本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及小鵝瘟疫苗的制備方法及產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
小鵝瘟病毒(Gosling plague virus,GPV)，又稱鵝細(xì)小病毒或Derzsy’s病原，它能夠引起1月齡以內(nèi)(以20日齡以內(nèi)的為主)的雛鵝爆發(fā)急性、接觸性、致死性的疾病。GPV屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬成員，其僅有一種血清型，但與番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)具有部分相同的抗原。VP3基因編碼GPV的主要結(jié)構(gòu)性蛋白，可以刺激機體產(chǎn)生中和性抗體。我國學(xué)者方定一、王永坤等于1956年首次在江蘇揚州發(fā)現(xiàn)該病毒，并將其命名為“小鵝瘟”。匈牙利學(xué)者德舍氏(Derzsy’s)于1966年首次使用鵝胚分離到該病毒，1974年，世界家禽協(xié)會將其正式命名為Derzsy’s病，隨后GPV不斷蔓延至中國臺灣、匈牙利、英國、日本、泰國、德國、美國、瑞典和波蘭等多個國家和地區(qū)。近些年，GPV仍在世界各國陸續(xù)的出現(xiàn)，該病毒的流行與感染給養(yǎng)鵝業(yè)、養(yǎng)番鴨業(yè)造成了很大的損失，嚴(yán)重威脅著水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。
對于小鵝瘟的防制，目前各國均研制出相應(yīng)的疫苗進行免疫預(yù)防，取得了一定的效果，但至今沒能較好地控制小鵝瘟發(fā)生。國內(nèi)商品化的小鵝瘟疫苗均為弱毒活疫苗(SYG61株或GD株)，小鵝瘟活疫苗免疫可能存在以下缺點：(1)由于GPV只能在鵝胚、番鴨胚、鵝成纖維細(xì)胞、番鴨成纖維細(xì)胞上繁殖，對雞胚不易感，且用于小鵝瘟活疫苗生產(chǎn)的鵝胚等均不是SPF級，活疫苗中存在著有外源病毒污染的可能，免疫后，對鵝群有極大的外源毒感染風(fēng)險。(2)小鵝瘟活疫苗免疫種鵝群后，由于機體排毒，給鵝場、孵化場帶來二次污染，對鵝場的病毒凈化不利。(3)雛鵝免疫活疫苗后，免疫期產(chǎn)生需約1周時間，而1周內(nèi)雛鵝是感染GPV的高發(fā)日齡段，由于我國水禽飼養(yǎng)還處于開放式低水平階段，如果此時免疫后隔離措施不到位，雛鵝極易在抗體產(chǎn)生前感染GPV，造成防疫失敗。
1962年中國爆發(fā)鵝細(xì)小病毒，曾使用高免血清保護剛孵出的雛鵝，后來歐洲也廣泛使用由高免鵝制備的血清進行抗血清治療。目前，國內(nèi)已有商品化小鵝瘟卵黃抗體出售，即雛鵝出雛后，3日齡內(nèi)立即注射卵黃抗體，其原理是雛鵝在易感日齡段通過注射卵黃抗體獲得被動免疫，起到預(yù)防GPV感染的作用。注射卵黃抗體的不足之處是：(1)雛鵝出雛后每只免疫，成本高且費時。(2)由于注射的卵黃抗體在雛鵝體內(nèi)代謝較快，其被動免疫持續(xù)期保持較短，只能保護易感高發(fā)日齡段雛鵝，對雛鵝整個小鵝瘟感染日齡段不能達到全保護。
因此，如何提高該疫苗效力和安全性成為了當(dāng)前首要的任務(wù)。滅活疫苗具有安全性高、可多次免疫、不存在散毒的危害性等特點，并可以通過免疫種鵝產(chǎn)生的母源抗體來保護其子代成為了本疫苗研發(fā)的主要依據(jù)。目前我國尚無商品化防控小鵝瘟病的滅活疫苗產(chǎn)品。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明是基于非免鵝胚擴繁種毒，經(jīng)連續(xù)在線純化、濃縮后低溫乳化制備小鵝瘟滅活疫苗的方法，為小鵝瘟提供一種安全連續(xù)封閉式的制備方法，與傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝相比，滅活疫苗具有安全性高、疫苗中抗原含量高、可多次免疫、不存在散毒的危害性等特點。
