本發(fā)明屬于生物醫(yī)學復合材料領域，具體涉及一種氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合骨修復材料及其制備方法。

背景技術：

人體骨組織小面積缺損可以通過自我修復能力得到再生，但該自愈能力受到年齡、疾病及其它因素限制，因此人工合成的骨修復、骨替代材料從上世紀60年代開始就成為人們關注的焦點。目前，通過組織工程在體外構建骨修復材料填補到缺損部位來治療骨組織的缺損，正成為一種修復骨組織缺損的理想治療方法。

膠原是哺乳動物體內含量最豐富的蛋白質，是細胞外基質（ECM）的主要成分，是皮膚、血管、骨骼、肌腱、牙齒和軟骨的主要成分，屬結構蛋白，具有維持皮膚和各組織器官的形態(tài)結構的功能。膠原的三螺旋結構決定了其具有良好的生物特性，如低毒性、弱抗原性、生物相容性、促進細胞生長、可降解吸收等，因而在人工骨修復材料中具有廣闊的前景。

碳元素是構成整個自然界的基本元素之一，也是人們認識最早的一種元素，其獨特的物理化學性質和形態(tài)隨著科技的不斷進步和發(fā)展而逐漸被人們發(fā)現。氧化石墨烯（GO）由石墨經氧化處理并超聲剝離后得到，原始石墨是疏水的，經過氧化以后表面會形成大量的含氧基團如羧基、羥基、羰基、環(huán)氧基等，從而使氧化石墨烯具有了良好的水溶性和生物相容性。以氧化石墨烯為基礎制備的復合材料其彈性模數、拉伸強度、熱穩(wěn)定性和電導率等方面均具有良好的性能。但是，氧化石墨烯具有一定的生物毒性，與細胞作用會對細胞膜造成損害。而膠原作為細胞外基質組份，能緊密吸附于氧化石墨烯表面。此外，氧化石墨烯表面缺陷也能成為蛋白質的吸附點，且氧化石墨烯的生物毒性在吸附蛋白質之后大幅度降低。

納米羥基磷灰石（nHA）屬于生物活性陶瓷，其組成中含有能夠通過人體正常新陳代謝途徑進行置換的鈣、磷等元素，還含有能與人體組織發(fā)生鍵合的羥基（-OH）基團。nHA具有與骨相似的化學成分、晶體結構、摩擦系數、比重、導熱系數及絕對強度。天然骨由低結晶度的羥基磷灰石和膠原組成，因此，模仿天然骨的成分、結構和特性而制備的納米羥基磷灰石/膠原復合骨修復材料可以具有天然骨組織類似功能，從而應用于骨組織缺損修復。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合骨修復材料及其制備方法，該復合材料將具有良好生物相容性和骨組織缺損修復性能，是一種可用于骨組織缺損修復的新型醫(yī)用材料。

為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種GO/nHA/膠原復合骨修復材料，其是由氧化石墨烯、納米羥基磷灰石和膠原復合交聯而成；其中氧化石墨烯、納米羥基磷灰石和膠原的質量比為2.5~5:20~25:100。

所述膠原來源于魚皮、豬皮、牛皮或牛腱。

所述GO/nHA/膠原復合骨修復材料的制備方法包括以下步驟：

（1）將氧化石墨烯粉末加水后超聲分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；

（2）將凍干的膠原溶于體積濃度為0.3%的丙二酸溶液中，得到質量濃度為0.4%的膠原溶液；其中膠原與所用丙二酸的質量比為0.4:100；

（3）將所得氧化石墨烯分散液與膠原溶液混合攪拌4 h，得均勻的氧化石墨烯-膠原混合液；

（4）將納米羥基磷灰石粉末逐漸加入到所得氧化石墨烯-膠原混合液中，攪拌混勻，凍干并交聯；交聯所用交聯液是將30.026 g D-核糖、100 mL丙酮、20 mL氨水混合后，加純水定容至1000 mL。

（5）將交聯后所得復合材料用去離子水反復沖洗，再次冷凍干燥后，得到氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合膜。

