本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及Ad-sAxl在子癇前期大鼠模型的建立中的應(yīng)用及子癇前期大鼠模型的建立方法。

背景技術(shù)：

子癇前期是以妊娠20周后出現(xiàn)血壓升高和蛋白尿?yàn)橹饕卣鞯娜焉锲谔赜屑膊?，可累及全身多個(gè)器官，嚴(yán)重威脅母胎健康。子癇前期發(fā)病機(jī)制尚不明確，但目前研究認(rèn)為其發(fā)生與早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙及螺旋動(dòng)脈重鑄障礙密切相關(guān)，而機(jī)體廣泛的血管內(nèi)皮損傷是該疾病進(jìn)一步發(fā)展并呈現(xiàn)出多種程度不一臨床表現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中促血管生成與抗血管生成的失衡不僅在局部影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及螺旋動(dòng)脈重鑄，還能引起機(jī)體廣泛的血管內(nèi)皮損傷，是子癇前期發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。

由于人體實(shí)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)制約，動(dòng)物模型成為研究子癇前期發(fā)生發(fā)展及探索防治措施的重要工具，然而目前并沒有能很好反應(yīng)子癇前期這種疾病嚴(yán)重程度的動(dòng)物模型。鋸齒類動(dòng)物胎盤形成方式與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲程度與人類接近，母體有子宮小血管重塑的表現(xiàn)，造模成功后，可部分或全部出現(xiàn)子癇前期的關(guān)鍵表型。既往采用的子癇前期大鼠模型為通過大鼠尾靜脈注射腺病毒構(gòu)建的sFlt-1，但此模型一般不會(huì)出現(xiàn)多器官臟器的損害，不能很好的反應(yīng)該疾病的嚴(yán)重程度。

Axl為受體酪氨酸激酶亞家族成員，與其受體Gas6結(jié)合后具有促血管生成、維持血管通透性和完整性的作用。sAxl為Axl的可溶性成分，研究證實(shí)sAxl可與Gas6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而阻斷Axl與Gas6的結(jié)合，抑制Gas6-Axl介導(dǎo)的信號(hào)通路，最終導(dǎo)致血管生成異常、動(dòng)脈重鑄障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及血管通透性改變。我們前期研究表明sAxl在子癇前期患者血漿中顯著升高并可反映該疾病的嚴(yán)重程度，這為建立sAxl的子癇前期動(dòng)物模型奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)通過大鼠尾靜脈注射腺病毒構(gòu)建的sFlt-1建立的子癇前期大鼠模型不會(huì)出現(xiàn)多器官臟器的損害，不能很好的反應(yīng)該疾病的嚴(yán)重程度的問題，提供一種通過尾靜脈注射Ad-sAxl至孕母鼠體內(nèi)構(gòu)建子癇前期的大鼠模型及子癇前期的大鼠模型具體建立方法，該子癇前期的大鼠模型具有血壓升高、蛋白尿及心、肝、腎等重要臟器損害等子癇前期的特征性癥狀和體征改變，與人類子癇前期的癥狀體征及病理過程相符，并能反應(yīng)疾病的系統(tǒng)性和嚴(yán)重程度，操作可控性好、穩(wěn)定性佳?？捎糜谘芯孔影B前期的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治措施。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種Ad-sAxl在子癇前期大鼠模型的建立中的應(yīng)用。本發(fā)明首次將Ad-sAxl應(yīng)用于子癇前期大鼠模型的建立中。

一種子癇前期大鼠模型的建立方法，包括如下步驟：

（1）選擇清潔級(jí)SD大鼠，雌雄合籠比例1:3，當(dāng)同時(shí)觀察到陰栓及精子確定妊娠并定為妊娠0天；

（2）在大鼠孕第8天經(jīng)尾靜脈注射Ad-sAxl；

（3）監(jiān)測(cè)其血壓、尿蛋白、生化指標(biāo)，觀察主要臟器病理改變來確定模型構(gòu)建

是否成功。

優(yōu)選的，在步驟（1）中，所述的SD大鼠體重為250-280g，周齡8周。

優(yōu)選的，在步驟（2），所述Ad-sAxl的劑量為2×10⁹ pfu。

所述方法還包括通過檢測(cè)孕0天體重確定大鼠體重基線值，通過檢測(cè)孕前及孕1、3、5、7天血壓確定血壓基線值，通過檢測(cè)孕前及孕4天的24小時(shí)尿蛋白確定尿蛋白的基線值。