本發(fā)明提供了一種小鵝瘟滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
1)篩選健康易感鵝胚；
2)生產(chǎn)用毒液的制備
毒種繁殖
將種毒稀釋，接種于11日齡易感鵝胚的尿囊腔內(nèi)，接種后每日照胚3～4次，選取48～120小時內(nèi)死亡且病變明顯的鵝胚，收獲無菌且對1％雞紅細(xì)胞懸浮液凝集陰性的尿囊液樣品。
接種
將上述尿囊液樣品稀釋，接種于11日齡易感鵝胚的尿囊腔，繼續(xù)孵育，每日照蛋1次，將48小時內(nèi)死亡的鵝胚棄去，然后每4～6小時照胚1次，隨時取出48～144小時死亡的鵝胚，置于2～8℃冷藏庫冷卻4小時以上。
收獲
將上述冷卻的鵝胚取出，吸取尿囊液清亮的絨毛尿囊膜及羊膜的胚液，經(jīng)純化、濃縮后病毒含量不低于108.0ELD50/ml；最后經(jīng)滅活、高速低溫乳化及分裝。
所述步驟1)均為11日齡易感鵝胚，通過對非免疫鵝胚卵黃中GPV瓊擴抗體及接種前鵝胚內(nèi)小鵝瘟病毒的檢測來確保非免疫鵝胚的質(zhì)量，并同時按照2010版的《中國獸藥典》附錄中關(guān)于外源毒檢測的方法進行檢測。
所述純化步驟包括純化濃縮中所使用的純化設(shè)備為瑞典Alta Laval在線碟片式離心機，在線離心速度為5000～8000轉(zhuǎn)/分鐘。所使用的濃縮設(shè)備為美國PALL抗原濃縮機。
所述滅活方法為：將檢驗合格的病毒液緩慢加入經(jīng)0.2M的NaOH環(huán)化后的BEI，使其終濃度達到0.1％，隨即混勻并升溫。當(dāng)滅活罐中心溫度達32℃后開始計時，以120轉(zhuǎn)/分緩慢攪拌并持續(xù)滅活60小時。滅活完成后加入終濃度為2％的硫代硫酸鈉終止滅活。
所述乳化的方法為：取3份油相放入乳化罐中，慢速攪拌的同時緩緩加入1份水相，加完后，攪拌混勻，然后使用德國IKA剪切機高速連續(xù)乳化，轉(zhuǎn)速設(shè)定為2000～4000轉(zhuǎn)/分鐘，溫度設(shè)定為10～20℃之間。
本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點：相較于傳統(tǒng)的活疫苗制備方法中增加了標(biāo)準(zhǔn)鵝胚的篩選環(huán)節(jié)、抗原連續(xù)在線純化濃縮技術(shù)及高速低溫乳化，有效地提高了病毒的繁殖效力及抗原損失，顯著提升疫苗產(chǎn)品質(zhì)量；疫苗經(jīng)連續(xù)在線純化和濃縮后雜蛋白含量顯著減少，病毒含量明顯提高；本疫苗為滅活疫苗，目前國內(nèi)外均無該疫苗制備的標(biāo)準(zhǔn)方法及相關(guān)疫苗生產(chǎn)，具有安全性高且顯著降低勞動力成本。
本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)上述方法制備的小鵝瘟滅活疫苗的產(chǎn)品，包括乳化后制得油包水劑型滅活疫苗。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例1
健康易感鵝胚的篩選
鑒于小鵝瘟病毒擴繁條件的局限性，僅能選擇非免疫健康易感鵝胚作為制備種毒、生產(chǎn)種毒和生產(chǎn)毒液的繁殖載體。非免疫鵝胚的篩選及檢測便成為了疫苗研發(fā)和生產(chǎn)的重要工作之一，本研究通過對非免疫鵝胚卵黃中GPV瓊擴抗體及接種前鵝胚內(nèi)小鵝瘟病毒的檢測來確保非免疫鵝胚的質(zhì)量，主要步驟包括小鵝瘟瓊脂擴散試驗抗原制造及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、小鵝瘟瓊脂擴散抗體的檢測和小鵝瘟病毒抗原檢測方法，并同時按照2010版的《中國獸藥典》附錄中關(guān)于外源毒檢測的方法進行檢測。
