本發(fā)明屬于藥劑學領域的包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒的制備技術。

背景技術：

抗腫瘤藥物的遞送，需要經歷輸送和釋放兩個階段，包含靶向輸送、細胞識別導入、內體逃逸和胞質釋放，是一系列自發(fā)響應和連續(xù)銜接的完整時序性事件。針對如何提高抗癌藥物在循環(huán)系統(tǒng)中的輸送效率，提高抗癌藥物對腫瘤組織及細胞的靶向識別作用，實現(xiàn)藥物有效地在腫瘤細胞胞質內釋放，是改善腫瘤治療效果亟待解決的關鍵問題。本發(fā)明采用6磷酸葡萄糖酸和槲皮素對殼聚糖分子進行功能化雙親性修飾，利用聚電解質凝聚法，制備了一種包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖納米微粒復合納米微粒，以提高納米制劑的體內循環(huán)時間和其對腫瘤細胞靶向性。殼聚糖分子鏈上修飾的親水性堿性磷酸酶底物，一方面可以保證納米膠束具有弱負電性或電中性表面，避免機體內皮網狀系統(tǒng)對納米顆粒的清除作用，延長納米藥物的體內循環(huán)時間；另一方面，在腫瘤細胞表面堿性磷酸酶的催化作用下，復合納米載體發(fā)生去磷酸化作用脫去磷酸基團，恢復殼聚糖基分子的聚陽離子屬性，提高腫瘤細胞對納米制劑的吞噬效率。槲皮素是腫瘤細胞多種多藥耐藥性相關蛋白的抑制劑，在殼聚糖分子鏈上修飾疏水性槲皮素，可以降低腫瘤細胞對抗癌藥物的耐藥性，提高抗癌藥物對腫瘤細胞的殺傷作用；羧甲基殼聚糖的加入，不僅可以提高復合納米微粒對親水性抗癌藥物——鹽酸阿霉素的包載效率，同時利用羧甲基殼聚糖的質子泵效應，賦予復合納米載體溶酶體逃逸功效，實現(xiàn)鹽酸阿霉素在腫瘤細胞細胞質中的快速釋放。該產品能夠有效降低鹽酸阿霉素的細胞毒性并提高其抑癌效率，對鹽酸阿霉素的使用安全性和方便性上具有顯著地提升。具有十分重要的理論意義和臨床應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒的制備方法 ；是在發(fā)明人已有的技術發(fā)明專利基礎上的延伸 ( 申請?zhí)?： 201610494581.8)，以彌補已有技術的不足，并拓展已有技術的應用范圍。

本發(fā)明以殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸共聚物、羧甲基殼聚糖為原料，通過自組裝技術和聚合物凝聚法合成目標產物，即一種包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒，具體步驟如下：

步驟一 ：參照發(fā)明專利（申請?zhí)枺?01610494581.8）制備殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸共聚物，將殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶解于稀酸溶液中，再將鹽酸阿霉素溶液加入該溶液中，冰浴超聲處理；

步驟二 ：向步驟一中超聲處理后的混合溶液中，加入羧甲基殼聚糖溶液，調節(jié)溶液的酸堿度至 pH 4-6，室溫下攪拌，最后將其分離純化得到包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒。

本發(fā)明具有操作簡便、制備技術工藝簡單以及制造成本低廉等優(yōu)點，可以通過改變投料比來調整納米微粒的粒徑，所形成的殼聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒為規(guī)則球形。本發(fā)明的重要意義在于形成的殼聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖納米復合微粒具有良好的腫瘤細胞靶向性，同時兼顧P-gp抑制作用，能夠有效提高親水性抗癌藥物鹽酸阿霉素的包封包載效率和抑癌效應，具有良好的開發(fā)應用潛力。

以下結合附圖和實施例對本發(fā)明做出進一步說明。

附圖說明

圖1為殼聚糖-槲皮素琥珀酸酯-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒的透射電子顯微鏡圖。

具體實施方式

本發(fā)明以雙親性殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸共聚物、羧甲基殼聚糖、鹽酸阿霉素為原料，通過自組裝技術、聚合物凝聚法合成目標產物，即一種包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒，具體步驟如下：

