本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種缺血性腦卒中靶向的紅細胞膜仿生智能藥物載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

腦卒中是一種高致死、高致殘、高復發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，被列為人類僅次于心血管疾病和惡性腫瘤的第三大殺手。臨床上大約87％的腦卒中屬于缺血性腦卒中。所以，對缺血性腦卒中的藥物治療研究具有重大的臨床意義。研究表明：相較于正常生理條件，機體在腦卒中的病理條件下，可在腦缺血病灶部位高水平持續(xù)性的產(chǎn)生高水平活性氧(ROS)，以過量的ROS為釋藥開關(guān)從而設(shè)計智能遞藥系統(tǒng)具有很大的應用前景。NR2B9C是一種目前極有臨床前景的治療缺血性腦卒中的多肽，它由針對NMDA受體亞型NR2B羧基端的9個氨基酸殘基組成，可特異性的與PSD-95結(jié)合，解除NMDAR/PSD-95偶聯(lián)，阻斷引起神經(jīng)興奮性毒性的下游信號傳導，但不影響NMDA受體的正常生理功能。

由于NR2B9C為親水性極強的小分子多肽，常見的膠束、納米粒等核-殼型結(jié)構(gòu)的載體對其包封率和載藥量都不理想。聚合物泡囊是由兩親性嵌段聚合物構(gòu)成的具有封閉雙層結(jié)構(gòu)的藥物遞送載體，內(nèi)部具有良好的親水環(huán)境，對親水性藥物具有很理想的包封作用。前期工作中，我們將NR2B9C包封于由具有ROS響應特性的兩親性嵌段聚合物(PHB-Dextran)在為載體材料構(gòu)成的納米囊泡(NP)，由于該納米囊泡極易響應于ROS介導的降解作用，可使其在腦缺血病灶部位速釋藥物同時減少在非病灶區(qū)釋放，從而更加有效的速釋藥物。然而，作為外來物質(zhì)，高分子納米材料進入人體循環(huán)系統(tǒng)時，難免誘發(fā)機體排異反應。納米粒表面修飾神經(jīng)節(jié)苷酯，聚乙二醇等雖能一定程度上減緩機體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除，仍然難以解決該問題。近年來，來源于自體的紅細胞膜(RBC membrane)仿生載體系統(tǒng)備受矚目。紅細胞(RBC)是血液中數(shù)量最多且壽命最長的細胞，其紅細胞膜具有不可比擬的生物相容性、可降解性，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用，而且具有長循環(huán)壽命。因此我們采用紅細胞膜包裹納米囊泡的聯(lián)合體系(RBC-NP)，構(gòu)建紅細胞膜仿生的腦卒中智能遞藥系統(tǒng)。此體系由作為內(nèi)核的納米囊泡和外層的紅細胞膜構(gòu)成，這種聯(lián)合體系能同時發(fā)揮兩種載體的各自優(yōu)勢。

未經(jīng)靶向修飾的紅細胞膜仿生載體(RBC-NP)雖具有一定的被動靶向特性，但其靶向效率低，特別是在治療腦卒中時，理想的腦缺血靶向遞藥系統(tǒng)須將治療性藥物在腦內(nèi)進一步靶向富集于病灶部位，增加腦內(nèi)病灶部位的藥物濃度，提高療效，并降低對腦正常生理功能的影響。腦缺血歸巢肽SHp(CLEVSRKNC)是近期科學家經(jīng)噬菌體展示技術(shù)篩選出來具有向腦缺血區(qū)特異性歸巢能力的多肽。研究表明：同位素131-I標記的缺血歸巢肽SHp可以選擇性分布在缺血一側(cè)腦組織，而非缺血側(cè)或正常腦組織中同位素信號低于檢測限。因此以腦缺血歸巢肽SHp作為缺血性腦卒中靶向遞藥系統(tǒng)的靶向功能多肽，具有非常大的應用潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是，鑒于高分子納米材料在人體循環(huán)系統(tǒng)中的缺陷以及腦卒中遞藥系統(tǒng)的靶向性低，提供一種缺血性腦卒中靶向的紅細胞膜仿生智能藥物載體及其制備方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：缺血性腦卒中靶向的紅細胞膜仿生智能藥物載體是由作為內(nèi)核的納米囊泡、外層的紅細胞膜以及細胞膜表面修飾的腦缺血歸巢肽SHp構(gòu)成，作為內(nèi)核的納米囊泡和外層的紅細胞膜通過超聲技術(shù)實現(xiàn)包裹融合。該仿生載體由作為內(nèi)核包封NR2B9C的納米囊泡、外層的紅細胞膜以及細胞膜表面修飾的腦缺血歸巢肽SHp構(gòu)成。該載體是由以疏水性硼酸酯接枝于親水葡聚糖骨架形成的兩親性嵌段共聚物(PHB-Dextran)為載體材料制備的納米囊泡，該納米囊泡用于包載神經(jīng)保護劑NR2B9C；納米囊泡具有規(guī)整的球形外觀，平均粒徑在120-220nm。

