本發(fā)明屬于納米藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及制備一種對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向作用的二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子及其在制備治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用。該納米粒子既保留維甲酸誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化、抑制其增生的作用，又可攜帶紫杉醇?xì)[瘤干細(xì)胞之外的普通腫瘤細(xì)胞；并且該納米粒子可區(qū)分腫瘤細(xì)胞及正常組織細(xì)胞，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞毒性弱。同時(shí)，該納米復(fù)合物可攜帶并轉(zhuǎn)移Micro-RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮相應(yīng)的作用。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞具有不斷增生和多向分化的能力，是人體組織不斷更新的動(dòng)力源泉。人體的不同組織內(nèi)均存在少量的干細(xì)胞，它們的增生與分化具有嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，以保持增生與分化的平衡。干細(xì)胞根據(jù)需要增生，然后逐漸分化為不同的終末細(xì)胞，最終凋亡，如此循環(huán)，以實(shí)現(xiàn)組織器官的更新和穩(wěn)定。如果干細(xì)胞的增生和分化平衡被破壞，增生過度而分化不足，就會(huì)形成腫瘤。目前，越來越多的研究證實(shí)腫瘤內(nèi)部不僅具有大量的普通腫瘤細(xì)胞，還存在腫瘤干細(xì)胞，腫瘤的發(fā)生及發(fā)展正是由于這些腫瘤干細(xì)胞所引起的。腫瘤干細(xì)胞具有不斷增生、多向分化、遠(yuǎn)處遷移以及耐藥的能力。腫瘤干細(xì)胞的增生與分化平衡被破壞，其增生逃離限制，分化被阻斷，而且增生與分化平衡破壞程度越重，腫瘤干細(xì)胞增生越多，分化越差，腫瘤內(nèi)具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞比例越大，腫瘤的惡性程度也就越高，其生長速度，轉(zhuǎn)移能力，以及對(duì)化療藥物的耐藥性就會(huì)越強(qiáng)。因此，抑制腫瘤干細(xì)胞的過度增生，誘導(dǎo)其分化可以降低腫瘤的惡性程度，抑制其生長及轉(zhuǎn)移，增加腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，提高臨床治療效果。

維甲酸具有抑制腫瘤干細(xì)胞生長，誘導(dǎo)分化的活性，可以在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)階段抑制腫瘤的生長。維甲酸(Retinoic acid,RA)是一種親脂性小分子，其來源于維生素A(或視黃醇)，參與調(diào)控許多發(fā)育過程。維甲酸的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)包括三部分：由三甲基化的環(huán)乙烯構(gòu)成疏水端，由共軛四烯側(cè)鏈構(gòu)成中間鏈接部分，由羧基構(gòu)成親水端。維甲酸可自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合后運(yùn)送至細(xì)胞核。維甲酸的功能基團(tuán)(維甲酸的疏水端)與細(xì)胞核上的維甲酸受體RARs及RXRs形成異二聚體進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，抑制腫瘤干細(xì)胞增生，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化。但是維甲酸有很多不足：不溶于水，給藥途徑受限 制；不具備靶向作用，大劑量使用副作用較大；只能抑制腫瘤干細(xì)胞增生，誘導(dǎo)其分化，而對(duì)非腫瘤干細(xì)胞的普通腫瘤細(xì)胞殺傷作用較弱。

近些年來，智能的納米材料或納米藥物在腫瘤治療方面的研究逐漸增多，其中具備腫瘤靶向作用的藥物/基因雙載納米材料在腫瘤治療方面具有良好的前景。但是，此類材料的作用機(jī)理均為納米載體攜帶抗癌藥物和基因到達(dá)腫瘤后釋放，進(jìn)而發(fā)揮藥物和基因的抗癌作用，而納米載體本身不具備抗癌作用。因此，如果載體本身亦能發(fā)揮抗癌作用，同時(shí)攜帶抗癌藥物和基因可能會(huì)有更好的協(xié)同抗癌效應(yīng)。

