本發(fā)明屬于凍干疫苗領(lǐng)域，更具體地涉及一種豬瘟口服弱毒凍干疫苗、其制備方法及凍干保護(hù)劑。

背景技術(shù)：

凍干疫苗主要由抗原和凍干保護(hù)劑組成，抗原可以包括蛋白、病毒、細(xì)菌等。目前，獸用凍干疫苗的市場(chǎng)應(yīng)用較為普遍。雖然凍干疫苗具有保存方便、可集中批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但其凍干工藝或凍干效果也存在一些問題，因而制約了凍干苗的發(fā)展?？乖４婧鸵呙鐑龈蛇^程中病毒粒子或細(xì)菌的失活是制約疫苗質(zhì)量的重要因素之一。

為了保持凍干疫苗中病毒或細(xì)菌的免疫反應(yīng)性，減少冷凍干燥對(duì)病毒或細(xì)菌的破壞，在制作凍干活疫苗時(shí)需添加凍干保護(hù)劑，保證疫苗制品中抗原的免疫原性和免疫反應(yīng)性有良好效果。

由于凍干過程時(shí)間較長(zhǎng)，病毒或細(xì)菌的活性會(huì)受其中凍干保護(hù)劑的物理化學(xué)變化的影響，因而增加了凍干保護(hù)劑配方的復(fù)雜性。常用的凍干保護(hù)劑按其作用機(jī)理可分為如下幾類：防凍劑，如甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、二甲亞砜、蔗糖等；抗氧化劑，如維生素C、維生素E、硫代硫酸鈉等；填充劑，如甘露醇、乳糖、明膠等；pH調(diào)節(jié)劑，如磷酸、山梨醇、EDTA、氨基酸等；其他物質(zhì)，如葡聚糖、脫脂乳、谷氨酸鈉、硫脲等。

牛奶、蔗糖、明膠等是我國(guó)常用的傳統(tǒng)生物制品的凍干保護(hù)劑，但是，這些材料的保護(hù)性能一般，而且有的不適用于病毒的凍干保護(hù)。一般來說，適用于病毒的保護(hù)劑主要有蔗糖4％～6％、谷氨酸鈉0.3％、牛血清蛋白0.11％、精氨酸3％、蔗糖5％、明膠0.2％、谷氨酸鈉0.1％，這些成分的不同配伍對(duì)病毒活性的保護(hù)程度也不一。

任何一種病原都有專屬于各自的凍干保護(hù)劑，而根據(jù)病原的抗原性不同，在選擇凍干保護(hù)劑上也有差別。雖然目前針對(duì)豬瘟疫苗的凍干保護(hù)劑 也有多種類型，但這些都是針對(duì)注射型疫苗篩選出的保護(hù)劑。由于豬瘟是消化道疾病，因此有針對(duì)性的誘導(dǎo)消化道部位的免疫反應(yīng)，可以獲得更好的防治效果，這對(duì)于豬瘟疫苗的研發(fā)也是一個(gè)新的突破口。

口服疫苗可通過共同膜機(jī)制遍布全身膜系統(tǒng)，明顯刺激全身性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，可有效激發(fā)腸黏膜免疫。此外，口服疫苗不僅給藥途徑簡(jiǎn)單、安全，而且不會(huì)給免疫個(gè)體引起應(yīng)激等不良反應(yīng)。現(xiàn)有的豬瘟病毒口服疫苗一般是由豬瘟病毒和凍干保護(hù)劑組成，但是，這樣的口服疫苗抗原遞呈效率較差，黏膜免疫效果不好。

在凍干疫苗中，加入黏膜免疫佐劑，開發(fā)口服凍干疫苗，這樣不僅可以使疫苗的保存期延長(zhǎng)，而且可提高其黏膜免疫效果，目前，已報(bào)道的黏膜免疫佐劑主要分為四類：第一類是細(xì)菌性物質(zhì)；第二類是各種細(xì)胞因子；第三類是某些無機(jī)成分；第四類是可增強(qiáng)抗原遞呈的相關(guān)載體。其中應(yīng)用較多的細(xì)菌毒素中作為黏膜免疫佐劑最常使用的是霍亂毒素(Cholera toxin，CT)和大腸桿菌不耐熱腸毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)。

