本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種全球范圍內(nèi)常見的慢性病，目前在全球死亡原因中排名第四，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2020年，COPD將在全球疾病發(fā)病中排名第五，死亡原因中排名第三。
COPD是一種不完全可逆的氣流受限特征的疾病，與肺部對有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，其慢性炎癥反應(yīng)遍及氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管。參與COPD的細(xì)胞有中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞被激活后釋放多種炎性介質(zhì)，如白三烯B4(LTB4)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、RANTES、Eotaxin、腫瘤壞死因子α(TNFα)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等，參與肺實(shí)質(zhì)破壞、肺血管等炎癥反應(yīng)。病理變化特征表現(xiàn)為肺泡腔炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)浸潤、小支氣管和細(xì)支氣管周圍灶性炎性細(xì)胞浸潤，肺組織邊緣肺泡腔擴(kuò)張、破壞，肺泡壁變寬，其上皮細(xì)胞腫脹、變圓、部分脫落。COPD與慢性支氣管炎和肺氣腫密切相關(guān)，但定義上有所不同，支氣管哮喘與特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，其氣流受限具可逆性(與慢性氣管炎合并時會出現(xiàn)氣流受限不完全可逆)?，F(xiàn)在尚無藥物能遏制COPD病情的進(jìn)行性發(fā)展，其藥物治療的研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢，目前臨床常常將治療哮喘的藥物用于治療COPD，由于COPD的發(fā)病機(jī)制不同于哮喘，難以取得滿意的療效。
從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2011年發(fā)表(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011) 1502–1505)的化合物，我們對化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗慢性阻塞性肺病活性進(jìn)行了評價，其具有抗慢性阻塞性肺病活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為85％和15％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
長期吸煙是最常見的人類COPD致病因素，我們實(shí)驗室用香煙誘導(dǎo)模擬小鼠COPD模型，擬研究本發(fā)明組合物對香煙誘導(dǎo)的小鼠COPD的緩解作用。
本發(fā)明目的在于提供本發(fā)明組合物在制備抗COPD疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明組合物在劑量10mg/kg下灌胃給藥，對香煙誘導(dǎo)的COPD小鼠BALF中炎性細(xì)胞因子TNFα的生成有抑制作用；對趨化因子RANTES的分泌有抑制作用；對BALF中的炎性細(xì)胞的募集有抑制作用。
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1化合物Schiglautone A的制備
化合物Schiglautone A(I)的制備方法參照Fan-Yu Meng等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011)1502–1505)的方法。
實(shí)施例2Schiglautone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(502mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(7.520g，40.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌8h。8h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(508mg，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.40(s,1H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.53(s,1H),3.85(d,J＝11.2Hz,4H),3.52(d,J＝10.8Hz,4H),2.96(s,1H),2.20(s,1H),2.16(s,2H),2.00(s,1H),1.84(d,J＝13.9Hz,4H),1.69(s,1H),1.58(dd,J＝22.2,8.5Hz,4H),1.51(s,1H),1.47(s,1H),1.26(dd,J＝9.1,4.4Hz,4H),1.21(s,1H),1.08–0.98(m,4H),0.96-0.94(m,9H),0.94-0.85(m,6H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.46(s),209.14(s),170.06(s),161.12(s),143.51(s),132.01(s),127.77(s),85.96(s),82.40(s),70.19(s),69.10(s),57.14(s),52.73(s),51.90(s),45.77(s),40.67(s),38.57(s),38.32(s),35.04(s),33.55(s),33.27(s),29.85(s),28.98(s),26.71(s),25.50(s),24.05(s),22.31(s),21.06(s),20.56(s),20.00(s),18.69(s),18.11(s),15.07(s).
HRMS(ESI)m/z[M-H]-calcd for C34H51Br2O6:715.2032；found 715.2027.