綜上，如果能將維甲酸加以改良，使其成為保留維甲酸活性的納米載體，同時(shí)亦能夠攜帶其他抗癌藥物(如紫杉醇)和基因(如Micro-RNA)，在紫杉醇?xì)胀[瘤細(xì)胞的同時(shí)，納米載體亦能發(fā)揮對(duì)腫瘤干細(xì)胞抑制增生和誘導(dǎo)分化的作用，所攜帶的Micro-RNA還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，從而達(dá)到三重功效；并且針對(duì)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異，達(dá)到腫瘤細(xì)胞靶向殺傷的作用，盡可能減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性，可能會(huì)起到更好的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向殺傷作用的二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子及其在制備治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明制備的納米粒子保留了維甲酸抑制腫瘤干細(xì)胞增生，誘導(dǎo)分化的活性，同時(shí)攜帶紫杉醇可起到殺傷腫瘤干細(xì)胞之外的普通腫瘤細(xì)胞的作用；并且該納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度的還原型谷胱甘肽敏感，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后可以迅速解離釋放紫杉醇，暴露維甲酸功能基團(tuán)，從而發(fā)揮作用；在正常細(xì)胞內(nèi)由于還原性谷胱甘肽含量少，則不會(huì)釋放或很少釋放，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用。同時(shí)，該納米粒子可攜帶并轉(zhuǎn)移Micro-RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的作用，從而可以用于制備治療腫瘤的藥物。

本發(fā)明利用全反式維甲酸，在其羧基端添加二茂鐵基團(tuán)，然后經(jīng)三氯化鐵氧化形成雙親分子，在水溶液中自組裝成納米粒子，其內(nèi)部可攜帶疏水的紫杉醇。經(jīng)分離提純后得到所需的納米粒子，其尺寸約2～10nm。并且該納米粒子表面帶有正電荷，可以攜帶并轉(zhuǎn)染基因(如Micro-RNA)發(fā)揮相應(yīng)的功能，這種納米粒子可應(yīng)用于腫瘤的治療。

本發(fā)明采用的原料都是商業(yè)上可以直接買到的物質(zhì)，不需要進(jìn)一步處理，方法工藝簡(jiǎn)單，所需納米粒子的產(chǎn)量較高。

本發(fā)明所述的具有腫瘤細(xì)胞靶向作用的二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子， 其由如下步驟制備得到：

(1)將二茂鐵基維甲酸(FCRA)溶于二氯甲烷(CH₂Cl₂)，再將三氯化鐵(FeCl₃)溶于乙腈(CH₃CN)，然后將兩種溶液混合，三氯化鐵與二茂鐵基維甲酸的用量摩爾比為6～10：1，混勻后于20～30℃、真空條件下旋蒸干燥，得到被完全氧化的二茂鐵基維甲酸；

(2)二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子的制備：將步驟(1)所制備的完全氧化的二茂鐵基維甲酸，用無水乙醇超聲震蕩下溶解，然后加入紫杉醇粉末(完全氧化的二茂鐵基維甲酸與紫杉醇摩爾比為3～10：1)；充分溶解混勻后在超聲震蕩下用去離子水稀釋10～20倍，再用分子量為3500的滲析袋分離提純1～3天，最后將滲析袋內(nèi)產(chǎn)物用0.22μm的無菌水系濾頭過濾，得到除菌且載藥(紫杉醇)的二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子。

附圖說明

圖1：二茂鐵基維甲酸納米粒子高分辨透射電鏡圖(a)及粒徑大小(d),加入GSH后透射電鏡圖(b)；丁達(dá)爾效應(yīng)圖(c)。

圖2：二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子紫外吸收譜(a)，高分辨透射電鏡圖(b)及粒徑大小(c)。

圖3：二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子的藥物釋放曲線。

圖4：二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子與紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞(a)及正常細(xì)胞(b)的作用比較圖。

圖5：多種腫瘤細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞(SP細(xì)胞)的檢測(cè)圖。

圖6：二茂鐵基維甲酸納米粒子與全反式維甲酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2870中SP細(xì)胞集落形成能力的作用圖。

圖7：二茂鐵基維甲酸納米粒子和全反式維甲酸對(duì)A2870細(xì)胞中SP細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物Oct-4和Sox2表達(dá)的作用圖。