中國(guó)專利CN101560247中已成功構(gòu)建無毒性的LTR72/G192雙突變體，試驗(yàn)證實(shí)，將LTR72/G192蛋白與豬瘟病毒按一定比例配伍后免疫小鼠后，可有效提高小鼠體內(nèi)的抗體水平，特別是黏膜IgA抗體，進(jìn)一步證實(shí)了LTR72/G192蛋白的黏膜佐劑功能。目前，尚無LTR72/G192雙突變體用于凍干疫苗的報(bào)道。

一般添加黏膜免疫佐劑后，會(huì)增加凍干保護(hù)劑篩選的難度。由于病毒和蛋白的結(jié)構(gòu)與功能差異，因此適用于病毒或蛋白的保護(hù)劑一般都不同。不論是豬瘟病毒還是黏膜免疫佐劑，其活性在凍干過程中都容易受損，所以必須篩選出一組既能保護(hù)豬瘟病毒，又能保護(hù)黏膜免疫佐劑活性的凍干保護(hù)劑，才能研制出有效的口服凍干疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種豬瘟口服弱毒凍干疫苗、其制備方法及凍干保護(hù)劑，該豬瘟口服弱毒凍干疫苗能較好的保護(hù)豬瘟病毒(CSFV)的活性，減少活病毒損失，而且在口服免疫小鼠試驗(yàn)中，能誘導(dǎo)更高水平的IgG和IgA抗體，并促進(jìn)胸腺和脾臟中I型干擾素的表達(dá)，具有保護(hù)抗原 活性、提高口服豬瘟抗原免疫效力的作用，可作為口服豬瘟疫苗保護(hù)劑進(jìn)行產(chǎn)業(yè)開發(fā)。

為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種豬瘟口服弱毒凍干疫苗，其包括抗原豬瘟病毒、黏膜佐劑和凍干保護(hù)劑；其中，所述凍干保護(hù)劑包括：1～3wt.％明膠，1～3wt.％甘氨酸，余量為水，所述黏膜佐劑為大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體(LTRG)蛋白。

進(jìn)一步，所述的黏膜佐劑為大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體(LTR72/G192)蛋白，其可作為大多數(shù)病毒、細(xì)菌等抗原的免疫佐劑。

一種豬瘟弱毒凍干疫苗的制備方法，包括如下步驟：

1)獲得豬瘟病毒

設(shè)計(jì)并合成豬瘟病毒的PCR常規(guī)檢測(cè)引物，增殖豬瘟病毒，分離并測(cè)定豬瘟病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量TCID₅₀；

2)配制凍干保護(hù)劑和豬瘟口服弱毒疫苗

將明膠和甘氨酸按上述比例配制凍干保護(hù)劑，除菌；然后將凍干保護(hù)劑與豬瘟病毒、黏膜佐劑混合配制成豬瘟口服弱毒疫苗，并分裝；其中，豬瘟病毒和黏膜佐劑的體積比為25:2～5:6，凍干保護(hù)劑中的明膠和甘氨酸總質(zhì)量與疫苗總體積的比值為0.02～0.04，g/ml；

3)凍干豬瘟口服弱毒疫苗

將配制好的樣品于-80～-40℃進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間24～48h，再進(jìn)行凍干，獲得由豬瘟病毒、黏膜佐劑和凍干保護(hù)劑組成的豬瘟口服弱毒凍干疫苗。

進(jìn)一步，步驟1)中利用PK15細(xì)胞增殖豬瘟病毒。

進(jìn)一步，所述豬瘟病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量為10⁵～10⁶TCID₅₀/0.1ml。

