本發(fā)明涉及獸用生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
，進(jìn)一步涉及獸用生物制品的制劑技術(shù)，具體涉及一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
：鴨病毒性肝炎(DuckVirusHepatitis，DVH)是由小RNA病毒科腸病毒屬的鴨肝炎病毒(DuckHepatitisVirus，DHV)引起雛鴨的一種急性、高度致死性、烈性傳染病。鑒于其傳染性強、發(fā)病較快的臨床特征，養(yǎng)殖業(yè)中主要以疫苗免疫作為預(yù)防手段，若免疫無效的情況下，該病一旦確診就應(yīng)當(dāng)立即對患病個體進(jìn)行隔離和藥物治療，現(xiàn)有技術(shù)中，針對鴨病毒性肝炎的可選藥物有限，其中卵黃抗體是一種療效突出的生物制品。現(xiàn)有技術(shù)研究表明，卵黃抗體在鴨病毒性肝炎的治療中具有突出的技術(shù)優(yōu)勢。首先，由于分泌卵黃抗體的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生于被治療動物體體外，因此安全性較高；此外，卵黃抗體是機體在抗原刺激下自然生成的混合抗體，因此免疫覆蓋范圍較大，可應(yīng)對的抗原血清型相對廣泛；另外其產(chǎn)生機理是當(dāng)機體受到外來抗原刺激后B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞，分泌特異性抗體進(jìn)入血液循環(huán)，當(dāng)血液流經(jīng)卵巢時，特異性抗體在卵細(xì)胞中逐漸蓄積，形成卵黃抗體，由于IgG移行進(jìn)入卵細(xì)胞是受體作用的結(jié)果，因而IgG可在卵細(xì)胞中大量蓄積，濃度高于血液中的IgG，單個卵黃(約15ml)中卵黃抗體含量可高達(dá)200mg左右。除了藥理作用方面，卵黃抗體在藥物穩(wěn)定性方面也具有一定的優(yōu)勢。首先，其熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性良好，在低于75℃的條件下性質(zhì)穩(wěn)定，90℃處理15min后才會出現(xiàn)失活現(xiàn)象；在PH<4時，僅有少量卵黃抗體失去活性，在pH4～12范圍內(nèi)，卵黃抗體的活性幾乎不受影響。而且，實驗表明卵黃抗體具有耐受反復(fù)凍融的特性，即使經(jīng)過5次凍融，其抗原結(jié)合活性幾乎不受影響。在室溫下可保存6個月，4℃保存可達(dá)5年以上，活性僅下降5％左右。雖然具有以上技術(shù)優(yōu)勢，但目前卵黃抗體藥物在劑型方面仍存在制約因素。(1)目前使用的I型鴨肝炎卵黃抗體均為注射制劑，不但使用費時費力,而且無法避免因注射引起的疫病傳播與各種嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)(食欲廢絕，肌肉壞死，生長受抑等)；(2)目前使用的I型鴨肝炎卵黃抗體注射劑不具有緩釋功能，導(dǎo)致其半衰期較短，在疫病高發(fā)、頻發(fā)時需多次使用才可達(dá)到效果；(3)目前使用的I型鴨肝炎卵黃抗體均為液體制劑，抗體效價受溫度、光照等因素影響較大，導(dǎo)致臨床使用中療效降低。微囊化是固定化技術(shù)的一種，是用成膜材料將微觀顆粒物包覆于其中的技術(shù)方法，可依據(jù)膜材料及包覆方法的不同賦予微囊不同的化學(xué)特性。由于微囊具有保護(hù)作用和選擇透過性，因此可掩蓋異味和顏色、降低毒性、改善物質(zhì)的可加工性和穩(wěn)定性，延長揮發(fā)性物質(zhì)儲存時間，延緩或控制囊心的釋放，將不可混的化合物隔離等獨特的優(yōu)點，在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。