1小鵝瘟瓊脂擴散試驗抗原制造及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1.1抗原制造
1.1.1病毒繁殖取小鵝瘟病毒(TZ10株)生產(chǎn)用毒種，接種易感鵝胚，收獲鵝胚液。
1.1.2病毒濃縮將收獲的鵝胚液，經(jīng)3000r/min離心30分鐘，取上清液加入等量氯仿震蕩30分鐘，吸取上清液裝入透析袋，置于盛有PEG6000的容器中，4℃濃縮至原體積的1/30～1/50倍，用適量滅菌生理鹽水洗滌透析袋，制成20～30倍濃縮瓊擴抗原，小量分裝，-20℃以下冷凍保存。
1.2質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
本品系用小鵝瘟病毒(TZ10株)接種易感鵝胚培養(yǎng)，收獲感染胚液，經(jīng)濃縮后制成。
1.2.1性狀淡黃色澄清液體。
1.2.2無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。
1.2.3效價測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄測定ELD50，病毒含量應(yīng)≥107.0ELD50/0.2ml。
1.2.4特異性檢驗分別與小鵝瘟陽性血清、鴨肝炎病毒陽性血清、鴨瘟病毒陽性血清、H5亞型禽流感病毒陽性血清、H9禽流感病毒陽性血清、新城疫病毒陽性血清、減蛋綜合征病毒陽性血清、及SPF雞血清做瓊擴試驗，抗原對小鵝瘟陽性血清應(yīng)為陽性，對鴨瘟等其它陽性血清及SPF雞血清應(yīng)為陰性。
1.2.5作用與用途用于檢測小鵝瘟病毒抗體的瓊脂擴散試驗。
1.2.6規(guī)格1ml/瓶
1.2.7貯藏-20℃以下保存，有效期為12個月。
2小鵝瘟瓊脂擴散試驗操作
2.1待檢樣品處理
2.1.1待檢卵黃用5％碘酒消毒待檢鵝蛋(或雞蛋)，用無菌方法吸取1ml卵黃至滅菌小青瓶中，加入等量滅菌生理鹽水充分混勻，即為1:1稀釋的卵黃液，再進行倍比稀釋，取適當(dāng)稀釋度，用于瓊擴檢測。
2.1.2待檢血清采集鵝血(或雞血)，用3000r/min離心10min，分離血清，立即實驗或冷凍保存。
2.2瓊擴板制備取優(yōu)質(zhì)瓊脂粉0.8g，加入pH7.8的8％NaCl溶液100ml，標(biāo)記刻度，加熱使瓊脂完全溶解，補純水至刻度線，待瓊脂冷卻至60℃左右，制成3～3.5mm厚的平板，完全冷卻后，冷藏密封保存。
2.3瓊脂擴散試驗操作步驟
2.3.1打孔將制備好的瓊脂板按模板用打孔器打孔，挑出孔中瓊脂，用燒熱的針沿孔壁轉(zhuǎn)一圈熔化孔中瓊脂補孔底。一組瓊脂孔為，中心1孔、周圍6孔、孔徑3mm、孔距4mm。
2.3.2加樣中央孔加入檢驗合格的瓊擴抗原，周圍6孔中的第1～5孔依次加入待檢稀釋度血清(或卵黃)，第6孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。各孔均以加滿而不溢出為度。
2.3.3孵育將加樣后的瓊脂板放入濕盒內(nèi)，置37℃溫箱，24～96小時觀察瓊擴線。
2.4結(jié)果判定
2.4.1瓊擴陽性或陰性判定當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)清晰沉淀線時，被檢血清(或卵黃)孔與抗原孔之間也出現(xiàn)沉淀線，且與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沉淀末端相吻合，即被檢血清(或卵黃)，判為陽性；被檢血清(或卵黃)孔與抗原孔之間未出現(xiàn)沉淀線，判為陰性。