優(yōu)選地，步驟2)中配制的豬瘟口服弱毒疫苗中黏膜佐劑的濃度為4～6μg/0.1ml或400～600μg/0.1ml。

本發(fā)明提供的豬瘟口服弱毒凍干疫苗的凍干保護(hù)劑，包括：1～3％明膠，1～3％甘氨酸，余量為水。

本發(fā)明以CSFV疫苗毒為研究對(duì)象，聯(lián)合無毒性的黏膜佐劑LTR72/G192，與明膠和甘氨酸按一定比例配比凍干，可以同時(shí)很好的保護(hù)CSFV和LTRG活性。

本發(fā)明的凍干保護(hù)劑僅添加了明膠和甘氨酸，但其凍干制品表面平整，均勻一致，避免了添加其他凍干物質(zhì)時(shí)出現(xiàn)的凍干制品萎縮、內(nèi)部孔徑過大、呈蜂窩狀的現(xiàn)象，最小限度的降低了CSFV和LTRG活性的損失，提高了LTRG的佐劑功效，使得CSFV的遞呈更有利。這對(duì)于黏膜免疫是至關(guān)重要的。

明膠屬于聚合物，在本發(fā)明中起到了良好的骨架作用，不僅保護(hù)了CSFV和LTRG蛋白在凍干時(shí)不受加熱的影響，而且防止了配方中的甘氨酸在凍干過程中的碳化和氧化，從而使凍干制品外觀較好。此外，甘氨酸可修復(fù)因凍干受損傷的CSFV和LTRG蛋白的活性，并對(duì)水分子起緩解作用，使凍干制品中含有一定的水分，直接發(fā)揮了保護(hù)抗原的作用。因而，本發(fā)明提高了豬瘟病毒疫苗經(jīng)口服途徑的免疫效果，并進(jìn)一步證實(shí)了LTRG的黏膜佐劑功能。

將本發(fā)明的CSFV凍干苗口服免疫小鼠，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較CSFV組、CSFV+LTRG組更高水平的IgG和IgA抗體，且小鼠脾臟中IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子的表達(dá)量也極顯著高于其他組。因此，在凍干過程中，本發(fā)明的凍干保護(hù)劑中的明膠和甘氨酸對(duì)豬瘟病毒和LTR72/G192蛋白都起到了良好的保護(hù)作用，使黏膜佐劑LTRG充分發(fā)揮其佐劑作用，提高黏膜免疫效果。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的凍干保護(hù)劑成分簡(jiǎn)單，僅添加了明膠和甘氨酸，但其凍干制品表面平整，均勻一致，避免了添加其他凍干物質(zhì)時(shí)出現(xiàn)的凍干制品萎縮、內(nèi)部孔徑過大、呈蜂窩狀的現(xiàn)象。

利用本發(fā)明的凍干保護(hù)劑，能同時(shí)保護(hù)豬瘟病毒和黏膜佐劑的活性，最小限度的降低豬瘟病毒和黏膜佐劑LTRG活性的損失，提高了LTRG的佐劑功效，使得CSFV的遞呈更有利，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的黏膜免疫反應(yīng)，為后續(xù)豬瘟口服疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中的CSFV的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中凍干疫苗的狀態(tài)圖。

圖3為對(duì)比凍干保護(hù)劑1凍干疫苗的狀態(tài)圖。

圖4為對(duì)比凍干保護(hù)劑2凍干疫苗的狀態(tài)圖。

圖5為對(duì)比凍干保護(hù)劑3凍干疫苗的狀態(tài)圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中的口服免疫小鼠的誘導(dǎo)血清IgG水平。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中的口服免疫小鼠誘導(dǎo)黏膜IgA水平。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例中的小鼠脾臟IFN-γ表達(dá)量。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例中的小鼠脾臟IL-4表達(dá)量。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例中的小鼠胸腺IFN-γ表達(dá)量。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例中的小鼠胸腺IL-4表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

材料和試劑：

PK-15細(xì)胞由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所人畜共患病實(shí)驗(yàn)室保存；

豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)購(gòu)自乾元浩生物公司；

DMEM粉末、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibico公司；DL2000DNA Maker、rTaq DNA聚合酶、RNAiso Plus、M-MLV Reverse Transcriptase(RNase H-)、dNTP、PrimeScriptRT reagent Kit RT with gDNA Eraser均購(gòu)自Takara公司。

胰酶購(gòu)自北京拜爾迪公司。

DyLight 488Goat anti-mouse IgG購(gòu)自Biolegend公司。

TransStart Top Green qPCR SuperMix購(gòu)自全式金生物公司。

其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

實(shí)施例 豬瘟口服弱毒凍干疫苗的制備方法及其評(píng)價(jià)，包括：

1.引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)CSFV E2基因序列，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)PCR檢測(cè)引物，PCR產(chǎn)物大小為287bp，具體序列如下：

CSFV-F1:CAGGTATGCGATCTCGTCAACCA

CSFV-R1:GGGCACAGCCCAAATCCGAAGT

根據(jù)小鼠IFN-γ和IL-4基因，分別設(shè)計(jì)并合成1對(duì)IFN-γ和IL-4的熒光定量PCR引物，引物由華大基因科技服務(wù)公司合成，具體序列如下：

IFN-γ-1：CCATCGGCTGACCTAGAGAA

IFN-γ-2：GATGCAGTGTGTAGCGTTCA

IL-4-1：GGTCTCAACCCCCAGCTAGT

IL-4-2：GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT

2.豬瘟病毒CSFV的分離與鑒定

利用PK15細(xì)胞增殖豬瘟病毒CSFV，待PK15單層細(xì)胞融合度達(dá)80％左右時(shí)，棄去細(xì)胞上清，PBS洗滌一次；加入200μl稀釋后的豬瘟活疫苗，37℃吸附1h；然后棄去細(xì)胞上清，加入含2％FBS的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，72h后收毒，將細(xì)胞放于-20℃/室溫反復(fù)凍融3次，然后12000rpm離心10min，去除細(xì)胞碎片，吸取200μl上清繼續(xù)重復(fù)上述操作，進(jìn)行病毒的傳代培養(yǎng)。

參照TAKARA Trizol說明書，進(jìn)行病毒總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，利用合成的CSFV引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

具體反應(yīng)體系為(50μl)：cDNA 10-100ng、上游引物(10pm)2μl、下游引物(10pm)2μl、10×rTaq Buffer 5μl、dNTP 4μl、rTaq DNA polymerase1μl，然后加ddH₂O補(bǔ)齊到50μl。

優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃45s、57℃45s、72℃45s(35個(gè)循環(huán))，72℃延伸10min，最后4℃作用。

利用合成的CSFV的PCR檢測(cè)引物，對(duì)PK15細(xì)胞上繁殖的CSFV進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，能擴(kuò)增出約287bp的特異性條帶，大小正確，與預(yù)期相符，說明在PK15細(xì)胞上成功增殖CSFV。

3.豬瘟病毒TCID₅₀的測(cè)定

將PK15細(xì)胞消化后鋪于96孔細(xì)胞板中，24h后待細(xì)胞長(zhǎng)至80-90％，將CSFV細(xì)胞毒進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后每孔接種100μl病毒液，每個(gè)稀釋度重復(fù)8個(gè)孔，并設(shè)定空白對(duì)照；37℃吸附1h，然后棄去細(xì)胞上清，加入200μl含2％FBS的DMEM維持液，置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3-5d后，棄去96孔細(xì)胞板中上清培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍；每孔加入100μl預(yù)冷的70％乙醇，-20℃固定細(xì)胞15min；棄去固定液，用PBS洗細(xì)胞2遍，每孔加入100μl 1％TritonX-100，4℃孵育10min；棄去孔內(nèi)液體，PBS洗滌2遍，每孔加入100μl鼠抗CSFV多克隆抗體(1：100稀釋)，37℃濕盒孵育2h；棄去一抗，PBS洗3遍，每孔加入100μl Dylight488羊抗鼠IgG二抗(1：2500稀釋)，37℃孵育45min；棄去二抗，PBS洗3遍，然后在熒光顯微鏡下觀察，并按Reed-Muench法計(jì)算TCID₅₀，測(cè)得CSFV的毒價(jià)為10^5.3TCID₅₀/0.1mL。