然而，作為一項通用性的技術(shù)方法，如何應(yīng)用于具體的技術(shù)環(huán)境則需要圍繞實際情況進(jìn)行針對性設(shè)計，例如，選用何種膜材料才能保證適宜的通透性、所得產(chǎn)物如何保證適宜的緩釋性能，選擇何種包覆工藝才能保證微囊微觀結(jié)構(gòu)的完整性，此外，選用何種劑型、怎樣的操作條件等等，均需要依據(jù)產(chǎn)物性能要求、被包覆物的微觀形態(tài)、化學(xué)性能、藥理特征等條件進(jìn)行針對性設(shè)計。目前，現(xiàn)有技術(shù)尚未針對I型鴨肝炎卵黃抗體的具體情況開發(fā)出成型的工藝條件。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)缺乏一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑制備方法的技術(shù)問題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中I型鴨肝炎卵黃抗體常規(guī)制劑療效較低。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中I型鴨肝炎卵黃抗體藥物因劑型僅限于注射劑從而導(dǎo)致不良反應(yīng)較高。本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中I型鴨肝炎卵黃抗體無法實現(xiàn)緩釋特性。為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑的制備方法，包括以下步驟：1)配制殼聚糖終濃度為0.1～0.3％(w/v)、CaCl2終濃度為0.3～0.7％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液調(diào)整所述混合溶液的pH值至3.2～3.8，真空脫氣，過濾，取濾液即為成囊溶液；2)取I型鴨肝炎卵黃抗體溶液，向其中加入海藻酸鈉至終濃度1.5～2.5％(w/v)；3)將步驟2)所得的抗體溶液與步驟1)所得的成囊溶液以1:(8～12)的比例混合，而后攪拌25～35min；4)將步驟3)所得產(chǎn)物噴霧干燥，即得到所述I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑。作為優(yōu)選，步驟1)中的過濾是利用500目尼龍膜實現(xiàn)的。作為優(yōu)選，步驟1)中殼聚糖終濃度為0.1～0.3％(w/v)、CaCl2終濃度為0.3～0.7％(w/v)的混合溶液是通過以下方法配制的：取殼聚糖，用8～12％醋酸溶液溶解，再加純化水至其中殼聚糖含量0.1～0.3％(w/v)，而后加入CaCl2至其中CaCl2終濃度為0.3～0.7％(w/v)。作為優(yōu)選，步驟3)包括以下操作：在攪拌條件下將步驟2)所得的抗體溶液滴加至步驟1)所得的成囊溶液中，混合后繼續(xù)攪拌25～35min。作為優(yōu)選，步驟2)所述I型鴨肝炎卵黃抗體溶液是通過以下方法制備的：取I型鴨肝炎病滅活疫苗高免雞蛋，卵黃液經(jīng)60目尼龍篩過濾后，用膠體磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黃液體積的50℃～56℃，PH4.8～5.2的醋酸緩沖液稀釋，攪拌30分鐘，再緩慢加入總體積4％的正辛酸攪拌90分鐘，用100目濾布過濾過夜，即可得到澄清的抗體溶液。作為優(yōu)選，所述高免雞蛋是經(jīng)I型鴨肝炎病滅活疫苗免疫三次后的雞所產(chǎn)雞蛋。作為優(yōu)選，所述高免雞蛋的效價高于1:2048。作為優(yōu)選，所述高免雞蛋是通過以下方法制備的：用I型鴨肝炎病滅活疫苗免疫120日齡產(chǎn)蛋母雞，免疫三次，免疫間隔10日；三免后1周取抗體中和效價高于1:2048的雞蛋即為I型鴨肝炎病高免雞蛋。