本發(fā)明中，確定子癇前期大鼠模型建立是否成功的方法包括檢測(cè)注射Ad-sAxl后大鼠的無創(chuàng)血壓、有創(chuàng)血壓、24小時(shí)尿蛋白；孕19天孕鼠體重、外周血血常規(guī)、生化指標(biāo)；孕19天行剖宮產(chǎn)取出仔鼠計(jì)數(shù)并測(cè)頂臀長(zhǎng)、體重、胎盤稱重及通過組織病理學(xué)觀察大鼠主要臟器的病理改變。

在孕9、11、13、15、17天用無創(chuàng)血壓檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)大鼠無創(chuàng)血壓，孕12、16天監(jiān)測(cè)24小時(shí)尿蛋白；孕19天測(cè)孕鼠有創(chuàng)血壓。

所述主要臟器包括心臟、肝臟、腎臟、胎盤。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明通過尾靜脈注射Ad-sAxl至孕母鼠體內(nèi)，構(gòu)建子癇前期的大鼠模型，建立的子癇前期大鼠模型具有血壓升高、蛋白尿及心、肝、腎等重要臟器損害等子癇前期的特征性癥狀和體征改變，與人類子癇前期的癥狀體征及病理過程相符，并能反應(yīng)疾病的系統(tǒng)性和嚴(yán)重程度，操作可控性好、穩(wěn)定性佳?？捎糜谘芯孔影B前期的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治措施。

本發(fā)明的雌雄合籠比例控制為1:3，能最大程度保障交配成功率，從而保證模型建立實(shí)驗(yàn)的有序進(jìn)行，避免實(shí)驗(yàn)過程長(zhǎng)時(shí)間不能交配成功導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期加長(zhǎng)的問題。

大鼠妊娠分為妊娠早期（孕0-7天)，妊娠中期（孕8-14天）和妊娠晚期（孕15-21天），而人類子癇前期的發(fā)病是在妊娠20周及以后（相當(dāng)于妊娠中期的早期）本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)踐研究，選擇在大鼠孕第8天經(jīng)尾靜脈注射Ad-sAxl，相當(dāng)于大鼠的妊娠中期（8-14），另經(jīng)尾靜脈注射Ad-sAxl能保證血液中維持恒定濃度的Ad-sAxl，因此，在大鼠孕第8天經(jīng)尾靜脈注射Ad-sAxl能最大程度模擬人類子癇前期的發(fā)病，保證模型的可靠性。

2、大量實(shí)踐研究證明，本發(fā)明選用體重為250-280g，周齡8周的SD大鼠，這一體重和周齡的大鼠具有最強(qiáng)的生殖能力，充分滿足實(shí)驗(yàn)的需要。

3、Ad-sAxl劑量過小會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)孕鼠不能出現(xiàn)所有的血壓升高、24小時(shí)尿蛋白增加及機(jī)體重要臟器病理改變，影響建立得到的大鼠模型的可靠性；又因?yàn)锳d-sAxl成本昂貴，如果劑量過大，則會(huì)大幅度增加建立模型的成本，不利于后期推廣使用，本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)踐研究，發(fā)現(xiàn)在Ad-sAxl的劑量為2×10⁹ pfu的情況下，既能使實(shí)驗(yàn)孕鼠出現(xiàn)血壓升高、24小時(shí)尿蛋白增加及機(jī)體重要臟器的病理改變，符合子癇前期的病理改變；Ad-sAxl的成本又得到了有效的控制。

4、本發(fā)明在孕9、11、13、15、17天用無創(chuàng)血壓檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)大鼠血壓，孕12、16天監(jiān)測(cè)24小時(shí)尿蛋白；孕19天測(cè)孕鼠有創(chuàng)血壓，能客觀反映干預(yù)后實(shí)驗(yàn)孕鼠的動(dòng)態(tài)血壓變化情況及24小時(shí)尿蛋白的動(dòng)態(tài)變化情況從而使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、可信，更有說服力。

附圖說明

圖1為SD大鼠收縮壓測(cè)定值變化圖；

圖2為SD大鼠舒張壓測(cè)定值變化圖；

圖3為SD大鼠24小時(shí)尿蛋白測(cè)定值變化圖；

圖4為Ad-sAxl組SD大鼠腎臟HE染色病理變化圖；

圖5為Ad-Fc組SD大鼠腎臟HE染色病理變化圖；

圖6為生理鹽水組SD大鼠腎臟HE染色病理變化圖；

圖7為Ad-sAxl組SD大鼠腎臟CD31免疫熒光染色病理變化圖；

圖8為Ad-Fc組SD大鼠腎臟CD31免疫熒光染色病理變化圖；

圖9為生理鹽水組SD大鼠腎臟CD31免疫熒光染色病理變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。

主要試劑及材料：清潔級(jí)SD大鼠（成都達(dá)碩生物科技有限公司）、重組腺病毒載體（Ad-sAxl）由上海吉?jiǎng)P基因公司合成、尿蛋白測(cè)定（美國(guó)Sigma公司）。