圖8：二茂鐵基維甲酸納米粒子對(duì)CY-3標(biāo)記的Micro-RNA轉(zhuǎn)染效率圖。

圖9：二茂鐵基維甲酸納米復(fù)合物對(duì)mir-34a轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)有效mir-34a的含量圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，而不是要以此對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。 實(shí)施例1

二茂鐵基維甲酸的合成與提純：(合成及提純方法參照：Bohua Long,Shengzong Liang,Dingcheng Xing,Yingbin Yang,Jiannan Xiang,European Joural of Medical Chemistry 2009,44:2572-2576)。

將二茂鐵甲醇(ferrocenyl methanol，3mmol)，三苯基膦(PPh3，1.18g，4.5mmol)，全反式維甲酸(ATRA，3mmol)，溶于20mL四氫呋喃(THF)，充分?jǐn)嚢枞芙?，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，0℃條件下加入偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD，0.8g，4.5mmol)。薄層析技術(shù)(TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程，反應(yīng)完全后繼續(xù)室溫?cái)嚢?小時(shí)。30℃真空旋蒸濃縮至粘稠的油狀物，使用硅膠柱層析提取產(chǎn)物(乙酸乙酯/石油醚＝2：8，體積比)，最先得到的產(chǎn)物為二茂鐵基維甲酸(FCRA),產(chǎn)率83％。

實(shí)施例2

(1)二茂鐵基維甲酸的合成與提純見實(shí)施例1。

(2)二茂鐵基維甲酸納米粒子的制備：二茂鐵基維甲酸(FCRA，0.01mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，三氯化鐵(FeCl₃，0.1mmol)溶于乙腈(2mL)，二者互相混勻后30℃真空旋蒸干燥，得到被完全氧化的二茂鐵基維甲酸，產(chǎn)物摩爾量0.01mmol。

將得到的被完全氧化的二茂鐵基維甲酸，用無水乙醇溶液1mL超聲震蕩下溶解，然后用去離子水稀釋10倍，再用分子量為3500的滲析袋分離提純1天。最后將滲析袋內(nèi)產(chǎn)物用0.22μm的無菌水系濾頭過濾，得到除菌的二茂鐵基維甲酸納米粒子溶液(濃度為1μmol/mL)。

高分辨透射電鏡下觀察形成了類圓形的納米粒子，如圖1(a)所示；粒徑約2～10nm，如圖1(d)所示。丁達(dá)爾效應(yīng)可見透射光柱，加入還原型谷胱甘肽(GSH)水溶液形成沉淀，丁達(dá)爾效應(yīng)消失，如圖1(c)所示。透射電鏡檢測(cè)納米粒子形態(tài)消失，形成團(tuán)片的絮狀物，如圖1(b)所示。此結(jié)果說明二茂鐵基維甲酸被氧化后由疏水分子變?yōu)殡p親分子，在水溶液中會(huì)自組裝形成類圓形的納米粒子；而經(jīng)GSH還原后，二茂鐵基維甲酸重新變?yōu)槭杷肿?，失去雙親性，納米粒子解離，發(fā)生沉淀。

實(shí)施例3

(1)二茂鐵基維甲酸的合成與提純見實(shí)施例1。

(2)二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子的制備：二茂鐵基維甲酸(FCRA， 0.01mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，三氯化鐵(FeCl₃，0.1mmol)溶于乙腈(2mL)，二者互相混勻后30℃真空旋蒸干燥，得到被完全氧化的二茂鐵基維甲酸；產(chǎn)物摩爾量0.01mmol。

將得到被完全氧化的二茂鐵基維甲酸，用無水乙醇溶液1mL超聲震蕩下溶解，然后加入1μmol紫杉醇粉末，然后用去離子水稀釋10倍。再用分子量為3500的滲析袋分離提純1天。將滲析袋內(nèi)產(chǎn)物用0.22μm的無菌水系濾頭過濾，得到除菌的二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子溶液(濃度為1μmol/mL)。