本發(fā)明提供了一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑的制備方法，該方法基于藥物微囊化技術(shù)對常規(guī)卵黃抗體劑型進(jìn)行了改進(jìn)，針對卵黃抗體的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)設(shè)計了適宜的包材配方并確定了包覆方法，使得成囊產(chǎn)物既保證了較高的包覆率又具有適宜的緩釋特性，同時性質(zhì)更加穩(wěn)定，適宜作為口服劑給藥。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明制備的卵黃抗體應(yīng)激反應(yīng)更低，藥效持續(xù)時間更加平穩(wěn)，同時對I型鴨肝炎具有突出的療效，再加之本發(fā)明方法工藝簡便、成本較低，因此便于工藝的放大。本發(fā)明以創(chuàng)新性的技術(shù)改進(jìn)實現(xiàn)了突出的技術(shù)效果，同時成本較低、易于實現(xiàn)，因此具有良好的推廣前景。具體實施方式以下將對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。實施例11卵黃抗體口服劑的制備將18公斤高免蛋浸入1％的新潔爾滅溶液中浸泡消毒15min。取出消毒后的雞蛋自然晾干或吹干，噴灑75％的酒精對蛋殼表面消毒后備用。采取人工打蛋，打蛋時應(yīng)充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集4L卵黃。將卵黃用膠體磨進(jìn)行研磨后加入10L的PH值為5.0的醋酸緩沖液，攪拌30min后緩慢加入終濃度為4％的正辛酸攪拌90min，用100目濾布過濾過夜，收獲10L濾液，將200g海藻酸鈉溶解于10L卵黃抗體溶液中，攪拌均勻，靜止過夜脫氣，即得到含有海藻酸鈉的卵黃抗體溶液。將200g殼聚糖用1000ml10％醋酸溶解后，加入99000ml純化水，配制成殼聚糖溶液，再在殼聚糖溶液中加入500gCaCl2，用醋酸將溶液PH值調(diào)節(jié)至3.5，真空脫氣，用500目尼龍篩過濾，配置成100000ml的成囊溶液，將以上制備的10L含有海藻酸鈉的卵黃抗體溶液，緩慢加入100000ml成囊溶液中并攪拌，在滴加完成后再攪拌30分鐘，反應(yīng)完全，經(jīng)噴霧干燥設(shè)備脫水，收獲I型鴨肝炎抗體口服制劑。2攻毒治療取3日齡I型鴨肝炎病易感雛鴨50只，均分為五組，不同組別的試驗雛鴨隔離飼養(yǎng)。四組試驗雛鴨全部肌肉注射200LD50的I型鴨肝炎強毒，于第二日，將第一組試驗雛鴨灌服防治I型鴨肝炎的卵黃抗體口服制劑(0.5ml/只，所含中和效價為1:512)，第二組雛鴨正常飲水，水中含有中和效價為1:512的I型鴨肝炎卵黃抗體，第三組試驗雛鴨灌服常規(guī)卵黃抗體液(0.5ml/只，所含中和效價1:512)，第四組試驗雛鴨肌肉注射常規(guī)卵黃抗體液(0.5ml/只，所含中和效價1:512)，第五組為攻毒對照組，五組試驗雛鴨均持續(xù)飼養(yǎng)10天，記錄發(fā)病死亡情況，實驗結(jié)果如表1所示。表1不同治療方法療效驗證結(jié)果分組雛鴨數(shù)量措施死亡數(shù)治愈率灌服口服制劑組10只攻毒后治療0只100％飲水口服制劑組10只攻毒后治療0只100％口服常規(guī)制劑組10只攻毒后治療8只20％肌注常規(guī)制劑組10只攻毒后治療0只100％攻毒對照組10只攻毒后不治療10只0％上述結(jié)果表明灌服及飲水途徑使用防治I型鴨肝炎的卵黃抗體緩釋制劑，注射途徑使用常規(guī)卵黃抗體均具有良好的治療效果，而口服途徑使用常規(guī)卵黃抗體的治療效果較差。實施例2一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑的制備方法，包括以下步驟：1)配制殼聚糖終濃度為0.1％(w/v)、CaCl2終濃度為0.3％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液調(diào)整所述混合溶液的pH值至3.2，真空脫氣，過濾，取濾液即為成囊溶液；2)取I型鴨肝炎卵黃抗體溶液，向其中加入海藻酸鈉至終濃度1.5％(w/v)；3)將步驟2)所得的抗體溶液與步驟1)所得的成囊溶液以1:8的比例混合，而后攪拌25min；4)將步驟3)所得產(chǎn)物噴霧干燥，即得到所述I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：步驟1)中的過濾是利用500目尼龍膜實現(xiàn)的。