上述葡聚糖重均分子量為10000～25000，所述硼酸酯為4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯(PBAP)、4-羥甲基苯硼酸中的一種或多種。

所述硼酸酯與葡聚糖的接枝率為30±5％。

所述NR2B9C的氨基酸序列為KLSSIESDV。

所述紅細胞膜為健康雄性SD大鼠全血，經(jīng)低滲提取法破膜釋放內(nèi)含物，得到空白紅細胞膜，再超聲處理得到的均勻的納米級紅細胞膜載體(RBC Vesicles)。

所述SHp肽為SHp、聚乙二醇-磷脂復合物兩部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物，其摩爾比為1:1～5:1；

所述的SHp的氨基酸序列為CLEVSRKNC；

所述聚乙二醇-磷脂復合物使用的聚乙二醇為甲氧基聚乙二醇，其重均分子量為400～5000，磷脂復合物為馬來酰亞胺-甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺；

所述磷脂酰乙醇胺為二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕櫚?；字Ｒ掖及?、二油?；字Ｒ掖及?、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻?；字Ｒ掖及贰⒍鹿瘐Ａ字Ｒ掖及?、1-棕櫚酰基-2-油?；字Ｒ掖及分械囊环N或多種。

所述納米囊泡的制備方法包括以下步驟：以疏水性硼酸酯接枝于親水葡聚糖骨架形成的兩親性嵌段共聚物PHB-Dextran為載體材料制備，將一定量PHB-Dextran溶于甲酰胺與甲醇的混合溶劑作為有機相，將適量NR2B9C溶于0.2M Tris-HCl緩沖液，加入到上述有機相后分散到0.5％泊洛沙姆188水溶液中，繼續(xù)攪拌1-2h，然后透析除去有機溶劑，最后過0.45μm的微孔濾膜即得納米囊泡。

所述細胞膜表面修飾腦缺血歸巢肽SHp包括以下步驟：將SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE與紅細胞膜室溫孵育1h，然后等滲PBS(pH7.4)離心洗滌除去未修飾上的SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE。

所述納米囊泡和紅細胞膜的包裹融合包括以下步驟：先將提取的紅細胞膜(RBC Membrane)或者修飾腦缺血歸巢肽的紅細胞膜(SHp-RBC Membrane)經(jīng)超聲波細胞破碎儀冰浴超聲處理，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾即得納米級紅細胞膜載體(RBC Vesicles or SHp-RBC Vesicles)。然后納米囊泡(NP)與紅細胞膜載體按照1:1～1：5的比例混合，水浴超聲，高速離心除去多余的RBC Vesicles，去離子水重新分散，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾即得紅細胞膜包裹納米囊泡的聯(lián)合體系(RBC-NP or SHp-RBC-NP)。