紫外吸收光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子，其紫外吸收光譜在紫杉醇的紫外吸收光譜處比單純二茂鐵基維甲酸納米粒子增強(qiáng)，其余部位則與單純二茂鐵基維甲酸納米粒子重疊，說明紫杉醇被二茂鐵基維甲酸納米粒子包裹攜帶，如圖2(a)所示；圖中曲線1代表紫杉醇(Ta)，曲線2代表二茂鐵基維甲酸納米粒子(FC-RA)，曲線3代表二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子(FC-RA@Ta)。高分辨透射電鏡下觀察形成了類圓形的納米粒子，如圖2(b)所示；粒徑約2～10nm，如圖2(c)所示，與未載藥的二茂鐵基維甲酸納米復(fù)合物相比，大小形貌無明顯變化，說明攜帶紫杉醇后，二茂鐵基維甲酸納米粒子的結(jié)構(gòu)無明顯變化。

實(shí)施例4

(1)二茂鐵基維甲酸的合成與提純見實(shí)施例1。

(2)二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子的制備見實(shí)施例3。

(3)二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子的藥物釋放：將實(shí)施例2制備的二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子用去離子水稀釋10倍后，選取各10mL的10個(gè)樣本，分為還原型谷胱甘肽(GSH)組和對(duì)照組(每組5個(gè)樣本)，分別加入還原性谷胱甘肽(GSH)和等量的去離子水，GSH最終濃度模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH濃度(10mmol/mL)。混勻后靜置，分別于0、5、15、30、60分鐘時(shí)各組選取1個(gè)樣本高速離心(8000轉(zhuǎn)/分)10分鐘，紫外吸收光譜檢測(cè)上清液中紫杉醇的含量，從而計(jì)算紫杉醇的釋放率，可見在GSH存在時(shí)，紫杉醇快速釋放，但沒有GSH存在時(shí)，二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子穩(wěn)定，無紫杉醇釋放，如圖3所示。圖中GSH(+)表示有GSH存在，可見紫杉醇于15分鐘內(nèi)達(dá)到最大釋放量；GSH(—)表示無GSH存在，此時(shí)可見在60分鐘內(nèi)未有紫杉醇釋放。由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽含量高，而正常細(xì)胞內(nèi)含量低，此結(jié)果說明當(dāng)該納米粒子如果進(jìn)入腫瘤細(xì)胞(DSH含量高)時(shí)，就會(huì)很快釋放藥物發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞；而進(jìn)入正常細(xì)胞(GSH含量低)則不會(huì)釋放或很少釋放，從而減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性， 起到靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

實(shí)施例5

(1)二茂鐵基維甲酸的合成與提純見實(shí)施例1。

(2)二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子的制備見實(shí)施例3。

(3)為考察二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用，選擇人口腔鱗癌細(xì)胞系(KB，來自于美國ATCC細(xì)胞庫)作為腫瘤細(xì)胞，選擇人恒牙牙髓干細(xì)胞(DPSCs，具體提取分離方法參照Gronthos S,Brahim J,Li W,et al.Stem cell properties of human dental pulp stem cells[J].Journal of dental research,2002,81(8):531-535.)作為正常細(xì)胞備用。

將KB細(xì)胞和人牙髓干細(xì)胞分別以3000/孔接種于96孔板，在含5％(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過夜細(xì)胞貼壁后，分別與二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子和紫杉醇共培養(yǎng)24小時(shí)，MTT法檢測(cè)相對(duì)細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同濃度下，二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子與紫杉醇抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用相似，如圖4(a)；而對(duì)正常細(xì)胞，前者的毒性更小，如圖4(b)所示；圖4(a,b)中Ft代表二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子，Ta代表紫杉醇。本實(shí)驗(yàn)中二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子中所含的紫杉醇是二茂鐵基維甲酸的1/10，為保證紫杉醇的含量一致，故圖中橫坐標(biāo)濃度為Ft的濃度，Ta濃度為Ft濃度的1/10。以上結(jié)果說明二茂鐵基維甲酸/紫杉醇納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞則毒性較小。