主要儀器：BP-98A型智能無創(chuàng)血壓-鼠儀（北京軟隆生物科技有限公司）、BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（BL系列生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司）、大鼠代謝籠（四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）、全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀BC-3000（深圳邁瑞生物醫(yī)療公司）、全自動(dòng)生化分析儀BS-200（深圳邁瑞生物醫(yī)療公司）、掃描電子顯微鏡（日本Olympus公司）。

子癇前期大鼠模型的建立和鑒定：

（1）選取周齡8周的SD大鼠，體重250-280g，按雌雄合籠比例1:3，確定妊娠后將雌鼠隨機(jī)分為3組，每組6只雌鼠，孕0天行體重測(cè)量，孕前及孕1、3、5、7天監(jiān)測(cè)血壓，孕前及孕4天監(jiān)測(cè)24小時(shí)尿蛋白；

（2）在大鼠孕第8天經(jīng)尾靜脈分別注射2×10⁹ pfu的Ad-sAxl（實(shí)驗(yàn)組）、Ad-Fc（載體對(duì)照組）及生理鹽水（空白對(duì)照組）；

（3）在孕9、11、13、15、17天用無創(chuàng)血壓檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)大鼠血壓，孕12、16天監(jiān)測(cè)24小時(shí)尿蛋白；孕19天測(cè)孕鼠有創(chuàng)血壓、稱重，并取孕鼠外周血行血常規(guī)、生化指標(biāo)測(cè)定；孕19天行剖宮產(chǎn)取出仔鼠計(jì)數(shù)并測(cè)頂臀長(zhǎng)、體重、胎盤稱重，同時(shí)通過組織病理學(xué)觀察機(jī)體主要臟器的病理改變。

結(jié)果分析：

1、血壓測(cè)定值變化

將如圖1、圖2所示的血壓測(cè)定值計(jì)算，^*：P< 0.05，Ad-sAxl組與Ad-Fc組比較；^#：P< 0.05 ，Ad-sAxl組與生理鹽水組比較。

2、大鼠尿蛋白測(cè)定值變化

如圖3所示并計(jì)算， ^*：P< 0.05，Ad-sAxl組與Ad-Fc組比較；^#：P< 0.05，Ad-sAxl組與生理鹽水組比較。

3、大鼠腎臟病理變化

在孕19天分別做大鼠腎臟HE染色及大鼠腎臟CD31免疫熒光染色，40倍顯微鏡下觀察。如圖4-6所示，Ad-sAxl組大鼠腎臟可見系膜區(qū)細(xì)胞數(shù)目增多，腎小球輕微腫脹，Ad-Fc組和生理鹽水組大鼠腎臟未見明顯異常。如圖7-9所示，Ad-sAxl組腎小球血管未見有明顯的熒光表達(dá)，Ad-Fc組和生理鹽水組中箭頭所示處腎小球血管有CD31熒光表達(dá)。

4、大鼠胎盤結(jié)果分析

孕19天行剖宮產(chǎn)取出的胎盤計(jì)數(shù)稱重，Ad-sAxl實(shí)驗(yàn)組、Ad-Fc載體對(duì)照組和生理鹽水組之間大鼠胎盤數(shù)目無明顯差異（P＞0.05），而Ad-sAxl實(shí)驗(yàn)組大鼠的胎盤重量（0.32±0.06g）顯著低于Ad-Fc陰性對(duì)照組（0.52±0.08g）和生理鹽水組（0.54±0.07 g），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

5、將各組檢測(cè)得到的孕19天行剖宮產(chǎn)取出仔鼠計(jì)數(shù)并測(cè)頂臀長(zhǎng)、體重、仔鼠重量并統(tǒng)計(jì)在下表1中；

表1 仔鼠個(gè)數(shù)、重量及頂臀長(zhǎng)比較（n=6，±SD）

經(jīng)計(jì)算，^*：P< 0.05，Ad-sAxl組與Ad-Fc組比較；

^#：P< 0.05，Ad-sAxl組與生理鹽水組比較。

6、孕19天生化指標(biāo)值、血常規(guī)比較

將孕19天檢測(cè)到的生化指標(biāo)值、血常規(guī)統(tǒng)計(jì)在下表2中；

表2 生化指標(biāo)值、血常規(guī)比較（n=6，±SD）

計(jì)算知：

^*：P< 0.05，Ad-sAxl組與Ad-Fc組比較；

^#：P< 0.05，Ad-sAxl組與生理鹽水組比較。

ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；LDH：乳酸脫氫酶；Cr：肌酐；UA:尿素氮；HGB：血紅蛋白濃度；PLT：血小板數(shù)。