所述紅細胞膜低滲提取法包括以下步驟：取新鮮血液于3000rpm離心，得到紅細胞，等滲PBS(pH7.4)洗滌，離心后，棄上清，重復三次；然后加低滲Tric-HCl(pH7.4)緩沖液與紅細胞混合，4℃靜置1-2h；再離心洗滌，棄上清(重復3～5次)至無肉眼可見的紅細胞為止。最后獲得白色紅細胞膜樣品置4℃保存。

所述SHp與馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復合物的共價連接包括以下步驟：取一定量Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE(馬來酰亞胺-聚乙二醇(分子量2000)-磷脂復合物)，溶于DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，另取適量SHp(CLEVSRKNC)，溶于磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中；將兩者按順序逐滴加入到10ml磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，氮氣保護，磁力攪拌過夜，得初產(chǎn)物，繼而將通過透析除去過量的SHp；冷凍干燥后，得SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE。所述的SHp的氨基酸序列為CLEVSRKNC。所述SHp肽為SHp、馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復合物兩部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物，其摩爾比為1:1～5:1。

有益效果：

本發(fā)明構(gòu)建的缺血性腦卒中靶向的紅細胞膜仿生智能藥物載體，因外層包裹的紅細胞膜，具有良好的生物相容性、可降解性，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用，而且具有長循環(huán)特性。同時內(nèi)層的納米囊泡具有封閉雙層結(jié)構(gòu)，對親水性藥物NR2B9C具有很好的包封作用。該載體具有無可比擬的生物相容性、延長在體內(nèi)的循環(huán)時間等特點，又能主動靶向于缺血性腦卒中的病灶部位，同時以ROS為智能釋藥開關(guān)，響應病灶部位ROS介導的降解作用，使藥物在腦缺血病灶部位速釋，最大程度提高療效，降低毒副作用。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE的核磁共振圖譜(A為Malemine-PEGPEG₂₀₀₀-DSPE氫譜圖，下圖B為(SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE氫譜圖)

圖2為本發(fā)明紅細胞膜仿生智能藥物載體的透射電鏡圖(左圖A為RBC-NP，右圖B為NP，scar bar:200nm)

圖3為本發(fā)明紅細胞膜仿生智能藥物載體的A粒徑及B電位變化圖。

圖4為本發(fā)明紅細胞膜仿生智能藥物載體的體外釋放圖。

圖5為本發(fā)明紅細胞膜仿生智能藥物載體的大鼠體內(nèi)藥動學圖。

圖6為本發(fā)明紅細胞膜仿生智能藥物載體的大鼠腦組織分布圖。NR2B9C,NP/NR2B9C,RBC-NP/NR2B9C和SHp-RBC-NP/NR2B9C，分別給藥后6h(左圖)或24h(右圖)水合氯醛麻醉，斷頭處死，冰凍切片，將腦切片平鋪于黑色背景紙板，置于活體成像儀下掃描(Ex/Em,550/590nm)NR2B9C,NP/NR2B9C,RBC-NP/NR2B9C和SHp-RBC-NP/NR2B9C在離體腦組織切片中的分布，并拍片記錄，見圖6。縱向的五個切片圖是腦組織不同相應位置的分布。

具體實施方式：

下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的闡述，具體實施例是在本發(fā)明的優(yōu)選條件下進行。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑而得。

實施例1

納米囊泡的制備與表征；

采用自組裝法制備，稱取10mg PHB-Dextran溶于甲酰胺與甲醇的混合溶劑(V:V＝1:1)作為有機相，稱取1mg NR2B9C溶于0.2M Tris-HCl緩沖液，與有機相混合后逐滴分散到不斷攪拌(500rpm，37℃)的10ml 0.5％泊洛沙姆188水溶液中，繼續(xù)攪拌1-2h，透析(截留分子量50kDa，透析介質(zhì)為純水)24h后，過0.45μm微孔濾膜即得納米囊泡載體(NP/NR2B9C)，用透射電鏡表征其形態(tài)見圖2右。圖中顯示透射電鏡下觀察該納米囊泡載體具有規(guī)整的球形外觀，大小均勻，粒徑在165nm左右。激光粒度儀測定納米囊泡粒徑及zeta電位結(jié)果見圖3。