2.4.2瓊擴抗體效價判定當(dāng)被檢血清(或卵黃)最高稀釋倍數(shù)孔與抗原孔之間形成清晰沉淀線時，該稀釋度判即為被檢血清(或卵黃)瓊擴抗體效價。
3小鵝瘟病毒抗原檢測方法
3.1材料與準(zhǔn)備
3.1.1病料取適量病料組織與雙抗磷酸鹽緩沖液(PBS)按1:3質(zhì)量比進行混合后研磨，將研磨后的病料經(jīng)2次凍融后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清進行檢測。
3.1.2胚體挑取胚體于滅菌容器中(謹(jǐn)防卵黃破裂)，胚體用組織搗碎機以8000～10000轉(zhuǎn)/分、研磨5～10分鐘，制成組織勻漿。將胚體組織勻漿液于-20℃凍融2次，用滅菌的1層100目銅網(wǎng)與4層紗布進行過濾，棄胚渣，取胚體組織濾液進行檢測。
3.1.3引物設(shè)計合成檢測引物：P1，5′-CCAAGCTACAACAACCACAT-3′；P2：5′-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3′，擴增目的片段大小為539bp。
3.1.4 10％SDS稱取10g SDS溶于80ml的去離子水中，定容至100ml，室溫保存。
3.1.5蛋白酶K(20mg/ml)的配制可溶性的蛋白酶K粉劑以20mg/ml的濃度溶解在50mol/L Tris-Cl(pH8.0)和1.5mol/L EDTA中，分裝后-20℃保存。
3.1.6 RTE緩沖液按照以下濃度配制TE緩沖液，10mM Tris-HCl，pH 8.0；1mM EDTA，pH 8.0，然后按照20μg/ml的終濃度加入Rnase A。
3.2方法
3.2.1待檢樣品DNA提取取待檢樣品500μl，加入92μl 10％SDS，8μl蛋白酶K(20mg/ml)，混勻后55℃作用30分鐘。再加入等體積的酚:氯仿(1:1)，劇烈震蕩混勻，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取400μl上清液，加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，-20℃放置20分鐘后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。棄上清，在加入800μl 70％的乙醇洗滌，棄掉乙醇，吹干，加入30μl RTE緩沖液，37℃水浴15min溶解DNA，立即使用或保存在-20℃保存?zhèn)溆?。同時分別設(shè)陽 性和陰性對照樣品，以同樣的方法提取DNA。
3.2.2 PCR擴增按照以下體積配制反應(yīng)體系：
PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃再延伸10min，12℃保存。
3.2.3電泳將PCR擴增產(chǎn)物以1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。
3.3結(jié)果判定當(dāng)陽性對照樣品擴增出539bp的條帶，陰性對照樣品無特異性的條帶出現(xiàn)時，結(jié)果成立。當(dāng)被檢樣品擴增出539bp條帶時即為小鵝瘟病毒陽性，無條帶時為陰性。
實施例2
病毒接種及培養(yǎng)制備病毒液
毒種繁殖
將種毒用滅菌生理鹽水進行1:100倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種11日齡易感鵝胚，每胚0.2ml，接種后每日照胚3～4次，選取48～120小時內(nèi)死亡且病變明顯的鵝胚，分別收獲尿囊液，置于滅菌容器內(nèi)。將經(jīng)無菌檢驗合格，且對1％雞紅細(xì)胞懸浮液凝集陰性的樣品定量分裝，注明收獲日期、種毒代次等信息，冷凍保存。
接種
