從尿液中提取尿細(xì)胞：收集尿液，添加2mL兩性霉素(青霉素和鏈霉素的混合液，兩者的濃度均為500μg/mL)。把收集的尿液，置于50mL離心管中，在400g轉(zhuǎn)速下，離心10min，去除上清液，收集位于離心管底部的混懸液5mL。將合并后的5mL混懸液中加入30mL含有兩性霉素的PBS(兩性霉素與PBS溶液的體積比為5:95)，輕輕混勻，吸去上清，得底部混懸液。對6孔板進(jìn)行預(yù)處理，即將需要用的孔預(yù)先用0.1％明膠包被處理20min以上的，再吸出0.1％的明膠。將獲得的底部混懸液置于6孔板的預(yù)處理后的孔中，并向該孔中加入2mL培養(yǎng)液A和3μLPrimocin，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃條件下培養(yǎng)，待尿細(xì)胞貼壁生長后，吸去培養(yǎng)液A，用PBS洗一遍，再更換為培養(yǎng)液A繼續(xù)培養(yǎng)。其中，培養(yǎng)液A的配方為：REGM培養(yǎng)基與MEF培養(yǎng)基以1：1的比例混合。當(dāng)尿細(xì)胞融合度達(dá)到80％，進(jìn)行后續(xù)傳代培養(yǎng)。S2，將尿細(xì)胞培養(yǎng)為iPS細(xì)胞：將表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子2μgOCT4、2μgSOX2、2μgNANOG、2μgKLF4和2μgLIN28共同導(dǎo)入步驟S1中得到的尿細(xì)胞中。再將含有表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的尿細(xì)胞置于預(yù)先用matrigel包被的6孔板中，用培養(yǎng)液A培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第2d，將培養(yǎng)基更換為培養(yǎng)液B。以后，每天更換新鮮培養(yǎng)液B使克隆繼續(xù)增殖。其中，培養(yǎng)液B為mTesR1培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后第7d，電鏡下觀察形態(tài)，挑取與人胚胎干細(xì)胞相近細(xì)胞，并接種于用matrigel包被的12孔板中，培養(yǎng)液B培養(yǎng)獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。S3，將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞：棄除原有iPS細(xì)胞培養(yǎng)液B，加DMEM/F12培養(yǎng)液清洗一遍，棄除，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g轉(zhuǎn)速下離心5min，收集細(xì)胞沉淀，以1：3的比例置于已被Matrigel包被處理的6孔板中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；待iPS細(xì)胞長至6孔板體積的75％時(shí)，PBS沖洗一遍后，更換間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基C，并每兩天更換一次培養(yǎng)基。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基C的配方為：450mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50mLFBS、3mmol/LL-谷酰胺、80μg/LbFGF和9mol/L地塞米松。培養(yǎng)4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進(jìn)行消化，采用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基D重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種至0.1％明膠預(yù)先包被處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基D的培養(yǎng)液配方為：450mLDMEM/F12培養(yǎng)基、50mLFBS、35ng/mLhEGF、4ng/mLHGF、2ng/mLbFGF、8ng/mLPDGF、6ng/mLIGF和6ng/mLTGF-β。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細(xì)胞并按照1：3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。S4，將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)形成表皮細(xì)胞：棄除上述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液D，加DMEM/F12培養(yǎng)液清洗一遍，棄除清洗液，加含0.5mMEDTA的DPBS，消化5min后，在400g轉(zhuǎn)速下離心5min，收集細(xì)胞沉淀，以1：3的比例進(jìn)行傳代，傳至已被Matrigel包被處理的6孔板中。待間充質(zhì)干細(xì)胞長至6孔板體積的75％時(shí)，PBS沖洗一遍后，更換表皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基E，并每兩天更換一次培養(yǎng)基E。其中，表皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基E的培養(yǎng)液配方為：450mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、50mLFBS、25μg/LKGF、50μg/LTGF-β、9μg/LPDGF-AB、18μg/LVEGF、4μg/LIL-2和05μg/ml氫化可的松。培養(yǎng)4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進(jìn)行消化，采用表皮細(xì)胞培養(yǎng)基F重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。