實(shí)施例6

(1)二茂鐵基維甲酸的合成與提純方法見實(shí)施例1。

(2)為考察單純二茂鐵基維甲酸納米粒子對(duì)腫瘤干細(xì)胞的作用，故選擇未載藥(紫杉醇)的二茂鐵基維甲酸納米粒子，其制備方法見實(shí)施例2。

(3)不同腫瘤細(xì)胞系腫瘤側(cè)群細(xì)胞(干細(xì)胞)的檢測(cè)：腫瘤細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞(SP cell)是腫瘤細(xì)胞系中一小群細(xì)胞，具有同源性高,自我更新和多項(xiàng)分化的能力。因此，SP細(xì)胞被認(rèn)為是一種富含干細(xì)胞的邊緣細(xì)胞群，是目前腫瘤干細(xì)胞分選的常用方法?？紤]到不同腫瘤細(xì)胞系中SP細(xì)胞含量不同，所以檢測(cè)不同腫瘤細(xì)胞系的SP細(xì)胞含量，并選擇含量高的細(xì)胞作為備選細(xì)胞。

選取人口腔上皮鱗癌細(xì)胞(Kb)，人舌鱗癌細(xì)胞(Cal-27)，人宮頸癌細(xì)胞(Hela)，人卵巢癌細(xì)胞(A2870)，均來自于美國ATCC細(xì)胞庫。采用Hoechst33342/PI(兩 種常用熒光染料，購自美國sigma公司)雙染色后流式細(xì)胞儀分析法(具體方法參照：劉三霞，魯大鵬.口腔鱗癌細(xì)胞系KB和Tca8113中的SP細(xì)胞含量分析,北京口腔醫(yī)學(xué),2010,18(6):329-331.)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KB，Cal-27，Hela細(xì)胞系SP細(xì)胞比率很小，分別為0.18％，0.06％和16.58％，而A2870細(xì)胞系SP細(xì)胞比率高，達(dá)到71.7％，如圖5所示。

(4)二茂鐵基維甲酸納米粒子與普通全反式維甲酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2870SP細(xì)胞(干細(xì)胞)集落形成能力的作用:由于A2870細(xì)胞的SP細(xì)胞比率高，故選擇A2870細(xì)胞分選SP細(xì)胞作為腫瘤干細(xì)胞。按照步驟(3)的方法，將分選所得SP細(xì)胞接種至30mm培養(yǎng)平皿(300/孔)，使用含2％(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM培養(yǎng)基，在含5％二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別與等量(終濃度20μM)的二茂鐵基維甲酸納米粒子和全反式維甲酸共培養(yǎng)誘導(dǎo)5天，之后更換2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至2周，無水乙醇固定后，0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫水溶液染色，去離子水沖洗去除多余結(jié)晶紫后，掃描觀察對(duì)比集落形成數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，二茂鐵基維甲酸納米粒子和單純?nèi)词骄S甲酸均明顯減少了A2870干細(xì)胞的集落形成能力，如圖6所示；圖中Control代表空白對(duì)照組，可見有大量被結(jié)晶紫染色的細(xì)胞集落形成；Ra代表單純?nèi)词骄S甲酸組，可見少量被淡染的細(xì)胞集落形成，說明細(xì)胞的集落形成能力被顯著抑制；Fc代表二茂鐵基維甲酸組，與Ra組類似，可見少量被淡染的細(xì)胞集落形成，說明細(xì)胞的集落形成能力被顯著抑制。目前認(rèn)為只有干細(xì)胞具有形成集落的能力，該結(jié)果說明經(jīng)二者作用后，A2870腫瘤SP細(xì)胞的干細(xì)胞特性減弱，增生受抑制，被誘導(dǎo)分化了。同時(shí)也說明二茂鐵基維甲酸納米粒子保留了維甲酸抑制干細(xì)胞增生，誘導(dǎo)其分化的活性。

(5)二茂鐵基維甲酸納米粒子與普通全反式維甲酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2870干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響:A2870細(xì)胞經(jīng)上述方法分選所得SP細(xì)胞接種至6孔板(200000/孔)，使用含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，在含5％二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，改用無血清的DMEM培養(yǎng)基，分別與等量(終濃度20μM)的二茂鐵基維甲酸納米粒子和全反式維甲酸共培養(yǎng)6小時(shí)，更換2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，重新收取細(xì)胞，提取RNA，RT-PCR檢測(cè)Oct-4和Sox2的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，二茂鐵基維甲酸納米粒子和單純?nèi)词骄S甲酸均可明顯降低Oct-4和Sox2的表達(dá)。因?yàn)镺ct-4和Sox2表達(dá)是腫瘤干細(xì)的標(biāo)志物，所以二者表達(dá)降低說明腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞特性降低，被誘導(dǎo)分化了，如圖7所示，圖中control代表空白對(duì)照組，F(xiàn)c代表二茂鐵基維甲酸納米 粒子組，Ra代表全反式維甲酸組。同時(shí)也說明了二茂鐵基維甲酸納米粒子保留了維甲酸抑制干細(xì)胞增生，誘導(dǎo)其分化的活性。