將生產(chǎn)用毒種用滅菌生理鹽水進行1:100倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種11日齡易感鵝胚，每胚0.2ml，石蠟封孔，置38℃繼續(xù)孵育，不必翻蛋。
孵育和觀察
接種后48小時內(nèi)，每日照蛋1次，將48小時內(nèi)死亡的鵝胚棄去。此后，每4～6小時照胚1次，隨時取出48～144小時死亡的鵝胚，置2～8℃冷藏庫，氣室向上直立，冷卻4小時以上。棄去144小時以后的活鵝胚。
收獲
將冷卻的鵝胚取出，消毒氣室部位，無菌剝除氣室部卵殼，揭去殼膜，挑破絨毛尿囊膜及羊膜(謹(jǐn)防卵黃破裂)，吸取胚液，吸取胚液前均應(yīng)注意檢查每個鵝胚的尿囊液及胚體，觀察尿囊液是否清亮，如果出現(xiàn)尿囊液渾濁、異味、散黃、胚胎腐敗等現(xiàn)象則棄去。每若干鵝胚分為一組，吸取胚液放于同一滅菌容器中，分別取樣，-20℃以下保存?zhèn)溆?；同時挑取胚體于另一滅菌容器中(謹(jǐn)防卵黃破裂)，胚體用組織搗碎機8000～10000轉(zhuǎn)/分、研磨10～20分鐘，制成組織勻漿液，置-20℃凍融2次，用滅菌的4層紗布和1層80目銅網(wǎng)進行過濾，棄胚渣，將胚體組織濾液取樣，-20℃以下保存?zhèn)溆?。病毒?20℃保存應(yīng)不超過6個月。
實施例3
病毒液的純化、濃縮及疫苗制備
1病毒液的純化
經(jīng)檢驗合格的病毒液通過無菌管道傳送至Alta Laval在線碟片式離心機，經(jīng)連續(xù)在線離心后，獲得純化后的病毒液。
2病毒液的濃縮
病毒經(jīng)純化后通過無菌管道傳送至PALL濃縮機進行濃縮，根據(jù)濃縮前病毒含量確定的濃縮倍數(shù)進行濃縮，使?jié)饪s后病毒液中每毫升中病毒含量不低于108.0ELD50。
3病毒液滅活及制備成疫苗產(chǎn)品
3.1病毒液滅活：
將檢驗合格的抗原混合液用滅菌的4層紗布和1層80目銅網(wǎng)進行過濾，置滅活罐中，加入經(jīng)0.2M NaOH環(huán)化的BEI，使其終濃度達到0.1％，邊加邊攪拌，充分混合，當(dāng)滅活罐中心溫度升至32℃后開始計時，以120轉(zhuǎn)/分滅活60小時，滅活后以終濃度為2％的硫代硫酸鈉進行終止，置2～8℃保存?zhèn)溆?，?yīng)不超過3個月。
3.2油佐劑滅活疫苗的制備：
取注射用白油94份，加硬脂酸鋁1份，邊加入邊攪勻，直到完全透明為止， 再加入6份司本-80，混合后，高壓滅菌備用。取滅活的制苗用病毒液96份，加入4份滅菌的吐溫-80，充分搖勻，直至吐溫-80完全溶解。取3份油相放入乳化罐中，慢速攪拌的同時緩緩加入1份水相，加完后，中速攪拌，然后經(jīng)IKA連續(xù)的高速低溫乳化，制成小鵝瘟滅活疫苗。
實驗例4
本實驗例說明得到的疫苗產(chǎn)品的安全試驗及免疫效力。
一、疫苗安全性試驗
小鵝瘟油乳劑滅活疫苗(TZ10株)，批號分別為TZ-001、TZ-002、TZ-003共3批，均由我公司研發(fā)中心實驗室制備。小鵝瘟瓊擴抗體陰性的1月齡鵝、7月齡開產(chǎn)種鵝、9月齡產(chǎn)蛋種鵝，均購自高郵市心連心鵝業(yè)合作社。
1試驗方法
1.1單劑量一次接種的安全實驗
每批疫苗分別選取3-5日齡雛鵝10只、1月齡鵝10只、7月開產(chǎn)種鵝10只、9月齡產(chǎn)蛋種鵝10只，雛鵝每只胸部肌肉注射0.2ml，其余鵝每只胸部肌肉注射疫苗1.0ml，每組均另取10只相同來源、相同日齡的鵝，作為非免疫對照組。注射后連續(xù)觀察21日，每日觀察各組鵝精神狀況、飲水、進食量等情況；免疫后7日、14日、21日觸摸檢查各免疫組鵝注射部位，檢查是否有紅腫等局部注射反應(yīng)；免疫前與免疫后21日稱重，比較免疫組與非免疫對照組鵝平均增重是否有差異(用SPSS軟件比較)；產(chǎn)蛋種鵝免疫組與非免疫組免疫后21日產(chǎn)蛋率是否有差異；分別任取每批次疫苗免疫后21日種鵝所產(chǎn)鵝胚20枚，做好標(biāo)記，比較鵝胚孵化率是否有差異；剖殺所有鵝，檢查注射部位疫苗吸收情況、是否有病理變化；每組隨機篩選10只雛鵝稱重后飼養(yǎng)至1月齡，統(tǒng)計成活率及相對日增重，比較免疫組與對照組雛鵝成活率及平均相對日增重的差異。
