用檢測(cè)病毒細(xì)胞感染量評(píng)價(jià)細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力檢驗(yàn)方法。本發(fā)明主要涉及一種用將豬瘟疫苗稀釋后接種適宜的敏感傳代細(xì)胞，然后使用抗原捕獲ELISA檢測(cè)不同稀釋度疫苗中活病毒在感染細(xì)胞后增殖的子代病毒，計(jì)算疫苗病毒的最高細(xì)胞感染劑量，建立了豬瘟疫苗病毒的細(xì)胞感染量（CID）的效力檢驗(yàn)方法；比對(duì)效力檢驗(yàn)，用本發(fā)明提供CID法和現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)兔體感染量檢測(cè)結(jié)果分別為：12批豬睪丸細(xì)胞系源豬瘟活疫苗每頭份均含4×105CID和2.6～3.0×104RID之間，3批牛睪丸原代細(xì)胞源豬瘟活疫苗每頭份均低于4×104CID和7.0～8.0×103RID；試驗(yàn)證明：本實(shí)驗(yàn)室建立的ELISA檢測(cè)CID的結(jié)果與現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)兔體感染量檢測(cè)結(jié)果存在良好的相關(guān)性，能夠較好反映疫苗中活病毒的含量，有望成為RID的替代方法。
【專利說明】用檢測(cè)病毒細(xì)胞感染量評(píng)價(jià)細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本專利涉及一種用檢測(cè)病毒細(xì)胞感染量評(píng)價(jià)細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法。屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種豬的烈性傳染性疾病，感染后的臨床癥狀受不同因素的影響而變化多樣，從急性死亡到隱性感染均可能出現(xiàn)，是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的一種重要?jiǎng)游镆卟?，目前主要以點(diǎn)狀散發(fā)流行為主，流行范圍極廣，全國(guó)各個(gè)養(yǎng)豬地區(qū)幾乎均有發(fā)生。我國(guó)對(duì)于豬瘟的防控措施主要以豬瘟活疫苗大規(guī)模免疫為主，這是豬瘟大規(guī)模爆發(fā)得以控制的主要原因。
[0003]我國(guó)豬瘟兔化弱毒株制備的豬瘟活疫苗是國(guó)際上公認(rèn)的最安全、有效的豬瘟疫苗之一，應(yīng)用十分廣泛，在對(duì)豬瘟的防控中起到了重要的作用，其具有對(duì)不同日齡豬均安全、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)快和可以保護(hù)豬只抵抗豬瘟病毒強(qiáng)毒株的攻擊等優(yōu)點(diǎn)。豬瘟兔化弱毒疫苗在理論上能夠產(chǎn)生極佳的免疫效果，但是為了能夠在臨床使用時(shí)發(fā)揮疫苗的最大作用，就必須實(shí)現(xiàn)對(duì)商品化疫苗質(zhì)量的有效控制。疫苗質(zhì)量控制的一個(gè)重要方面就是要保證所生產(chǎn)疫苗具有符合標(biāo)準(zhǔn)的活病毒效價(jià)，能夠確實(shí)激活被免疫動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。疫苗效力的定義為疫苗接種動(dòng)物獲得保護(hù)自身抵抗感染的能力，或在接種疫苗動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體轉(zhuǎn)移到后代使新生動(dòng)物獲得保護(hù)的能力。對(duì)于弱毒疫苗而言，對(duì)宿主的免疫效力是通過病毒感染宿主細(xì)胞激活免疫系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)的，在一定范圍內(nèi)，感染宿主的疫苗毒越多，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的激活就越強(qiáng)。因此，豬瘟兔化弱毒疫苗的效價(jià)是可以通過確定疫苗中有感染性病毒的數(shù)量(濃度)來衡量的。
[0004]在我國(guó)豬瘟兔化弱毒疫苗效價(jià)的判定目前采用的是以兔體定型熱法和豬免疫攻毒為基礎(chǔ)的動(dòng)物試驗(yàn)的方法，其中以兔體定型熱法的應(yīng)用最為廣泛。但是該方法存在很多弊端，如:檢測(cè)結(jié)果易受兔體個(gè)體差異和環(huán)境因素影響、費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且成本較高等。建立不依賴動(dòng)物試驗(yàn)的效檢替代方法是大勢(shì)所趨，也勢(shì)在必行。對(duì)于活疫苗而言，疫苗的效價(jià)(滴度)取決于疫苗中含有的有感染性微生物數(shù)量(濃度)。產(chǎn)生滿意效果的最小滴度是建立在測(cè)定最小有效劑量研究的基礎(chǔ)上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于建立一種不使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的、重復(fù)性高的、能夠有效反映豬瘟疫苗中有感染性病毒粒子數(shù)量(濃度)的效檢替代方法