步驟1)中殼聚糖終濃度為0.1％(w/v)、CaCl2終濃度為0.3％(w/v)的混合溶液是通過以下方法配制的：取殼聚糖，用8％醋酸溶液溶解，再加純化水至其中殼聚糖含量0.1％(w/v)，而后加入CaCl2至其中CaCl2終濃度為0.3％(w/v)。步驟3)包括以下操作：在攪拌條件下將步驟2)所得的抗體溶液滴加至步驟1)所得的成囊溶液中，混合后繼續(xù)攪拌25min。步驟2)所述I型鴨肝炎卵黃抗體溶液是通過以下方法制備的：取I型鴨肝炎病滅活疫苗高免雞蛋，卵黃液經(jīng)60目尼龍篩過濾后，用膠體磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黃液體積的50℃，PH4.8的醋酸緩沖液稀釋，攪拌30分鐘，再緩慢加入總體積4％的正辛酸攪拌90分鐘，用100目濾布過濾過夜，即可得到澄清的抗體溶液。所述高免雞蛋是通過以下方法制備的：用I型鴨肝炎病滅活疫苗免疫120日齡產(chǎn)蛋母雞，免疫三次，免疫間隔10日；三免后1周取抗體中和效價高于1:2048的雞蛋即為型鴨肝炎病滅活疫苗高免雞蛋。實施例3一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑的制備方法，包括以下步驟：1)配制殼聚糖終濃度為0.3％(w/v)、CaCl2終濃度為0.7％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液調(diào)整所述混合溶液的pH值至3.8，真空脫氣，過濾，取濾液即為成囊溶液；2)取I型鴨肝炎卵黃抗體溶液，向其中加入海藻酸鈉至終濃度2.5％(w/v)；3)將步驟2)所得的抗體溶液與步驟1)所得的成囊溶液以1:12的比例混合，而后攪拌35min；4)將步驟3)所得產(chǎn)物噴霧干燥，即得到所述I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：步驟1)中殼聚糖終濃度為0.3％(w/v)、CaCl2終濃度為0.7％(w/v)的混合溶液是通過以下方法配制的：取殼聚糖，用12％醋酸溶液溶解，再加純化水至其中殼聚糖含量0.3％(w/v)，而后加入CaCl2至其中CaCl2終濃度為0.7％(w/v)。步驟3)包括以下操作：在攪拌條件下將步驟2)所得的抗體溶液滴加至步驟1)所得的成囊溶液中，混合后繼續(xù)攪拌35min。步驟2)所述I型鴨肝炎卵黃抗體溶液是通過以下方法制備的：取I型鴨肝炎病滅活疫苗高免雞蛋，卵黃液經(jīng)60目尼龍篩過濾后，用膠體磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黃液體積的56℃，PH5.2的醋酸緩沖液稀釋，攪拌30分鐘，再緩慢加入總體積4％的正辛酸攪拌90分鐘，用100目濾布過濾過夜，即可得到澄清的抗體溶液。所述高免雞蛋是經(jīng)I型鴨肝炎病滅活疫苗免疫三次后的雞所產(chǎn)雞蛋。所述高免雞蛋的效價高于1:2048。實施例4一種I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1)配制殼聚糖終濃度為0.2％(w/v)、CaCl2終濃度為0.5％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液調(diào)整所述混合溶液的pH值至3.5，真空脫氣，過濾，取濾液即為成囊溶液；2)取I型鴨肝炎卵黃抗體溶液，向其中加入海藻酸鈉至終濃度2％(w/v)；3)將步驟2)所得的抗體溶液與步驟1)所得的成囊溶液以1:10的比例混合，而后攪拌30min；4)將步驟3)所得產(chǎn)物噴霧干燥，即得到所述I型鴨肝炎卵黃抗體口服制劑。以上對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3