實施例2

SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE的制備與表征；

取Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE(馬來酰亞胺-聚乙二醇2000-磷脂復合物)10mg，溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺，另取SHp10mg，溶于1ml磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中。將兩者按順序逐滴加入到10ml磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，氮氣保護，磁力攪拌過夜，得初產(chǎn)物。繼而將產(chǎn)物通過透析(截留分子量3KDa)除去過量的SHp。冷凍干燥后，得SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE。核磁共振儀檢測其核磁圖譜，參見圖1，其中A為Mal-PEG2000-DSPE的核磁圖譜，B為SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE的核磁圖譜，由圖可看出，A圖顯示出在6.7ppm處有馬來酰亞胺特征峰，而B圖中該峰消失，顯示Mal-PEG_2000-DSPE中的馬來酰亞胺基團已經(jīng)與SHp反應，SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE制備成功。

實施例3

紅細胞膜的提取及腦缺血歸巢肽SHp的修飾；

采用低滲提取法提取，將血液收集在含有抗凝劑的容器中，為避免膜上含有或吸附的蛋白酶使膜蛋白發(fā)生變化，以下操作應在4℃低溫下進行。取大鼠新鮮血液于冷凍離心機離心5000r/min，10min，棄上清及沉淀在紅細胞表層的絨毛狀沉淀層。用相當于紅細胞壓積3倍的預冷PBS(pH7.4)洗滌3次(4℃,5000r/min,15min)。加預冷的0.01mol/L Tric-HCl(pH7.4)與紅細胞(V:V＝40:1)混合，4℃放置1-2h。再以9000r/min離心15min，棄上清(重復3～5次)至無肉眼可見的紅細胞為止。最后獲得白色紅細胞膜樣品，加0.01mol/L PBS(pH7.4)置4℃保存?zhèn)溆?。將SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE與提取的紅細胞膜室溫孵育1h，然后用等滲PBS(pH7.4)離心洗滌(4℃,12000r/min,15min)除去未修飾上的SHp-PEG₂₀₀₀-DSPE。

實施例4

缺血性腦卒中靶向的紅細胞膜仿生智能藥物載體的制備；

先將提取的紅細胞膜(RBC Membrane)或者修飾腦缺血歸巢肽的紅細胞膜(SHp-RBC Membrane)經(jīng)超聲波細胞破碎儀冰浴超聲(47.5W，15min)，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾即得納米級紅細胞膜載體(RBC Vesicles or SHp-RBC Vesicles)。然后納米囊泡(NP)與紅細胞膜載體按照體積比(5:2)比例混合，水浴超聲5min(53kHz,100W)，高速離心(4℃，12000r/min，30min)除去多余的RBC Vesicles，去離子水重新分散，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾即得缺血性腦卒中靶向的紅細胞膜仿生智能藥物載體(RBC-NP or SHp-RBC-NP)。用透射電鏡表征其形態(tài)見圖2左。圖中可觀察該仿生載體具有規(guī)整的球形外觀，大小均勻，粒徑在200nm左右。細微觀察可見其內(nèi)核165nm左右，表面覆蓋的一層約30nm厚度的脂質(zhì)層。激光粒度儀測定該仿生載體的粒徑及zeta電位結(jié)果見圖3。