[0006]本發(fā)明實(shí)施的技術(shù)方案
[0007]1.一種用檢測(cè)病毒細(xì)胞感染量評(píng)價(jià)細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于:該方法是將傳代豬瘟疫苗稀釋后接種適宜的細(xì)胞系，疫苗中的豬瘟兔化弱毒株病毒通過細(xì)胞增殖后用于病毒細(xì)胞感染量的測(cè)定，該方法檢測(cè)到的活的具有感染性的豬瘟病毒兔化弱毒病毒，其檢測(cè)結(jié)果與疫苗免疫原性直接相關(guān)；
[0008]2.該效檢方法是用豬瘟活疫苗中的豬瘟兔化弱毒株病毒感染細(xì)胞后的上清液或細(xì)胞裂解液用于病毒感染量的測(cè)定；
[0009]3.該檢驗(yàn)方法是用豬瘟抗原捕捉ELISA檢測(cè)感染細(xì)胞中豬瘟病毒兔化弱毒株病毒抗原，評(píng)價(jià)疫苗中病毒的細(xì)胞感染量，該方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性好；
[0010]4.該檢驗(yàn)方法的檢測(cè)樣品是用細(xì)胞系包括豬睪丸細(xì)胞、豬腎細(xì)胞等擴(kuò)繁的豬瘟兔化弱毒株病毒，此類細(xì)胞適合豬瘟病毒增殖。
[0011]本發(fā)明的具體描述
[0012]一、效檢方法的建立
[0013](一)檢驗(yàn)樣品的制備
[0014]按常規(guī)方法消化生長(zhǎng)良好的豬睪丸細(xì)胞系(ST細(xì)胞)，按適當(dāng)細(xì)胞密度接種若干細(xì)胞培養(yǎng)瓶(板)。置于37°C，5%C02溫箱中培養(yǎng)48h至細(xì)胞長(zhǎng)至良好單層。將豬瘟活疫苗用細(xì)胞維持液做10倍系列稀釋至10_7。將10_4?10_7稀釋度的豬瘟兔化弱毒分別接種已培養(yǎng)48h長(zhǎng)至80%?100%單層的正常ST細(xì)胞。每個(gè)稀釋度分別接種4瓶ST細(xì)胞，每瓶細(xì)胞接種4mL稀釋后的病毒液，留4瓶正常ST細(xì)胞以細(xì)胞維持液代替病毒液做相同的接毒處理作為空白對(duì)照，置于37°C、5%C02溫箱中孵育4h后，吸棄病毒液，用維持液潤(rùn)洗三次后(每次以4mL維持液潤(rùn)洗)更換為6mL新鮮維持液，置于37°C、5%C02溫箱中培養(yǎng)。4d后第一次收毒換液，每個(gè)稀釋度取一瓶細(xì)胞收獲一半的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，剩余上清液連同細(xì)胞直接置于-20°C凍結(jié)，反復(fù)凍融三次收獲病毒液，其余每瓶細(xì)胞棄去舊維持液更換新鮮維持液6mL,置于37°C、5%C02溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。此后每隔4d按上述方法收毒換液一次,最后一次收獲時(shí)，取一半的細(xì)胞培養(yǎng)液上清收獲，另一半上清液連同細(xì)胞置于-20 V凍結(jié)保存，凍融三次收獲病毒液。共收獲4次。所有收獲的樣品全部置于_20°C保存待用。
[0015]對(duì)以上制備的所有檢測(cè)樣品采用抗原捕獲ELISA (或稱ELISA)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)所得到的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
[0016](二)檢測(cè)方法
[0017]1.豬瘟抗原捕捉ELISA檢測(cè)感染細(xì)胞中豬瘟病毒
[0018](I)樣品的準(zhǔn)備
[0019]消化生長(zhǎng)良好的ST細(xì)胞，擴(kuò)大接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶(板孔)，置于37°C，5%C02溫箱中培養(yǎng)48h至細(xì)胞長(zhǎng)至良好單層。
[0020]取豬瘟活疫苗凍干制品做10倍系列稀釋至10_7，取10_4?10_7稀釋度分別接種已培養(yǎng)48h長(zhǎng)至80%?100%單層的ST細(xì)胞。置于37°C，5%C02溫箱中吸附4h后，吸棄毒液，更換為含2%血清的MEM維持液，置于37°C，5%C02溫箱中培養(yǎng)。每種疫苗設(shè)空白細(xì)胞對(duì)照。