其中，所述氧化石墨烯是采用改進的Hummers法制備而成，其具體操作如下：

1）將108 mL H₂SO₄、12 mL H₃PO₄冰浴攪拌混合10 min后，緩慢加入5 g石墨粉、2.5g NaNO₃；

2）稱取15g KMnO₄，在保證反應溫度低于5℃的條件下，將其分3-5次逐漸加入步驟1）所得溶液中，冰浴攪拌反應3 h，然后在40℃水浴條件下攪拌60 min；

3）將水浴升溫至98℃持續(xù)攪拌60 min，期間緩慢持續(xù)加入去離子水至混合液體積為400 mL，然后停止加熱，待混合液溫度降至室溫，再加入15 mL H₂O₂；

4）反應結束后，將混合液離心取沉淀，并將沉淀用體積濃度5%鹽酸和純水反復清洗，至洗液pH接近中性；

5）將洗滌后的沉淀冷凍干燥，得到氧化石墨烯粉末。

本發(fā)明的有益效果在于：

（1）本發(fā)明采用了具有良好生物相容性的膠原、優(yōu)異機械性能的氧化石墨烯以及與骨具有相似結構成份的納米羥基磷灰石為原料制備復合骨修復材料，使所得材料在保證良好生物活性的同時兼顧了機械強度，且該方法原料易得，操作簡單，便于規(guī)?；a。

（2）D-核糖無細胞毒性，本發(fā)明中以D-核糖替代傳統(tǒng)使用的甲醛為原料制備交聯劑，利用其可與膠原反生美拉德反應，使所形成的膠原纖維排列更加致密有序，從而獲得優(yōu)異的交聯效果。

附圖說明

圖1為氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合骨修復材料的掃描電鏡圖。

圖2為成骨細胞在不同GO含量的氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合骨修復材料上的MTT試驗柱狀統(tǒng)計圖。

圖3為不同GO含量的氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合骨修復材料的機械性能檢測圖，其中（A）拉伸強度、（B）楊氏模量、（C）斷裂伸長率。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

氧化石墨烯的合成：

1）將108 mL濃H₂SO₄和12 ml濃H₃PO₄于反應瓶中混合，冰浴攪拌十分鐘后，緩慢加入5 g石墨粉和2.5 g NaNO₃；

2）稱取15 g KMnO₄，在保證反應溫度低于5℃的情況下，將其分3-5次逐漸加入步驟1）所得溶液中，冰浴攪拌反應3 h，然后移至40℃水浴條件下攪拌60 min；

3）將水浴升溫至98℃持續(xù)攪拌60 min，期間緩慢持續(xù)加入去離子水至混合液體積為400 mL，然后停止加熱，待混合液溫度降至室溫，再加入15 mL H₂O₂；

4）反應結束后，將混合液離心取沉淀，并將沉淀用體積濃度5%鹽酸和純水反復清洗，至洗液pH接近中性；

5）將洗滌后的沉淀冷凍干燥，得到氧化石墨烯粉末。

所用交聯液的配方為：將30.026 g D-核糖、100 mL丙酮、20 mL氨水混合后，加純水定容至1000 mL。

實施例1

（1）稱取凍干的牛腱膠原0.4 g，將其溶于99.6 mL體積濃度為0.3%的丙二酸中，得到質量濃度為0.4%的膠原溶液，并繼續(xù)攪拌4 h；

（2）將0.08 g納米羥基磷灰石粉末逐漸加入到所得膠原溶液中，磁力攪拌8 h，凍干48 h后，在1000 mL交聯液中交聯；

（3）將交聯后所得復合膜用去離子水反復沖洗，再次冷凍干燥后，得到GO含量為0wt%的納米羥基磷灰石/膠原復合膜。

實施例2

（1）將0.005 g氧化石墨烯粉末加水后超聲分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；

（2）稱取凍干的牛腱膠原0.4 g，將其溶于99.6 mL體積濃度為0.3%的丙二酸中，得到質量濃度為0.4%的膠原溶液；

（3）將所得氧化石墨烯分散液與膠原溶液混合攪拌4 h，得均勻的氧化石墨烯-膠原混合液；

（4）將0.095 g納米羥基磷灰石粉末逐漸加入到所得氧化石墨烯-膠原混合液中，磁力攪拌8 h，凍干48 h后，在1000 mL交聯液中交聯；

（5）將交聯后所得復合膜用去離子水反復沖洗，再次冷凍干燥后，得到GO含量為1wt%的氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合膜。