1.2單劑量重復(fù)接種安全實驗
每批疫苗分別選取3-5日齡雛鵝10只、1月齡鵝10只、7月開產(chǎn)種鵝10只、9月齡產(chǎn)蛋種鵝10只，雛鵝每只胸部肌肉注射0.2ml，其余鵝每只胸部肌肉注射疫苗1.0ml，第一次接種后14日，每組以相同方法、相同劑量再接種一次，每 組均另取10只相同來源、相同日齡的鵝，作為非免疫對照組。第二次注射后連續(xù)觀察21日，每日觀察各組鵝精神狀況、飲水、進食量等情況；第二次免疫后7日、14日、21日觸摸檢查各免疫組鵝注射部位，檢查是否有紅腫等局部注射反應(yīng)；免疫前與第二次免疫后21日稱重，比較免疫組與非免疫對照組鵝平均增重是否有差異(用SPSS軟件比較)；產(chǎn)蛋種鵝免疫組與非免疫組產(chǎn)蛋率是否有差異；分別任取每批次疫苗免疫后21日種鵝所產(chǎn)鵝胚20枚，做好標(biāo)記，比較鵝胚孵化率是否有差異；剖殺所有鵝，檢查注射部位疫苗吸收情況、是否有病理變化；每組隨機篩選10只雛鵝稱重后飼養(yǎng)至1月齡，統(tǒng)計成活率及相對日增重，比較免疫組與對照組雛鵝成活率及平均相對日增重的差異。
1.3雙倍劑量一次接種的安全實驗
每批疫苗分別選取3～5日齡雛鵝10只、1月齡鵝10只、7月開產(chǎn)種鵝10只、9月齡產(chǎn)蛋種鵝10只，3～5日齡雛鵝每只胸部肌肉注射0.4ml(按照相對體重進行免疫劑量調(diào)整)，其余鵝每只胸部肌肉注射疫苗2.0ml，每組均另取10只相同來源、相同日齡的鵝，作為非免疫對照組。注射后連續(xù)觀察21日，每日觀察各組鵝精神狀況、飲水、進食量等情況；免疫后7日、14日、21日觸摸檢查各免疫組鵝注射部位，檢查是否有紅腫等局部注射反應(yīng)；免疫前與免疫后21日稱重，比較免疫組與非免疫對照組鵝平均增重是否有差異(用SPSS軟件比較)；產(chǎn)蛋種鵝免疫組與非免疫組產(chǎn)蛋率是否有差異；分別任取每批次疫苗免疫后21日種鵝所產(chǎn)鵝胚20枚，做好標(biāo)記，比較鵝胚孵化率是否有差異；剖殺所有鵝，檢查注射部位疫苗吸收情況、是否有病理變化；每組隨機篩選10只雛鵝稱重后飼養(yǎng)至1月齡，統(tǒng)計成活率及相對日增重，比較免疫組與對照組雛鵝成活率及平均相對日增重的差異。
2實驗結(jié)果
2.1單劑量一次性接種的安全實驗
3批疫苗每批分別單劑量一次性接種不同年齡段鵝，連續(xù)飼養(yǎng)觀察21日，所有免疫組鵝，精神狀態(tài)正常，采食和飲水正常，未出現(xiàn)任何全身不良反應(yīng)。在免疫后7日、14日和21日，用手觸摸接種部位，均未發(fā)現(xiàn)腫脹。免疫后21日， 剖檢注射部位均無疫苗顆粒存在，所有免疫鵝注射部位局部均無水腫、滲出、出血。免疫組與非免疫組鵝平均日增重用SPSS軟件比較，沒有明顯差異。9月齡產(chǎn)蛋種鵝接種后，各免疫組在疫苗免疫后1周內(nèi)種鵝產(chǎn)蛋數(shù)較非免疫組少2～3枚，隨后逐漸恢復(fù)正常，免疫后21日各免疫組種鵝產(chǎn)蛋數(shù)與非免疫組比較無顯著差異(見表1)。種鵝所產(chǎn)鵝胚每組20枚，三批次疫苗免疫組分別孵出17、16、17只雛鵝，非免疫對照組孵出17只雛鵝，免疫組與非免疫組雛鵝孵化率均在80％～85％，無差異。
表1單劑量一次性接種主動免疫種鵝安全實驗
2.2單劑量重復(fù)接種安全實驗