4.配制凍干保護(hù)劑及CSFV弱毒疫苗

配制本發(fā)明凍干保護(hù)劑：1％明膠，3％甘氨酸，余量為超純水。

同時(shí)配制對(duì)比凍干保護(hù)劑：(1)1％明膠，5％乳糖，余量為超純水；(2)1％明膠，5％乳糖，3％甘氨酸，余量為超純水；(3)1％明膠，余量為超純水。

再將配制好的凍干保護(hù)劑高壓或過濾除菌，然后在超凈臺(tái)中與豬瘟病毒、LTRG蛋白配制成CSFV弱毒疫苗，分裝在潔凈的青霉素瓶中，每瓶裝10頭份，每頭份為0.1ml。其中，凍干保護(hù)劑中的明膠和甘氨酸總質(zhì)量與疫苗總體積的比值為0.02g/ml，CSFV 10⁵TCID₅₀/頭份，LTRG蛋白4μg/頭份。

5.凍干CSFV弱毒疫苗

將配制好的樣品放于-80℃進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時(shí)間30h，然后放入已調(diào)試好的凍干機(jī)中進(jìn)行凍干。

凍干結(jié)束后，對(duì)各凍干制品進(jìn)行外觀檢查，結(jié)果參見圖2～圖5，本發(fā)明凍干保護(hù)劑配方和對(duì)比凍干劑配方(3)的制品表面平整，均勻一致； 而對(duì)比凍干保護(hù)劑配方(1)與配方(3)的制品出現(xiàn)萎縮，內(nèi)部孔徑過大，呈蜂窩狀，各凍干制品用PBS復(fù)溶后，均呈現(xiàn)澄清狀態(tài)。

將不同配方的凍干制品用原體積復(fù)溶，并測(cè)定CSFV滴度。結(jié)果表明，4種凍干苗中CSFV的TCID₅₀分別為10^4.106、10⁴、10^3.7、10^3.38，說明利用本發(fā)明的凍干保護(hù)劑進(jìn)行凍干后，CSFV滴度下降最少，凍干保護(hù)效果好。

6.凍干CSFV弱毒疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

小鼠共35只，每組5只，隨機(jī)分成7組，分別為對(duì)照組、CSFV組、CSFV+LTRG組、本發(fā)明組、對(duì)比配方一組、對(duì)比配方二組、對(duì)比配方三組。

2)免疫劑量

口服免疫，1頭份/只，每只小鼠喂服100μl。免疫前，每只小鼠灌服5％NaHCO₃中和胃酸，2周后，進(jìn)行二免，共免疫2次。

3)樣品的采集與處理

血清的制備：分別在第0、7、14、22、29天斷尾采血，采集的血樣置于4℃過夜，然后5000rpm離心5min，收集血清用于檢測(cè)。

糞便樣品的收集：分別在第0、7、14、22、29天收集各組小鼠糞便，并稱取相同重量的糞便，用400μl PBS溶解，10000rpm離心5min，收集上清用于檢測(cè)。

小鼠脾臟組織的采集：分別在一免后24h、48h、72h時(shí)從各組取一只小鼠，斷頸處死并解剖，采集脾臟組織。

所有樣品保存在-20℃，備用。

4)間接ELISA檢測(cè)血清IgG、肛拭子IgA抗體水平

包被：全病毒疫苗作為包被抗原，置4度包被16小時(shí)后甩掉板孔中溶液，每孔加入洗滌液200μl，靜置3min倒掉，在吸水紙上拍干，共計(jì)洗滌4次。

封閉：每孔加入含5％脫脂乳的PBST 200μl，置37℃封閉2小時(shí)后清洗4次。

加入樣品：血樣用含5％脫脂乳的PBST進(jìn)行20倍稀釋，血清1:20 稀釋、肛拭子1:5稀釋。各取100μl加入到板孔，每個(gè)樣設(shè)2孔，置37℃孵育1.5h后清洗4次。

