技術領域：
本發(fā)明屬于抗體藥物領域，特別是涉及一種新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）三聯(lián)卵黃抗體口服液的制備方法。
背景技術：
：新城疫（Newcastledisease，ND）是由新城疫病毒（NewcastlediseaseVirus，NDV）引起的一種以呼吸道、消化道和神經系統(tǒng)損傷為主要特征的急性、熱性、高度接觸性傳染病，呈全球性流行，可導致15日齡內雛鵝群100%發(fā)病和死亡，被國際動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病，嚴重危害世界各國的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。近年來隨著新城疫疫苗的廣泛應用，新城疫的疫情得到一定的控制，但是伴隨而來的是流行趨勢的變化，主要表現(xiàn)為非典型性ND、新基因型出現(xiàn)、致病性宿主范圍擴大等。禽流感(Avianinfluenza,AI)是由正粘病毒科正粘病毒屬A型流感病毒(AIV)引起的禽類的一種感染綜合征。家禽和野禽均可感染,部分哺乳動物也可感染，病禽可表現(xiàn)為嚴重的呼吸道癥狀、產蛋下降、多系統(tǒng)綜合癥、死亡或隱性感染等多種病型。禽流感的感染有近140年的歷史，1878年，意大利爆發(fā)了全世界第一次高致病性禽流感，在此之后，許多國家和地區(qū)都曾先后報道禽流感的爆發(fā)和流行。根據(jù)禽流感病毒致病性的差異，可將禽流感病毒分為高致病性禽流感病毒（HPAIVs）和低致病性禽流感病毒。高致病性禽流感被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和我國列為A類傳染病，而低致病性禽流感既不是A類疫病，也不是B類疫病。高致病性禽流感一旦發(fā)生會造成家禽的大批死亡,甚至能夠感染人，引起人的死亡，所以各國政府高度重視高致病性禽流感,采取了各種措施嚴密監(jiān)控高致病性禽流感的發(fā)生和流行。而LPAIVs危害程度相對較輕，在某種程度上Ｈ９亞型低致病性禽流感往往被忽視。雞傳染性支氣管炎(infectionbronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒引起的一種急性高度接觸性呼吸道疾病。雞是該病的惟一自然宿主。臨床癥狀表現(xiàn)為氣管啰音、咳嗽、打噴嚏,幼雞流鼻涕,產蛋雞產蛋量和質量下降。該病的高度傳染性和病原的多血清型性,使免疫預防復雜化并費用增加。感染雞生長受阻、飼料消耗增加、產蛋量和蛋的質量下降、死淘率增加,常并發(fā)感染產生氣囊炎,導致肉雞在加工過程中被廢棄,因此該病常給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經濟損失。目前該病是危害養(yǎng)雞業(yè)的幾種主要雞病之一。新城疫－傳染性支氣管炎－禽流感（H9）是養(yǎng)禽業(yè)的大敵。目前應用于防止新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）的抗感染藥品有抗生素、化學合成藥品、中藥及其制劑、卵黃抗體和其他抗感染生物制劑。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的，提供一種適于生產的新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）三聯(lián)卵黃抗體口服液的制備方法，該制備方法簡單，能夠最大程度保留抗體活性。本發(fā)明的技術方案是：一種三聯(lián)卵黃抗體口服液的制備方法，步驟如下：（1）選取無特定病原體蛋雞在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)，對蛋雞進行3次免疫，每次給每只雞注射新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）三聯(lián)疫苗注射劑量分別為0.5ml、1.5ml、2.0ml，每次間隔15天；（2）完成第3次免疫21天后，收集雞蛋，對卵黃中的卵黃抗體進行免疫學檢測，新城疫、禽流感（H9）的卵黃抗體血凝抑制效價達到1:512以上、同時傳染性支氣管炎病毒的卵黃抗體瓊脂擴散效價達到1:32以上的雞蛋為新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）病毒高免雞蛋，收集貯存在16℃條件下備用；（3）使用0.1-0.2%新潔爾滅對高免蛋進行消毒，晾干后打碎雞蛋，取出卵黃，加入卵黃重量10倍的無菌去離子水，并調整pH值至6.00，攪拌5分鐘，在4℃條件下，靜置24小時，過濾取上清液，備用；（4）在室溫條件下，向上清液中加入辛酸，攪拌30分鐘，靜置6小時，依次通過1.0mm、0.45mm、0.22mm的濾膜進行過濾；然后加入甲醛、硫柳汞，使卵黃抗體的水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞的體積比為（95-105）:（0.2-0.3）:（0.2-0.3）:（0.02-0.03），分裝，保存，即得。本發(fā)明的優(yōu)良效果還表現(xiàn)在：本發(fā)明通過對高免蛋卵黃提取、水稀釋處理、辛酸處理后得到澄清的卵黃抗體制劑。水稀釋－辛酸法適用于大型的卵黃抗體生產，并且可以很大程度上保證卵黃抗體的生物活性，對于新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）特異性強，易于市場推廣。具體實施方式下面結合實施例和實驗例詳細說明本發(fā)明的技術方案，但保護范圍不限于此。