專利名稱：一種熒光定量rt-pcr檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，屬疫苗質(zhì)量檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fevervirus, CSFV)引起的一種急性、發(fā)熱性、高度接觸性的病毒性傳染病。是養(yǎng)豬業(yè)的一種毀滅性傳染病，幾乎遍及全世界，死亡率高達(dá)80% 90%，國際動物衛(wèi)生組織將豬瘟列入A類法定傳染病之一。目前，疫苗接種仍然是預(yù)防和控制豬瘟的重要手段，在20世紀(jì)50年代中期，中國學(xué)者通過將豬瘟石門系強毒在兔體上連續(xù)傳幾百代后培育成功了一株豬瘟兔化弱毒疫苗。該疫苗是國際公認(rèn)的最安全有效的弱毒疫苗，在我國乃至全球得到廣泛應(yīng)用，在1976年在由聯(lián)合國糧農(nóng)組織和歐共體召開的專家會議上，專家一致認(rèn)為中國創(chuàng)制的豬瘟兔化弱毒疫苗的應(yīng)用對控制和消滅歐洲的豬瘟做出了重大貢獻(xiàn)。經(jīng)歷了半個世紀(jì)的風(fēng)雨洗禮，該疫苗的地位和價值至今無可動搖。國內(nèi)使用豬瘟兔化弱毒疫苗，使豬瘟大規(guī)模流行得到了有效的控制，但豬瘟局部地區(qū)流行仍時有發(fā)生，防治豬瘟仍然是我國養(yǎng)豬業(yè)的重要任務(wù)。疫苗病毒抗原含量的高低是疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。傳統(tǒng)的檢驗方法主要是通過疫苗注射后檢測免疫動物血清·來確定疫苗效價，如使用兔體定型熱反應(yīng)法、ELISA、免疫過氧化酶單層實驗、血清中和實驗等，但隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，這些方法已經(jīng)越來越凸顯出其劣勢:如免疫動物后才能確定疫苗的質(zhì)量，需時長，操作過程繁瑣、由于動物個體差異導(dǎo)致準(zhǔn)確度低等，無法滿足現(xiàn)有的需要。各疫苗廠家生產(chǎn)的豬瘟兔化弱毒疫苗的效果存在一定差異，因此，建立Taqman熒光定量RT-PCR技術(shù)來檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的病毒含量，具有極其重要的意義
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種省時、省力，特異性高、重復(fù)性好、敏感度高的熒光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法。本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測豬藍(lán)耳病弱毒疫苗病毒含量的方法的步驟如下:1、通過生物學(xué)軟件DNAstar比對GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的中國國內(nèi)測序的6株豬瘟兔化弱毒的毒株全序列，最終選擇登錄號為AF091507的基因序列，并在其高度保守區(qū)5'端開放閱讀框區(qū)域設(shè)計一對標(biāo)準(zhǔn)品引物(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)以及一對定量用引物(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)和一條探針(SEQ ID N0.5)。引物及探針詳情如表1-1和表1-2。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)濃度的質(zhì)粒；SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4擴增包含于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2擴增產(chǎn)物片段之內(nèi)的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA ； SEQ ID NO:5為Taqman熒光探針，在其5’端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)FAM，3’標(biāo)記猝滅熒光基團(tuán)TAMRA，用于建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測未知樣品；表1-1標(biāo)準(zhǔn)品引物相關(guān)參數(shù)Tabl-1 Parameters of the Standard Primer
權(quán)利要求
1.一種熒光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用于實時熒光定量RT-PCR檢測豬瘟病弱毒疫苗病毒含量的特異性引物、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、確定實驗的成立標(biāo)準(zhǔn)、確定陽性或陰性的判定標(biāo)準(zhǔn)，其具體特征如下: (I)引物特征: SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2能特異性擴增豬瘟兔化弱毒疫苗病毒的cDNA，擴增產(chǎn)物大小為197bp，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)濃度的質(zhì)粒； SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4能特異性擴增包含于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2擴增產(chǎn)物片段之內(nèi)的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA，擴增產(chǎn)物大小為143bp，SEQ ID NO:5為Taqman熒光探針，在其5’端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)FAM，3’標(biāo)記猝滅熒光基團(tuán)TAMRA，用于建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測未知樣品； (2 )標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法: 提取豬瘟兔化弱毒疫苗的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板；以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2為引物，進(jìn)行PCR擴增；將擴增產(chǎn)物純化回收，連接到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5 α內(nèi)，提取質(zhì)粒DNA，獲得豬瘟兔化弱毒疫苗檢測用的標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒； 將制備的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作10倍梯度稀釋 ，以稀釋液為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，采集熒光信號，使用Bio-Rad iQ5軟件繪制出實時熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得其產(chǎn)物Tm值； (3)實驗成立標(biāo)準(zhǔn): 若陽性對照的Ct值< 32，陰性對照的Ct值> 35，電腦繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線各點相關(guān)度大于95%，反應(yīng)效率在80% 120%之間，則說明實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、有效，實驗成立； (4)判定陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn): 在實驗成立的前提下，待測樣品的Ct值< 35，判為陽性；待測樣品的Ct值> 35則判為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 屬疫苗質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括特異性引物及Taqman熒光探針的設(shè)計、RNA提取、cDNA制備、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建、Taqman熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、有效性驗證和結(jié)果判定。設(shè)計合成了兩對引物，均能特異性擴增豬瘟兔化弱毒病毒的cDNA，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2擴增產(chǎn)物大小為197bp，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)濃度的質(zhì)粒，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4擴增產(chǎn)物大小為143bp，包含于前述擴增產(chǎn)物197bp之內(nèi),加入熒光探針SEQ ID NO.5用于Taqman熒光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量。本發(fā)明方法檢測靈敏度高，檢測時間短，能同時進(jìn)行大批量的樣本分析，具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性，適用于各品牌豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的測定。
文檔編號G01N21/64GK103224996SQ20131012340
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者張以芳, 馬志亮, 范斌, 柴俊, 孫亭亭, 鄒豐才, 劉岳, 柳桐, 楊潔 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)