步驟一 ：稱取殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶解于稀酸溶液中，其中稀酸溶液溶劑濃度為1%（v/v），殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸濃度為0.5-2mg/ml，再將鹽酸阿霉素溶液加入該溶液中，鹽酸阿霉素水溶液濃度為0.7-1.6mg/ml，殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸與鹽酸阿霉素質量比為2:1-4:1，隨后將混合液冰浴超聲處理；

步驟二 ：向步驟一中超聲處理后的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶液中，加入羧甲基殼聚糖溶液，羧甲基殼聚糖溶液濃度為0.8-1.2mg/ml，其添加量為殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸與羧甲基殼聚糖的質量比為 1-8∶3調節(jié)溶液的酸堿度至 pH 4-6，室溫下攪拌2小時，12000 轉 / 分鐘離心 1 小時分離產物，干燥得到固體產品，即具有包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒。

本發(fā)明中所指的稀酸溶劑可以是濃度為 1％ (v/v) 的醋酸或者濃度為 1％ (v/v) 的鹽酸 ；所指的羧甲基殼聚糖可以是 O-羧甲基殼聚糖，也可以是 N， O- 羧甲基殼聚糖，羧甲基取代度范圍是大于 80％，分子量范圍 150-1400kDa。 將產物進行粒徑以及 Zeta 電位分析，結果表明所制備的包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒的粒徑分布較窄，平均粒徑在 114-515nm( 表 1) ；Zeta 電位為-27.4—-7.9mV（表1），對鹽酸阿霉素的包封率和包載量分別為：71.45%-93.32%和14.1%-20.2%。

實施例1

步驟一 ：稱取2mg殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶解于4ml稀醋酸溶液中，其中稀酸溶液溶劑濃度為1%（v/v），再將1ml濃度為0.7mg/ml鹽酸阿霉素溶液加入該溶液中，隨后將混合液冰浴超聲處理；

步驟二 ：向步驟一中超聲處理后的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶液中，加入2ml濃度為1mg/ml分子量為150kDa的N, O-羧甲基殼聚糖溶液，調節(jié)溶液的酸堿度至 pH 6，室溫下攪拌2小時，12000 轉 / 分鐘離心 1 小時分離產物，干燥得到固體產品，即包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒。

實施例2

步驟一 ：稱取4mg殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶解于2ml稀醋酸溶液中，其中稀酸溶液溶劑濃度為1%（v/v），再將1ml濃度為1mg/ml鹽酸阿霉素溶液加入該溶液中，隨后將混合液冰浴超聲處理；

步驟二 ：向步驟一中超聲處理后的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶液中，加入2.5ml濃度為0.8mg/ml分子量為1400kDa的O-羧甲基殼聚糖溶液，調節(jié)溶液的酸堿度至 pH 4，室溫下攪拌2小時，12000 轉 / 分鐘離心 1 小時分離產物，干燥得到固體產品，即包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒。

實施例3

步驟一 ：稱取3.2mg殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶解于3ml稀醋酸溶液中，其中稀酸溶液溶劑濃度為1%（v/v），再將1ml濃度為1.6mg/ml鹽酸阿霉素溶液加入該溶液中，隨后將混合液冰浴超聲處理；

步驟二 ：向步驟一中超聲處理后的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸溶液中，加入1ml濃度為1.2mg/ml分子量為700kDa的O-羧甲基殼聚糖溶液，調節(jié)溶液的酸堿度至 pH5，室溫下攪拌2小時，12000 轉 / 分鐘離心 1 小時分離產物，干燥得到固體產品，即包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒。

附表說明

表 1 為包載鹽酸阿霉素的殼聚糖-槲皮素琥珀酸脂-6-磷酸葡萄糖酸羧甲基殼聚糖復合納米微粒的物理性質以及載藥性能