本發(fā)明涉及一種油乳劑滅活苗新型佐劑的制備，以及該佐劑在油乳劑滅活苗中的應用方法，該發(fā)明可以實現增強滅活苗免疫效果的技術要求。
背景技術：
我國養(yǎng)殖環(huán)境復雜，動物疫病和農藥、獸藥藥殘對肉食品出口照成嚴重損失。減少動物疾病，避免長期應用抗生素，發(fā)展優(yōu)質、無公害肉食品，才能保證我國養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。
目前，預防和控制動物傳染病除安全措施外，主要依靠疫苗免疫，特別是通過油乳劑疫苗的免疫預防。對于油乳劑滅活苗，通常情況在免疫14天后能夠產生抗體，如何能夠在更短的時間激起免疫，提高免疫效果，需要添加佐劑以增強它們誘導免疫反應的能力。
在滅活苗中，佐劑與抗原同時應用，能夠增強集體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫反應類型。其功能主要有：使用部位招攬免疫細胞和免疫分子，增強免疫應答；增強疫苗抗原傳遞；增進免疫接觸，增強弱抗原的免疫原性和免疫記憶，改變抗原的構型；改變體液抗體的種類、IgG亞型和抗體的親和性，以及細胞免疫和黏膜免疫效應。理想的佐劑不僅沒有免疫原性并能增強機體的免疫應答，能夠使機體獲得最佳的保護性免疫和免疫記憶。有關免疫增強劑方面的研究，目前還是比較多的，主要集中在中藥多糖、細胞因子、干擾素、聚肌胞等，另外還有一種被普遍認可免疫增強劑---轉移因子，目前獸藥行業(yè)已經有多家在批量生產。轉移因子(Thansfer Factor，簡稱TF)是人或動物致敏白細 胞釋放的多種因子中的一種能夠轉移致敏信息的低分子物質。自從1995年Lawrence發(fā)現轉移因子(Transfer factor)以來。人們對轉移因子的研究越來越多。由于其分子量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應、不產生中和抗體且可超越種系界限應用等優(yōu)點，并且在治療免疫缺陷、惡性腫瘤、各種感染性疾病等方面的試驗上均取得一定的療效，因此轉移因子在臨床應用上具有廣闊的前景。
轉移因子具有可透析性，能與抗原結合而本身卻無抗原性。轉移因子帶有致敏淋巴細胞的特異性免疫信息，能夠特異的將供者所具有的抗原性及其敏銳的特異性轉移給一個免疫反應陰性的受者，同時受者產生一遲發(fā)型超敏反應能力。轉移因子具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細胞活性、調節(jié)免疫功能、增強機體非特異性免疫功能等作用，被譽為T細胞活性的觸發(fā)劑，細胞免疫的增強劑、細胞免疫調節(jié)劑及干擾素產生啟動劑。
轉移因子溶液配合弱毒疫苗使用，已經被證實可提高疫苗的免疫效果，但尚未有報道將轉移因子作為油乳劑滅活苗佐劑的研究報道。
技術實現要素：
本發(fā)明為滅活疫苗提供了一種新的免疫佐劑-轉移因子，以及利用該佐劑制備滅活疫苗的新方法。該疫苗不但能夠縮短油乳劑滅活苗的空白期，也能提高滅活苗的抗體滴度，對提高疫苗保護力具有明顯效果。
本發(fā)明是通過如下技術方案實現：
本發(fā)明佐劑的原料組成為：
水相：
轉移因子 94％～96％
吐溫-80 4％～6％
油相：
司本-80 5％～6％
注射用白油 95％～94％
硬脂酸鋁 0.5％～2％
其中所述的原料百分比為體積比；
其中轉移因子的多肽含量為2.5～5.5mg/ml，核糖含量為50～100ug/ml，轉移因子來源為肉雞脾、蛋雞脾、或者豬脾。
其中水相與油相的比例為1∶2～1∶3。
制備完成的佐劑與常規(guī)疫苗按照1∶3～1∶4比例混合乳化制備而成。
取上述原料，按照如下工藝制備成疫苗佐劑
本發(fā)明疫苗佐劑的制備方法為：
取轉移因子稀釋液經過0.22um過濾除菌，按上述比例添加吐溫-80，37℃搖勻，孵育1～2h，制備成水相，油相按照上述比例進行熬制，121℃滅菌30分鐘。在15～35℃下進行乳化，轉速為2500rpm～3500rpm，時間為15～30min。乳化完成后，與常規(guī)疫苗按照1∶3～1∶4的比例混合，繼續(xù)乳化10～15min，乳化轉速為2500rpm～3500rpm，待疫苗劑型及穩(wěn)定性達到要求即可。
本發(fā)明制作的油乳劑疫苗，將轉移因子作為免疫增強劑加入到疫苗中，可以有效提高免疫細胞的應答，加快抗原的遞呈，進而縮短了抗原的免疫空白期，提高了抗體水平，能夠激活免疫系統(tǒng)，消除免疫抑制。
具體實施方式
實施例1：
1.佐劑制備
1.1.將轉移因子稀釋液經過0.22um聚醚砜材質濾芯過濾，取樣做無菌、多肽含量、核糖含量檢測，無菌檢驗全部陰性，多肽含量為2.8mg/ml，核糖含量為58ug/ml。
1.2.將4份滅菌吐溫-80加入到96份轉移因子稀釋液中，混勻，37℃條件下?lián)u勻1h，取出放于室溫。
1.3.將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-806份，121℃滅菌30min。
1.4.將油相與水相按照3∶1比例進行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉速為3000rpm，乳化20min。
2.常規(guī)疫苗制備