其中，表皮細(xì)胞培養(yǎng)基F的配方為：450mLDMEM/F12培養(yǎng)基、50mLFBS、0.7ng/mL氫化可的松、1×10-10mol/L霍亂毒素、0.06ng/mL胰島素、1×10-7mol/L三碘甲狀腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、18ng/mLhEGF、10μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、7μg/mL谷氨酸、4μMY-27632和0.3mg/mL羧甲基殼聚糖。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細(xì)胞并按照1：3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。(2)將上述制備的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜制成片狀，將片狀的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的基質(zhì)所在面貼于培養(yǎng)皿的底部，置于培養(yǎng)箱中。將(1)中誘導(dǎo)形成的表皮細(xì)胞以1×105的接種量接種于交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的非基質(zhì)所在面，加入皮膚培養(yǎng)基-培養(yǎng)液G進(jìn)行培養(yǎng)。其中，培養(yǎng)液G的配方為：450mLDMEM/F12培養(yǎng)基、50mLFBS、0.5μmol/L胰島素、0.5mmol/mL甘氨酸、30ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、30μg/mLBPE和300μg/mL氯化鈣。每天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)6-8天，即得。實(shí)施例4本實(shí)施例提供一種由實(shí)施例1制備的脫細(xì)胞羊膜為培養(yǎng)基質(zhì)制備的表皮-真皮替代物。具體制備過程和參數(shù)參見實(shí)施例3。實(shí)施例5檢測及結(jié)果分析(一)電鏡測試及結(jié)果分析(1)脫細(xì)胞羊膜與未脫細(xì)胞羊膜的電鏡觀察將實(shí)施例1制備獲得的脫細(xì)胞羊膜與未脫細(xì)胞羊膜在電鏡下觀察基底膜并拍照，結(jié)果見圖1和圖2。通常，完整羊膜上皮細(xì)胞的基底面通過大量的半橋粒結(jié)構(gòu)緊密連接在基底膜表面。由圖1可以看出，冷凍保存的未脫細(xì)胞處理的羊膜后，雖然上皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)有所損傷，但羊膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性并未受影響，間質(zhì)網(wǎng)狀膠原纖維致密，排列整齊。由圖2可以看出，脫細(xì)胞羊膜在完全去除上皮細(xì)胞的同時(shí)，基本保留了基底膜的完整結(jié)構(gòu)，基質(zhì)也未受影響。(2)表皮細(xì)胞在交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜和脫細(xì)胞羊膜上的生長狀況及皮膚替代物的觀察在電鏡下觀察實(shí)施3和實(shí)施例4的表皮細(xì)胞培養(yǎng)2d后的生長狀況，見圖3和圖4。由圖3和圖4可知，表皮細(xì)胞在交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜上比脫細(xì)胞羊膜上的生長狀態(tài)好，且增殖速度較快。在電鏡下觀察實(shí)施3和實(shí)施例4表皮細(xì)胞培養(yǎng)4d后皮膚替代物的結(jié)構(gòu)，見圖5和圖6。由圖5可以看出，由交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜制備的復(fù)合型皮膚替代物的表面光滑平整，具有一定的硬度，能平鋪培養(yǎng)皿表面。而圖6可以看出，脫細(xì)胞羊膜聯(lián)羊膜制備的皮膚替代物極其柔軟，在培養(yǎng)皿中平鋪后容易卷曲。(二)機(jī)械強(qiáng)度測試對實(shí)施例1制備獲得的脫細(xì)胞羊膜和實(shí)施例2制備獲得的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜進(jìn)行機(jī)械性能的檢測，其檢測過程如下：將實(shí)施例1的制備獲得的脫細(xì)胞羊膜分別切成尺寸為2cm×6cm的待測試樣3份，依次命名脫細(xì)胞羊膜1、脫細(xì)胞羊膜2和脫細(xì)胞羊膜3。將實(shí)施例2制備獲得的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜分別切成尺寸為2cm×6cm的待測試樣3份，依次命名為交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜1、交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜2和交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜3。將待測試樣分別置于智能電子拉力試驗(yàn)機(jī)，用50N傳感器，速度20mm/min，測定樣品的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率和彈性模量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。由表1計(jì)算可得，交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的平均拉伸強(qiáng)度為(1.598±0.0356)MPa、平均斷裂伸長率為(26.194±0.331)％及平均彈性模量為(0.0055±0.0004)Gpa。脫細(xì)胞羊膜的平均拉伸強(qiáng)度為(0.849±0.0344)MPa、平均斷裂伸長率為(15.729±0.483)％及平均彈性模量為(0.0028±0.0002)GPa。與未交聯(lián)處理的脫細(xì)胞羊膜相比，交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的機(jī)械強(qiáng)度顯著增加(P<0.05)。