實(shí)施例7

(1)二茂鐵基維甲酸的合成與提純方法見實(shí)施例1。

(2)為考察二茂鐵基維甲酸納米粒子對(duì)Micro-RNA的轉(zhuǎn)染，故選擇未載藥(紫杉醇)的二茂鐵基維甲酸納米粒子，其制備方法見實(shí)施例2。

(3)二茂鐵基維甲酸納米粒子對(duì)Micro-RNA的轉(zhuǎn)染：將KB細(xì)胞接種于12孔板(1.5×10⁶/孔)，使用10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，在含5％二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將CY-3標(biāo)記的Micro-RNA及二茂鐵基維甲酸納米粒子(質(zhì)量比為1：10)分別溶于去RNA酶的滅菌水中，混合后37℃孵育30分鐘。KB細(xì)胞更換無血清的DMEM培養(yǎng)基，將二茂鐵基維甲酸納米粒子/miRNA復(fù)合物加入(miRNA終濃度50nM，100nM)共培養(yǎng)4小時(shí)，更換全血清培養(yǎng)基(含10％FBS的DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。胰酶消化細(xì)胞，PBS清洗后流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比(單純miRNA轉(zhuǎn)染)，可見二茂鐵基維甲酸納米粒子對(duì)miRNA轉(zhuǎn)染率隨著miRNA濃度增大而增大，分別高達(dá)95.21％和97.04％，如圖8所示；圖中Control代表空白對(duì)照組，此時(shí)的熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)為0.09％；50nM miRNA組代表被二茂鐵基維甲酸納米粒子轉(zhuǎn)染的CY3標(biāo)記的miRNA濃度為50nM，此時(shí)的熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)為95.21％；100nM miRNA組代表被二茂鐵基維甲酸納米粒子轉(zhuǎn)染的CY3標(biāo)記的miRNA濃度為100nM，此時(shí)的熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)為97.04％。說明二茂鐵基維甲酸納米粒子可以將miRNA成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

(5)二茂鐵基維甲酸納米粒子對(duì)mir-34a的轉(zhuǎn)染：將KB細(xì)胞接種于12孔板(1.5×10⁶/孔)，使用10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，在含5％二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將mir-34a及二茂鐵基維甲酸納米粒子(質(zhì)量比為1：10)分別溶于去RNA酶的滅菌水中，混合后37℃孵育30分鐘。KB細(xì)胞更換無血清的DMEM培養(yǎng)基，將二茂鐵基維甲酸納米粒子/miRNA復(fù)合物加入(miRNA終濃度50nM,100nM)共培養(yǎng)4小時(shí)，更換全血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。胰酶消化細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-34a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)mir-34a的含量較空白對(duì)照組升高數(shù)倍(約4-10倍)，隨著mir-34a濃度的增加而增加。而且二茂鐵基維甲酸納米粒子本身也可以提高mir-34a的表達(dá)，如圖9所示；圖中可見，以表空白對(duì)照組(圖中control)作為參照，當(dāng)二茂鐵基維甲酸納米粒子轉(zhuǎn)染50nM的mir-34a時(shí)，細(xì)胞內(nèi)mir-34a的含量升高至空白對(duì)照組的約4倍，圖 中Fc(+)50nM表示；當(dāng)Fc所轉(zhuǎn)染的mir-34a達(dá)到100nM時(shí)，細(xì)胞內(nèi)mir-34a的含量升高至空白對(duì)照組的9倍左右，圖中Fc(+)100nM表示；而且Fc本身亦可以提高細(xì)胞內(nèi)mir-34a的表達(dá)至空白對(duì)照組的2倍左右，圖中Fc表示。以上說明二茂鐵基維甲酸納米粒子可以有效轉(zhuǎn)染miRNA，從而發(fā)揮相應(yīng)的功能。