2.1.取HA效價為1∶1024的新城疫以及HA效價為1∶1024的禽流感(H9亞型)病毒液分別加入甲醛溶液進行滅活，兩種滅活液分別為48份。
2.2.取4份吐溫-80放于滅菌柜中，121℃滅菌30min后冷卻至室溫，將吐溫-80加到新城疫與禽流感滅活液中，每種加入2份。
2.3將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-806份，121℃滅菌30min。
2.4將油相與水相按照3∶1比例進行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉速為3000rpm，乳化20min。
3.含佐劑疫苗制備
將佐劑與常規(guī)疫苗按照2∶7比例混合，乳化10min，乳化乳化轉速為3000rpm。
對照例1
以常規(guī)疫苗為對照案例，制備工藝同“實施案例1中‘2.常規(guī)疫苗制備’”。
對照例2
1.空白油乳劑制備
1.2.將4份滅菌吐溫-80加入到96份滅菌生理鹽水中，混勻，37℃條件下?lián)u勻1h，取出放于室溫。
1.3.將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-80 6份，121℃滅菌30min。
1.4.將油相與水相按照3∶1比例進行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉速為3000rpm，乳化20min。
2.常規(guī)疫苗制備
2.1.取HA效價為1∶1024的新城疫以及HA效價為1∶1024的禽流感(H9亞型)病毒液分別加入甲醛溶液進行滅活，兩種滅活液分別為48份。
2.2.取4份吐溫-80放于滅菌柜中，121℃滅菌30min后冷卻至室溫，將吐溫-80加到新城疫與禽流感滅活液中，每種加入2份。
2.3將1份硬脂酸鋁加入到94份白油中，加熱待白油透亮后加入司本-806份，121℃滅菌30min。
2.4將油相與水相按照3∶1比例進行乳化，乳化溫度為20℃，乳化轉速為3000rpm，乳化20min。
3.空白對照樣疫苗制備
將空白油乳劑與常規(guī)疫苗按照2∶7比例混合，乳化10min，乳化乳化轉速為3000rpm。
比較實施案例1、對照例1、對照例2質量效果
1形狀
1.1外觀：三者均為乳白色乳劑。
1.2劑型：三者均呈油包水型。在盛有純化水的平皿中，滴兩滴乳劑，觀察其形態(tài)，是否分散，以及分散開的時間。結果顯示兩者形態(tài)均為規(guī)則圓形、不擴散。
1.3黏度：用數字粘度計進行檢測。結果可以看出，本發(fā)明與常規(guī)疫苗的黏度無明顯差別。結果見表1。
1.4穩(wěn)定性：
(1)取10ml疫苗置于離心管中以3000r/min離心15min，管底析出的水相均小于0.5ml。
(2)取疫苗在37℃左右放置21d，結果顯示不分層，沒有破乳現象。
2無菌檢驗
按《中華人民共和國獸藥典》2010版附錄的相關規(guī)定進行檢驗，完全符合，均無細菌生長。
3安全性檢驗
用21日齡SPF雞，每種疫苗免疫10只，每只肌肉注射疫苗1ml，另設空白對照5只。每天觀察，接種后14天剖檢，觀察局部及全身反應以及觀察局部疫苗吸收情況。結果表明，本發(fā)明疫苗與常規(guī)疫苗相比，均沒有出現不良反應。結果見表1
表1三種疫苗物理形狀及安全檢驗對比
4效力檢驗
4.1新城疫部分
血清學方法：用30-60日齡SPF雞，每種疫苗免疫10只雞，每只皮下或肌肉注射20ul，空白對照5只。接種后7、14、21、28日進行采血，分離血清，進行HI抗體效價測定。結果顯示本發(fā)明疫苗比常規(guī)疫苗HI抗體要高出1個滴度左右，常規(guī)疫苗在7天很難激起體液免疫，產生免疫保護，而本發(fā)明在7天有明顯的免疫抗體產生，比對照例高出0.9個滴度，另外抗體離散度也明顯低于對照例，表明本發(fā)明疫苗保護力明顯優(yōu)于常規(guī)疫苗。結果見表2。
表2三種疫苗新城疫部分效力檢驗結果對比
4.2禽流感部分
血清學方法：用3～4周齡SPF雞，每種疫苗免疫10只雞，每只皮下或肌肉注射0.3ml，空白對照5只。接種后7、14、21、28日進行采血，分離血清，進行HI抗體效價測定。結果顯示本發(fā)明疫苗比常規(guī)疫苗HI抗體要高出1個滴度左右，而且抗體離散度較低，表明本發(fā)明疫苗保護力明顯高于常規(guī)疫苗。評價結果見表3。
表3三種疫苗禽流感部分效力檢驗結果對比表
上述結果清楚的表明，本發(fā)明新型佐劑疫苗所顯示的免疫作用與常規(guī)疫苗相比具有三點優(yōu)勢：一是抗體起到快，免疫空白期短；二是抗體滴度高，比常規(guī)疫苗高出1個滴度左右；三是抗體離散度低，抗體水平比較均勻。
綜合評價，本發(fā)明新型佐劑對傳統(tǒng)疫苗的免疫增強作用明顯，對提高疫苗質量，對保護動物健康，對保證我國養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展有重要意義。
上述詳細說明系針對本發(fā)明之一可行實施例之具體說明，惟該實施案例并非以限制本發(fā)明之專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為之等效實施或變更，均包含于本案例之專利范圍中。