3批疫苗每批分別單劑量重復(fù)接種3～5日齡、1月齡、7月齡、9月齡種鵝，所有免疫組鵝，精神狀態(tài)正常，采食和飲水正常，未出現(xiàn)任何全身不良反應(yīng)。在免疫后7日、14日和21日，用手觸摸接種部位，均未發(fā)現(xiàn)腫脹。免疫后21日剖檢注射部位，均無疫苗顆粒存在，所有免疫鵝注射部位局部均無水腫、滲出、 出血。免疫組與非免疫組鵝平均日增重用SPSS軟件比較，沒有明顯差異。9月齡產(chǎn)蛋種鵝接種后，各免疫組在疫苗免疫后1周內(nèi)種鵝產(chǎn)蛋數(shù)較非免疫組少2～3枚，隨后逐漸恢復(fù)正常，免疫后21日各免疫組種鵝產(chǎn)蛋數(shù)與非免疫組比較無顯著差異(見表2)。種鵝所產(chǎn)鵝胚每組20枚，三批次疫苗免疫組分別孵出18、17、17只雛鵝，非免疫對照組孵出17只雛鵝，免疫組與非免疫組雛鵝孵化率均在85％～90％，無差異；雛鵝孵出均隔離觀察5日，被動免疫組與對照組雛鵝精神、采食、飲水均正常，無差異。
表2單劑量重復(fù)接種安全實驗
2.3雙倍劑量接種安全實驗
3批疫苗每批分別按照0.4ml/只接種3～5日齡雛鵝，按照雙倍劑量接種1月齡、7月齡、9月齡種鵝，所有免疫組鵝，精神狀態(tài)正常，采食和飲水正常，未出現(xiàn)任何全身不良反應(yīng)。在免疫后7日、14日和21日，用手觸摸接種部位，均未發(fā)現(xiàn)腫脹。免疫后21日剖檢注射部位，3批次疫苗免疫1、7、9月齡種鵝均有1～3只接種部位延肌纖維走向有少量乳黃色疫苗顆粒未吸收，其他種鵝接種 部位均無疫苗顆粒存在，所有免疫鵝注射部位局部均無水腫、滲出、出血。免疫組與非免疫組鵝平均日增重用SPSS軟件比較，沒有明顯差異。9月齡產(chǎn)蛋種鵝接種后，各免疫組在疫苗免疫后1周內(nèi)種鵝產(chǎn)蛋數(shù)較非免疫組少2～3枚，隨后逐漸恢復(fù)正常，免疫后21日各免疫組種鵝產(chǎn)蛋數(shù)與非免疫組比較無顯著差異(見表3)。種鵝所產(chǎn)鵝胚每組20枚，三批次疫苗免疫組分別孵出17、18、17只雛鵝，非免疫對照組孵出17只雛鵝，免疫組與非免疫組雛鵝孵化率均在85％～90％，無差異；雛鵝孵出均隔離觀察5日，被動免疫組與對照組雛鵝精神、采食、飲水均正常，無差異。
表3雙倍劑量重復(fù)接種安全實驗
上述結(jié)果表明，用GPV3毒株最高允許的生產(chǎn)種毒代次F25代，生產(chǎn)的3批次小鵝瘟滅活疫苗(TZ10株)對種鵝是安全的，免疫后不引起種鵝任何全身和局部不良反應(yīng)，均不影響種鵝的生產(chǎn)性能，表明采用該疫苗生產(chǎn)工藝在實驗室制備的疫苗能夠達到對鵝的安全性要求。根據(jù)上述實驗結(jié)果暫定該疫苗的安全性實驗規(guī)程為：用1月齡左右小鵝瘟瓊擴抗體陰性的健康鵝10只，每只各胸部肌肉注射疫苗2ml，觀察21日，應(yīng)不出現(xiàn)因注射疫苗引起的局部和全身不良反應(yīng)。
二、疫苗效力實驗
小鵝瘟油乳劑滅活疫苗(TZ10株)，批號分別為TZ-001、TZ-002、TZ-003共3批，均由我公司研發(fā)中心實驗室制備。小鵝瘟瓊擴抗體陰性8月齡健康開產(chǎn)種鵝，均購自高郵市心連心鵝業(yè)合作社。小鵝瘟病毒TZ10株F3病毒液(病毒含量104.83ELD50/0.2ml)，由公司研發(fā)中心實驗室制備。小鵝瘟瓊擴抗原、陽性血清均由公司研發(fā)中心制備。
1實驗方法
1.1分組與免疫選取8月齡健康開產(chǎn)種鵝80只(小鵝瘟瓊擴抗體陰性)，隨機分成4組，每組20只。任選三組分別免疫TZ-001、TZ-002、TZ-003批次疫苗，胸部肌肉注射1ml/只，剩余一組為非免疫對照組，各實驗組鵝分別做好標(biāo)記。
1.2 GPV瓊擴抗體檢測
1.2.1種鵝血清GPV瓊擴抗體檢測
各實驗組鵝自疫苗免疫后每周逐只采血至免疫后28日，分離血清，用滅菌生理鹽水進行倍比稀釋，按照小鵝瘟滅活疫苗(TZ10株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中附注2的方法檢測GPV瓊擴抗體。