實施例5

紅細胞膜仿生智能藥物載體的體外釋放；

包載羅丹明標記的NR2B9C(Rhodamine-NR2B9C)的紅細胞膜仿生智能藥物載體制備方式同上。采用超濾離心法考察NP、RBC-NP和SHp-RBC-NP的釋藥行為，用1mM H₂O₂來模擬ROS水平升高的腦缺血病灶部位的微環(huán)境。釋放介質(zhì)分別為pH7.4的PBS磷酸鹽緩沖液和含有1mM H₂O₂的PBS磷酸鹽緩沖液。于37℃恒溫水浴，160rpm振蕩進行釋放實驗，平行操作3份。分別于0，0.5，1，2，4，8h時間點定時吸取介質(zhì)0.5mL，同時補充等量恒溫的新鮮釋放介質(zhì)。取出的介質(zhì)經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，置于超濾離心管(MWCO＝30000Da)中并以3500rpm 5min超濾離心，下層清夜稀釋適當倍數(shù)后，熒光分光光度計(EX:460nm,EM:525nm)測定并計算出累積釋放百分率。由圖4可知，有H₂O₂存在的條件下，NP、RBC-NP和SHp-RBC-NP釋藥迅速，4h時的累計釋藥量已達到50％。而PBS存在下的釋放趨勢趨于平緩，4h時各組的累計釋藥量僅為15％左右。從上述結(jié)果可知，在H₂O₂存在條件下的累積釋放率顯著高于無H₂O₂存在的PBS組，驗證了我們制備的紅細胞膜仿生智能藥物載體釋藥行為的ROS響應特性，這將有利于其進入腦組織后，在缺血細胞中ROS刺激下響應，迅速釋放出藥物，修復已經(jīng)瀕臨死亡的神經(jīng)元。

實施例6

紅細胞膜仿生智能藥物載體的大鼠體內(nèi)藥動學；

包載羅丹明標記的NR2B9C的紅細胞膜仿生智能藥物載體制備方式同上。健康雄性SD大鼠9只，隨機分為3組，分別尾靜脈注射給藥劑量為0.4mg/kg的Free NR2B9C，NP/NR2B9C，RBC-NP/NR2B9C，SHp-RBC-NP/NR2B9C,于給藥后5，10，15，30min和1，2，4，8，24，48h分別眼眶采血0.5mL，12000rpm離心10min血漿分離后，保存在肝素化離心管中，-20℃凍存。采用蛋白沉淀法進行血漿樣品的處理。血漿樣品200μL與600μL冰凍甲醇溶液12000rpm離心30min沉淀蛋白。離心后，吸取600μL上清液真空干燥，200μL去離子水復溶，用熒光分光光度計(EX:460nm,EM:525nm)進行含量測量。由圖5可知，給藥后各處方直接進入血液循環(huán)不存在吸收過程，血藥濃度持續(xù)降低，而RBC-NP/NR2B9C和SHp-RBC-NP/NR2B9C組的血藥濃度下降趨勢與NR2B9C和NP/NR2B9C組相比，可見明顯減緩。由上述結(jié)果可知，我們制備的紅細胞膜仿生智能藥物載體可一定程度上避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用，延長了藥物在體內(nèi)的滯留時間，具有明顯的長循環(huán)作用。

實施例7

紅細胞膜仿生智能藥物載體的大鼠腦組織分布

包載羅丹明標記的NR2B9C的紅細胞膜仿生智能藥物載體制備方式同上。將MCAO手術(shù)后的SD大鼠分別尾靜脈注射400μg/kg的NR2B9C,NP/NR2B9C,RBC-NP/NR2B9C和SHp-RBC-NP/NR2B9C，于給藥后6h或24h水合氯醛麻醉，心室灌注生理鹽水15min，斷頭處死，冰凍切片，厚度5μm，用PBS漂洗后，將腦切片平鋪于黑色背景紙板，置于活體成像儀下掃描(Ex/Em,550/590nm)NR2B9C,NP/NR2B9C,RBC-NP/NR2B9C和SHp-RBC-NP/NR2B9C在離體腦組織切片中的分布，并拍片記錄，見圖6。從圖中腦組織中的熒光分布可以看出，RBC-NP/NR2B9C和SHp-RBC-NP/NR2B9C經(jīng)MCAO大鼠尾靜脈注射后6h或24h，其腦中的熒光強度均強于未經(jīng)紅細胞膜包裹的NR2B9C,和NP/NR2B9C組，此結(jié)果再次說明我們制備的紅細胞膜仿生智能藥物載體具有長循環(huán)的壽命。其中SHp-RBC-NP/NR2B9C組與同時間點其它組相比，可見有較高的熒光集中在腦缺血部位。