表1交聯(lián)前后脫細(xì)胞羊膜的機(jī)械強(qiáng)度變化組別拉伸強(qiáng)度(MPa)斷裂伸率(％)彈性模量(GPa)交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜11.52825.6420.0048交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜21.64226.7860.0055交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜31.62626.1540.0062脫細(xì)胞羊膜10.79915.2260.0027脫細(xì)胞羊膜20.83315.7740.0029脫細(xì)胞羊膜30.91516.1880.0030(三)細(xì)胞生長因子含量的檢測將脫細(xì)胞羊膜1、脫細(xì)胞羊膜2、脫細(xì)胞羊膜3、交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜1、交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜2和交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜3分別置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入無血清培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃條件下，靜置7d，收集浸提的培養(yǎng)液并用0.22μm過濾器過濾消毒，用ELISA試劑盒檢測EGF、FGF、HGF含量。重復(fù)測定3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。表2交聯(lián)前后脫細(xì)胞羊膜的細(xì)胞因子含量的變化組別EGF(pg/mL)FGF(pg/mL)HGF(pg/mL)交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜10.0350.0260.142交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜20.0320.0250.145交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜30.030.0220.14脫細(xì)胞羊膜10.030.0250.138脫細(xì)胞羊膜20.0370.0270.135脫細(xì)胞羊膜30.0290.0280.136由表2計(jì)算可得，交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜中EGF的平均含量為(0.0323±0.00145)pg/mL，F(xiàn)GF的平均含量為(0.024±0.0012)pg/mL，HGF的平均含量為(0.142±0.00145)pg/mL。脫細(xì)胞羊膜的EGF的平均含量為(0.032±0.0025)pg/mL，F(xiàn)GF的平均含量為(0.0267±0.0008)pg/mL，HGF的平均含量(0.136±0.0008)pg/mL。與未交聯(lián)處理的脫細(xì)胞羊膜相比，交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的細(xì)胞生長因子的含量無顯著性變化(P＞0.05)。(四)毒性檢測對實(shí)施例1制備獲得的脫細(xì)胞羊膜和實(shí)施例2制備獲得的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜以分別置于無血清的培養(yǎng)基中，37℃下靜置7d后，收集浸提培養(yǎng)液并用0.22μm過濾器過濾消毒。將表皮細(xì)胞以1×104cells/孔的濃度接種至96孔板中，表皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)待細(xì)胞完全貼壁后換成浸提培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日換液。培養(yǎng)2d、4d和6d后分別用CCK-8檢測法測定96孔板中表皮細(xì)胞的細(xì)胞活性，并用分光光度計(jì)(Bio-Tek)讀取450nm的吸光度(OD450nm)。重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。表3交聯(lián)前后脫細(xì)胞羊膜的細(xì)胞毒性檢測組別OD值成活率/％交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜2d0.77±0.03103.45±2.37交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜4d0.88±0.01107.77±4.69交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜6d1.52±0.09109.83±9.58脫細(xì)胞羊膜2d0.67±0.01100脫細(xì)胞羊膜4d0.80±0.05102.55±10.58脫細(xì)胞羊膜6d1.40±0.02105.22±7.54由表3的結(jié)果可知，表皮細(xì)胞分別培養(yǎng)2d、4d和6d之后，交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜與脫細(xì)胞羊膜相比的細(xì)胞毒性均無明顯差異(P>0.05)。實(shí)施例5本實(shí)施例提供修復(fù)裸鼠皮膚缺損的效果證明試驗(yàn)。選取4周齡裸鼠20只，1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，于背部兩側(cè)各作約直徑2cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，隨機(jī)分為兩組，依次命名為交聯(lián)處理組和未交聯(lián)處理組，每組10只。將實(shí)施例3制備的復(fù)合型皮膚替代物移植到交聯(lián)處理組的裸鼠缺損創(chuàng)面上，表皮面朝上，4號手術(shù)線間斷縫合牢固，2周后觀察創(chuàng)面的愈合情況，結(jié)果見圖7。由圖7可知，交聯(lián)處理組的裸鼠的新生表皮接近正常皮膚，質(zhì)軟，表面平整光滑，創(chuàng)面輕微收縮。將實(shí)施例4制備的表皮-真皮替代物移植到未交聯(lián)處理組的裸鼠缺損創(chuàng)面上，同法處理，2周后觀察創(chuàng)面的愈合情況，結(jié)果見圖8。由圖8可知，2周后未交聯(lián)處理組的裸鼠的表皮比較薄，傷口的愈合不完整，創(chuàng)面具有一定程度的收縮。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3