[0021]4d后做第I次收毒換液，以后每隔4d再收毒換液I次,連續(xù)收獲4次,最后一次收獲時(shí)，吸取一半的上清液，另一半上清液連同細(xì)胞一起凍結(jié)保存。所有收獲的毒液置于-20 °C保存待檢。
[0022](2)待檢樣品的ELISA檢測(cè)
[0023]按照IDEXX豬瘟病毒抗原撲捉ELISA檢測(cè)試劑盒/血清的說明書的說明對(duì)以上第(I)項(xiàng)中制備的各收次樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)。所有樣品均采用37°C孵育2h。為了探索裂解液(BVDVSerumPlus)對(duì)檢測(cè)的影響，對(duì)部分樣品用不同比例的裂解液處理后進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
[0024](3)ELISA檢測(cè)操作步驟方法:按照IDEXX豬瘟病毒抗原撲捉ELISA檢測(cè)試劑盒/血清的說明書的說明書進(jìn)行(見附件I)。
[0025]結(jié)果判定
[0026]①被檢樣品的S-N值等于或小于0.100時(shí)，判為豬瘟病毒抗原陰性。
[0027]②被檢樣品的S-N值大于0.100，小于或等于0.300，判為可疑，之后可用豬瘟病毒特異性方法進(jìn)行確認(rèn)。
[0028]③被檢樣品的S-N值大于0.300時(shí)，判為豬瘟病毒抗原陽性。
[0029](三)效檢 用樣品收次、收獲方式和判定標(biāo)準(zhǔn)的確定
[0030]采用豬瘟病毒抗原血清檢測(cè)試劑盒/血清(IDEXX, USA產(chǎn)品)對(duì)系列稀釋的疫苗接種ST細(xì)胞培養(yǎng)后的第一次、第二次、第三次和第四次收獲(簡(jiǎn)稱一收、二收、三收和四收)的所有樣品進(jìn)行檢測(cè)，按說明書(見附件I)對(duì)陰性、陽性和可疑樣品進(jìn)行判定。采用兩種樣品處理方式進(jìn)行檢測(cè)，一種為樣品原液不經(jīng)過裂解液處理直接檢測(cè)，一種使用IDEXX公司提供的裂解液與樣品原液1:1混合裂解處理后進(jìn)行檢測(cè)。比較裂解液處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。以確定適用于效檢的樣品收次和收獲方式(結(jié)果見表1)。
[0031]表1豬瘟病毒兔化弱毒株接種細(xì)胞后一~四收樣品檢測(cè)結(jié)果
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種用檢測(cè)豬瘟疫苗中所含病毒細(xì)胞感染量來評(píng)價(jià)細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于:該方法是將豬瘟疫苗中豬瘟兔化弱毒稀釋后接種適宜的細(xì)胞系，通過細(xì)胞增殖一定時(shí)間后用于疫苗中病毒細(xì)胞感染劑量的測(cè)定，該方法檢測(cè)到的是活的具有感染性的豬瘟兔化弱毒，其檢測(cè)結(jié)果與疫苗免疫原性直接相關(guān)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用檢測(cè)病毒細(xì)胞感染量評(píng)價(jià)細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于:是用豬瘟疫苗病毒感染細(xì)胞后12天收獲的細(xì)胞上清或細(xì)胞裂解液用于豬瘟疫苗中病毒細(xì)胞感染劑量的測(cè)定。
3.如權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力檢驗(yàn)的方法，其特征在于該檢驗(yàn)方法是用豬瘟抗原捕捉ELISA檢測(cè)感染細(xì)胞中豬瘟病毒抗原，評(píng)價(jià)疫苗活病毒的細(xì)胞感染量，該方法特異性強(qiáng)，可排除死亡病毒和消除非特異性。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用檢測(cè)病毒細(xì)胞感染量評(píng)價(jià)細(xì)胞系源豬瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于該檢驗(yàn)方法是豬瘟兔化弱毒細(xì)胞感染量測(cè)定用傳代細(xì)胞包括豬睪丸細(xì)胞、豬腎細(xì)胞等，該類細(xì)胞適合豬瘟病毒增殖。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103954760SQ201410146130
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】寧宜寶, 王海光, 林旭埜, 馮忠澤, 張毓金, 吳文福, 賴月輝, 陳堅(jiān), 王芳, 陳瑞愛, 孫進(jìn)忠, 漆世華 申請(qǐng)人:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 廣東永順生物制藥股份有限公司