加入二抗：加入以含5％脫脂乳的PBST稀釋的相應(yīng)酶標(biāo)抗體(Goat anti-Mouse IgG、Goat anti-Mouse IgA)，每孔100μl，置37℃作用1h后清洗。

顯色：每孔加入配制好的顯色液50μl，于37℃避光顯色10分鐘。

終止：每孔加入終止液50μl，10分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果。

5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)ELISA檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異顯著水平取p<0.05，差異極顯著p<0.001。

結(jié)果分析：ELISA結(jié)果顯示，在一免后7天，本發(fā)明組和對(duì)比配方三組小鼠的IgG水平較其他組有極顯著的增高(p<0.01)。對(duì)比配方二組小鼠在二免后7天的IgG水平顯著高于CSFV組和CSFV+LT組(p<0.05)，但仍低于本發(fā)明和對(duì)比配方二組(參見圖6)。

間接ELISA檢測(cè)小鼠糞便IgA抗體水平，結(jié)果參見圖7，可以看出，一免7天、14天后，不同配方組小鼠的糞便IgA水平基本一致，但在二免7天后，本發(fā)明組小鼠的IgA水平與其他組相比有極顯著差異(p<0.01)，二免14天后，對(duì)比配方三組小鼠的IgA較對(duì)比配方二組相比也有顯著升高(p<0.05)。

6)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子變化

將采集的小鼠胸腺和脾臟組織研磨，取250μl研磨后的組織懸液，進(jìn)行總RNA的提取，然后按照TAKARA公司的RT reagent kit with gDNA eraser試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

具體步驟為：首先將提取的總RNA進(jìn)行去除基因組DNA反應(yīng)，在冰上配制反應(yīng)混合液：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl、gDNA Eraser 1.0μl、Total RNA 1μg、RNase Free dH₂O up to 10μl；然后42℃反應(yīng)2min，4℃保存。接著在上述溶液中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl、RT Primer Mix 1.0μl、5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0μl、RNase Free dH₂O 4.0μl，然后在PCR儀上反轉(zhuǎn)錄：37℃反應(yīng)15min，85℃滅活5s，然 后4℃保存。

以上述cDNA為模板，按照TransStart Top Green qPCR SuperMix說明書進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。

具體反應(yīng)體系為：cDNA，2μl；上游引物(10μM)，0.4μl；下游引物(10uM)，0.4μl；2X TransStart Top Green qPCR SuperMix，10μl；Passive Reference Dye(50×)，0.4μl；ddH₂O，6.8μl；Total volume，20μl。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30sec，94℃5sec，60℃34sec(40cycles)。

數(shù)據(jù)分析：采用2^-△△Ct方法對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并利用SPSS19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

結(jié)果分析：利用熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠脾臟和胸腺中IFN-γ和IL-4的表達(dá)差異，結(jié)果如圖8，圖9，圖10，圖11所示，CSFV組、CSFV+LTRG組以及本發(fā)明組的小鼠脾臟和胸腺中IFN-γ和IL-4的表達(dá)量在免疫后12h表達(dá)量最高，而對(duì)照組基本無變化；且本發(fā)明組小鼠脾臟的IFN-γ和IL-4在免疫后12h的表達(dá)量極顯著高于其他組(p<0.01)。

綜上表明，本發(fā)明的凍干保護(hù)劑可在凍干過程中較好的保護(hù)CSFV和LTRG的活性，從而增強(qiáng)小鼠體內(nèi)的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生持久的IgG和IgA抗體水平，本發(fā)明的凍干保護(hù)劑可用作豬瘟弱毒口服疫苗。