1.2.2鵝蛋卵黃GPV瓊擴抗體檢測
每組分別任取免疫后4～5周內(nèi)種鵝所產(chǎn)鵝蛋10枚(連同對照組)，每枚蛋 分別取卵黃1ml，加入等量滅菌生理鹽水混勻，取50μl于96孔稀釋板上進行倍比稀釋，按照小鵝瘟滅活疫苗(TZ10株)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中附注2的方法檢測GPV瓊擴抗體。
1.2.3 3日齡雛鵝被動免疫攻毒實驗
每組分別任取免疫后4～5周內(nèi)種鵝所產(chǎn)鵝蛋20枚(連同對照組)，做好標(biāo)記，置38℃孵化箱孵化29～30日，將每組剛孵出的雛鵝任選10只戴上腳標(biāo)，置于攻毒區(qū)隔離器中飼養(yǎng)3日，每組雛鵝逐只采血，分離血清，檢測GPV瓊擴抗體。同時進行攻毒實驗，用GPV-TZ10 F3攻毒株(每毫升尿囊液病毒含量104.83ELD50/0.2ml)，每只雛鵝口服0.5ml，頸部皮下注射0.5ml，免疫組與對照組分別隔離飼養(yǎng)14日，每日觀察記錄雛鵝臨床癥狀。攻毒后14日，被動免疫攻毒組每組應(yīng)至少8只雛鵝健活，非被動免疫攻毒組應(yīng)至少8只雛鵝發(fā)病死亡，剖檢可見典型小鵝瘟腸道病變。
2實驗結(jié)果
2.1種鵝血清GPV瓊擴抗體檢測
每批次疫苗免疫后1周，每組20只種鵝分別有7～11只血清原液出現(xiàn)瓊擴沉淀線；首免后2周每組20只種鵝分別有16～17只血清出現(xiàn)瓊擴沉淀線，瓊擴抗體效價在20～22，3批次疫苗免疫組GPV瓊擴抗體幾何平均值在0.7log2～1.0log2；免疫后3周每組20只種鵝血清均出現(xiàn)瓊擴沉淀線，瓊擴抗體效價在21～24,3批次疫苗免疫組GPV瓊擴抗體幾何平均值在2.2log2～2.6log2；免疫后4周每組20只種鵝血清瓊擴抗體效價均在22～25,3批次疫苗免疫組GPV瓊擴抗體幾何平均值在3.3log2～3.6log2；非免疫對照組20只種鵝血清GPV瓊擴抗體均為陰性，結(jié)果見表4。
表4種鵝血清GPV瓊擴抗體效價
注：“+”表示血清原液出現(xiàn)瓊擴沉淀線，“-”表示未出現(xiàn)瓊擴沉淀線，“/”表示平均值太小，不計算。
2.2鵝蛋卵黃GPV瓊擴抗體檢測
每批次疫苗免疫組免疫后3～4周內(nèi)任取10枚鵝蛋，其卵黃GPV瓊擴抗體均為陽性，效價在22～24，非免疫對照組10枚鵝蛋卵黃GPV瓊擴抗體均為陰性，結(jié)果見表5。
表5免疫后3～4周內(nèi)鵝蛋卵黃GPA瓊擴抗體效價
2.3 3日齡雛鵝被動免疫攻毒實驗
2.3.1 3日齡雛鵝血清GPV瓊擴抗體檢測
3批疫苗被動免疫組每組10只雛鵝血清均GPV瓊擴抗體陽性，效價在22～24，結(jié)果見表6。
表6日齡雛被動免疫血清GPV瓊擴抗體效價
2.3.2 3日齡雛鵝被動免疫攻毒實驗
3批疫苗被動免疫組每組10只雛鵝攻毒后采食、飲水、精神狀態(tài)均正常，無小鵝瘟臨床癥狀發(fā)生，攻毒后14日每組均10/10健活。非被動免疫對照組雛鵝攻毒后第3日精神開始出現(xiàn)精神萎靡、臥地聚堆、站立不穩(wěn)、采食、飲水開始減少，排稀灰白色或黃綠色糞便，攻毒后第5日出現(xiàn)死亡，至攻毒后10日共死亡9只雛鵝。每只病死鵝剖檢，心、肝、脾等實質(zhì)性器官肉眼病變不明顯，腦殼均充血、出血，尤其小腦部顯著，腸道小腸段有部分腸管外觀較正常腸道粗大，質(zhì)地較硬，剖開可見小鵝瘟典型的淡灰或淡黃色纖維素性樣栓塞，易于剝離，腸粘膜光滑，栓子切面層層纖維素性滲出物與壞死物凝固而成的假膜。被動免疫攻毒保護結(jié)果見表7。
表7雛鵝被動免疫攻毒實驗結(jié)果
上述實驗結(jié)果證明，3批次疫苗對種鵝均具有很好的免疫效果，使雛鵝出雛時血清中即含有較高水平的GPV抗體，可以有效的抵抗小鵝瘟病毒攻擊。