實施例3

（1）將0.01 g氧化石墨烯粉末加水后超聲分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；

（2）稱取凍干的牛腱膠原0.4 g，將其溶于99.6 mL體積濃度為0.3%的丙二酸中，得到質量濃度為0.4%的膠原溶液；

（3）將所得氧化石墨烯分散液與膠原溶液混合攪拌4 h，得均勻的氧化石墨烯-膠原混合液；

（4）將0.09 g納米羥基磷灰石粉末逐漸加入到所得氧化石墨烯-膠原混合液中，磁力攪拌8 h，凍干48 h后，在1000 mL交聯液中交聯；

（5）將交聯后所得復合膜用去離子水反復沖洗，再次冷凍干燥后，得到GO含量為2wt%的氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合膜。

實施例4

（1）將0.02 g氧化石墨烯粉末加水后超聲分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；

（2）稱取凍干的牛腱膠原0.4 g，將其溶于99.6 mL體積濃度為0.3%的丙二酸中，得到質量濃度為0.4%的膠原溶液；

（3）將所得氧化石墨烯分散液與膠原溶液混合攪拌4 h，得均勻的氧化石墨烯-膠原混合液；

（4）將0.08 g納米羥基磷灰石粉末逐漸加入到所得氧化石墨烯-膠原混合液中，磁力攪拌8 h，凍干48 h后，在1000 mL交聯液中交聯；

（5）將交聯后所得復合膜用去離子水反復沖洗，再次冷凍干燥后，得到GO含量為4wt%的氧化石墨烯/納米羥基磷灰石/膠原復合膜。

圖1為實施例4所得復合材料的掃描電鏡圖。從圖中可以看出，該復合材料呈疏松多孔的三維結構，其孔隙率達90%以上，且孔隙內部相互貫通。

1. 將所制備的GO含量分別為0%、1%、2%和4%的復合材料按25 kGy的劑量進行鈷60輻照滅菌，然后分別浸入每孔含0.5 mL DMEM/F12培養(yǎng)基的孔板中；5 h后每片材料表面分別接種1×10⁴個第3代狀態(tài)良好成骨細胞，在37℃、5% CO₂及飽和濕度條件下培養(yǎng)5 h后，將材料移至含新鮮培養(yǎng)基的孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液一次；分別于培養(yǎng)第1、4、7 d取出材料，PBS清洗3次，進行常規(guī)MTT檢測，用酶標儀檢測490 nm處吸光度值。以時間為橫坐標，吸光度值（OD Value）為縱坐標繪制4種復合材料上的細胞增殖圖，所得結果如圖2所示。

從圖2中可見，成骨細胞均表現出正常的增殖狀態(tài)，且含有GO的復合材料上成骨細胞活性在第7 d時較不含GO的復合材料高，表明該復合材料對成骨細胞無明顯細胞毒性，具有良好的生物相容性，其作用的發(fā)揮與GO的引入有關。

2. 將所制備的GO含量分別為0%、1%、2%和4%的復合材料按需求剪好，將兩端夾持在專用夾具上，對試樣施加靜態(tài)拉伸負荷，橫梁速度為2 mm/min，測繪出樣品在拉伸變形過程中的拉伸應力～應變曲線，并計算各組材料彈性模量、楊氏系數大小，分析材料機械性能，所得結果如圖3所示，其中A為拉伸強度、B為楊氏模量、C為斷裂伸長率。

從圖3A中可見，GO含量為0%時的拉伸強度為0.9 MPa，而添加了GO的復合材料拉伸強度得到提高，最大達到了1.28 MPa（4 wt% GO），提高率42.2%。從圖3B中可見，楊氏模量隨GO含量的增加而增加。從圖3C中可見，當GO含量小于1wt％，復合材料的斷裂伸長率呈降低趨勢并在含量為1 wt％時達到最小值；當GO含量大于1wt％時，復合材料的斷裂伸長率又呈增長趨勢。以上結果表明，GO的加入對復合骨修復材料的力學性能提高有一定的加強作用，并在提高復合材料拉伸強度的同時也改善了材料的韌性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。