實施例1：一種三聯(lián)卵黃抗體口服液的制備方法，步驟如下：（1）選取無特定病原體蛋雞在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)，對蛋雞進行3次免疫，每次給每只雞注射新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）三聯(lián)疫苗注射劑量分別為0.5ml、1.5ml、2.0ml，每次間隔15天；（2）完成第3次免疫21天后，收集雞蛋，對卵黃中的卵黃抗體進行免疫學檢測，新城疫、禽流感（H9）的卵黃抗體血凝抑制效價達到1:512以上、同時傳染性支氣管炎病毒的卵黃抗體瓊脂擴散效價達到1:32以上的雞蛋為新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）病毒高免雞蛋，收集貯存在16℃條件下備用；（3）使用0.1-0.2%新潔爾滅對高免蛋進行消毒，晾干后打碎雞蛋，取出卵黃，加入卵黃重量10倍的無菌去離子水，并調整pH值至6.00，攪拌5分鐘，在4℃條件下，靜置24小時，過濾取上清液，備用；（4）在室溫條件下，向上清液中加入辛酸，攪拌30分鐘，靜置6小時，依次通過1.0mm、0.45mm、0.22mm的濾膜進行過濾；然后加入甲醛、硫柳汞，使卵黃抗體的水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞的體積比為95:0.2:0.2:0.02，分裝，保存，即得。實施例2：一種三聯(lián)卵黃抗體口服液的制備方法，步驟如下：（1）選取無特定病原體蛋雞在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)，對蛋雞進行3次免疫，每次給每只雞注射新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）三聯(lián)疫苗注射劑量分別為0.5ml、1.5ml、2.0ml，每次間隔15天；（2）完成第3次免疫21天后，收集雞蛋，對卵黃中的卵黃抗體進行免疫學檢測，新城疫、禽流感（H9）的卵黃抗體血凝抑制效價達到1:512以上、同時傳染性支氣管炎病毒的卵黃抗體瓊脂擴散效價達到1:32以上的雞蛋為新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）病毒高免雞蛋，收集貯存在16℃條件下備用；（3）使用0.1-0.2%新潔爾滅對高免蛋進行消毒，晾干后打碎雞蛋，取出卵黃，加入卵黃重量10倍的無菌去離子水，并調整pH值至6.00，攪拌5分鐘，在4℃條件下，靜置24小時，過濾取上清液，備用；（4）在室溫條件下，向上清液中加入辛酸，攪拌30分鐘，靜置6小時，依次通過1.0mm、0.45mm、0.22mm的濾膜進行過濾；然后加入甲醛、硫柳汞，使卵黃抗體的水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞的體積比為100:0.2:0.2:0.02，分裝，保存，即得。實施例3：一種三聯(lián)卵黃抗體口服液的制備方法，步驟如下：（1）選取無特定病原體蛋雞在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)，對蛋雞進行3次免疫，每次給每只雞注射新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）三聯(lián)疫苗注射劑量分別為0.5ml、1.5ml、2.0ml，每次間隔15天；（2）完成第3次免疫21天后，收集雞蛋，對卵黃中的卵黃抗體進行免疫學檢測，新城疫、禽流感（H9）的卵黃抗體血凝抑制效價達到1:512以上、同時傳染性支氣管炎病毒的卵黃抗體瓊脂擴散效價達到1:32以上的雞蛋為新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）病毒高免雞蛋，收集貯存在16℃條件下備用；（3）使用0.1-0.2%新潔爾滅對高免蛋進行消毒，晾干后打碎雞蛋，取出卵黃，加入卵黃重量10倍的無菌去離子水，并調整pH值至6.00，攪拌5分鐘，在4℃條件下，靜置24小時，過濾取上清液，備用；（4）在室溫條件下，向上清液中加入辛酸，攪拌30分鐘，靜置6小時，依次通過1.0mm、0.45mm、0.22mm的濾膜進行過濾；然后加入甲醛、硫柳汞，使卵黃抗體的水溶液：辛酸：甲醛：硫柳汞的體積比為105:0.3:0.3:0.03，分裝，保存，即得。試驗例本發(fā)明所得一種三聯(lián)卵黃抗體口服液的生物活性試驗研究：（1）耐熱儲存試驗將本發(fā)明的產品置于37℃環(huán)境中，分別保存1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用ND－HI、H9-HI和IBV－AGP測定法，分別測定雞新城疫、禽流感（H9）的卵黃抗體血凝抑制效價及傳染性支氣管炎的卵黃抗體瓊脂擴散效價。結果如表1所示。表1本發(fā)明產品的保存試驗結果：項目1周2周1月2月4月8月12月16月20月24月Ndv1:5121:5121:5121:5121:5121:5121:5121:2561:2561:256H91:5121:5121:5121:5121:5121:5121:5121:2561:2561:256IBV1:321:321:321:321:321:321:161:161:81:8由表1數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明所得復合產品在37℃環(huán)境下，保存12個月內，其分別對新城疫、禽流感血凝抑制作用保持不變，當保存時間為12個月-24個月，其對新城疫、禽流感血凝抑制作用有所下降；同時，由結果可知，本發(fā)明所得復合產品對傳染性支氣管炎的抑制作用時間保持在8個月內穩(wěn)定不變，當保存時間超過8個月，其抑制作用明顯下降。綜上，由耐熱儲存試驗可知，本發(fā)明產品在37℃保存8個月，可以很大程度上保證卵黃抗體的生物活性，對于新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9）特異性強。應當指出的是，具體實施方式只是本發(fā)明比較有代表性的例子，顯然本發(fā)明的技術方案不限于上述實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員，以本發(fā)明所明確公開的或根據(jù)文件的書面描述毫無異議的得到的，均應認為是本專利所要保護的范圍。當前第1頁1 2 3