實(shí)施例3Schiglautone A的O-(三唑基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(358mg，0.5mmol)溶于10mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和1,2,3-三氮唑(2760mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶即得到化合物III的黃色膠狀固體(245.7mg,71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ18.00(s,1H),7.96(d,J＝15.5Hz,2H),7.67(d,J＝20.5Hz,2H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.33(s,1H),4.29(d,J＝19.8Hz,2H),4.08(d,J＝4.0Hz,2H),3.83(d,J＝4.8Hz,4H),3.47(s,1H),2.39(d,J＝2.9Hz,3H),2.16(s,1H),1.84(d,J＝0.5Hz,4H),1.68–1.61(m,3H),1.61–1.50(m,3H),1.46(s,1H),1.39(d,J＝11.0Hz,2H),1.30–1.21(m,2H),1.21(s,1H),1.05–0.70(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.62(s),209.42(s),170.24(s),161.39(s),143.68(s),137.15(s),132.19(s),128.04(s),120.80(s),86.24(s),82.58(s),66.14(s),65.60(s),57.43(s),52.89(s),52.18(s),46.47(s),46.06(s),40.83(s),38.85(s),38.50(s),35.31(s),33.72(s),30.12(s),29.15(s),27.00(s),25.66(s),24.33(s),22.49(s),21.33(s),20.73(s),20.29(s),18.85(s),18.39(s),15.25(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C38H57N6O6:693.4340；found:693.4338。
實(shí)施例4Schiglautone A的O-(二(2-甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物的合成
1、Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成
將化合物II(358mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈，加入無水碳酸鉀(0.345g，2.5mmol)，碘化鉀(0.084g，0.5mmol)和二乙醇胺(1.0514g，10mmol)，混合物加熱回流9h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冷水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，依次用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑。產(chǎn)物用硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:1，v/v)，得到Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的淡黃色固體(0.199g,52％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ17.77(s,1H),6.00(s,1H),5.40(s,1H),5.20(s,1H),3.37(d,J＝17.8Hz,4H),3.28(s,8H),2.87(s,1H),2.51(d,J＝6.5Hz,4H),2.43(s,8H),2.24(s,2H),2.06(d,J＝12.7Hz,2H),1.76–1.68(m,5H),1.57(s,1H),1.53–1.39(m,8H),1.36(s,1H),1.24(s,1H),1.20–1.14(m,3H),1.11(s,1H),0.94–0.82(m,10H),0.80(s,3H),0.76(s,3H),0.72(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.39(s),208.98(s),169.80(s),160.73(s),143.02(s),131.42(s),127.05(s),85.91(s),82.25(s),66.70(s),65.63(s),58.62(s),56.55(s),56.61(s),53.30(s),52.45(s),51.52(s),45.29(s),40.06(s),38.52(s),38.17(s),34.73(s),33.17(s),29.35(s),28.38(s),26.34(s),25.00(s),23.45(s),22.05(s),20.67(s),20.07(s),19.31(s),18.41(s),17.73(s),14.59(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H73N2O10:765.5265；found:765.5261。
Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物
2、Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的合成
按照上述步驟制備1g的Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，取Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(382mg，0.5mmol)溶于8mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(0.238g，2mmol)，反應(yīng)物加熱回流2h。將反應(yīng)物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:1，v/v)，得到Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的淡黃色膠狀固體(0.297g，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.87(s,1H),6.01(s,1H),5.50(d,J＝8.4Hz,2H),3.61(s,4H),3.55(s,4H),3.45(s,2H),3.40(s,2H),2.98(s,1H),2.73(d,J＝17.4Hz,4H),2.67–2.57(m,6H),2.54(s,2H),2.40(s,1H),2.10(s,1H),1.99(s,2H),1.78(s,1H),1.73(d,J＝16.9Hz,4H),1.58(d,J＝3.0Hz,2H),1.46(d,J＝3.0Hz,2H),1.43(s,1H),1.37(s,1H),1.22(s,1H),1.17(dd,J＝18.9,11.1Hz,4H),0.95–0.83(m,10H),0.80(d,J＝20.0Hz,3H),0.78(d,J＝20.0Hz,3H),0.73(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.19(s),208.87(s),169.79(s),160.85(s),143.24(s),131.74(s),127.50(s),85.69(s),82.13(s),66.71(s),65.84(s),56.87(s),55.80(s),53.19(s),52.44(s),51.64(s),45.51(s),40.38(s),39.22(s),38.30(s),38.05(s),34.77(s),33.28(s),29.56(s),28.72(s),26.45(s),25.21(s),23.79(s),22.05(s),20.77(s),20.30(s),19.76(s),18.41(s),17.85(s),14.81(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H69Cl4N2O6:839.3880；found:839.3881。
Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物
3、Schiglautone A的O-(二(2-甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物(IV)的合成
按照上述步驟制備1g的Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物，將Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(0.419g，0.5mmol)溶于15mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(0.21g，3mmol)，反應(yīng)物加熱回流3h。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱層析進(jìn)行純化(石油醚/丙酮100:0.2，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.296g，67％)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d1)δ13.21(s,1H),6.02(s,1H),5.48(s,1H),5.44(s,1H),3.45(s,2H),3.38(s,2H),3.00(s,1H),2.57–2.48(m,20H),2.16–2.09(m,4H),1.96(s,12H),1.73(d,J＝15.4Hz,4H),1.55(s,1H),1.44(dd,J＝7.8,2.8Hz,4H),1.35(s,1H),1.29–1.14(m,6H),0.97–0.49(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.72(s),209.42(s),170.36(s),161.38(s),143.79(s),132.31(s),128.03(s),86.24(s),82.70(s),67.24(s),66.39(s),57.44(s),53.73(s),53.00(s),52.69(s),52.17(s),46.06(s),40.95(s),38.84(s),38.61(s),35.32(s),33.82(s),32.41(s),30.13(s),29.25(s),27.00(s),25.77(s),24.34(s),22.59(s),21.33(s),20.85(s),20.28(s),18.96(s),18.40(s),15.35(s),15.03(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H81N2O6S4+:885.4977；found:885.4979。
實(shí)施例5組合物抗慢性阻塞性肺病實(shí)驗
方法：SPF級雌性BALB/c小鼠，18-20g，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、藥物處理組(組合物、化合物III和化合物IV 10mg/kg，灌胃給藥)，每組10只。將小鼠置于4L容器內(nèi)，每日煙熏(南京牌香煙—紅殼，焦油含量小于16mg)，一周五次，連續(xù)四周，每日煙熏前1小時灌胃給藥，小鼠在末次煙熏后1小時，以苯巴比妥鈉麻醉，用0.6mL預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.0)肺部灌流，沖洗3次，吸出支氣管肺泡灌洗液(BALF)，250×g離心10min，上清用于分析TNFα、RANTES的含量。細(xì)胞用PBS緩沖液重懸，計數(shù)，細(xì)胞涂片后用瑞氏-吉姆薩染色，分析BALF中炎性細(xì)胞的變化。
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的85mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的15mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
實(shí)驗例1組合物對COPD小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥介質(zhì)生成抑制作用
(1)組合物對COPD小鼠BALF中TNFα生成抑制作用
前炎性細(xì)胞因子TNFα是COPD的發(fā)病過程中的啟動因子。COPD患者的TNFα水平高于正常人，培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞與香煙的煙霧接觸可分泌TNFα。TNFα可促使中性粒細(xì)胞脫顆粒，誘導(dǎo)起到粘膜細(xì)胞增生和高分泌，增加上皮細(xì)胞IL-8生成，增加巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶生成，促進(jìn)氣道高反應(yīng)性。本實(shí)驗?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中TNFα生成的影響，結(jié)果見表1.
表1組合物對COPD小鼠BALF中TNFα生成的影響
注：*P<0.05，與模型對照組相比；#P<0.05，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可顯著降低小鼠BALF中TNFα的生成，而化合物III和化合物IV無此作用。
(2)組合物對COPD小鼠BALF中RANTES分泌抑制作用
炎癥細(xì)胞的遷移受到趨化因子的調(diào)節(jié)，各種結(jié)構(gòu)細(xì)胞核炎性細(xì)胞均可分泌這些小分子蛋白，COPD發(fā)病過程中RANTES分泌增加，趨化單核/巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞。本實(shí)驗?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中RANTES分泌的影響，結(jié)果見表2。
表2組合物對COPD小鼠BALF中RANTES分泌的影響
注：*P<0.05，與模型對照組相比；#P<0.01，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可降低小鼠BALF中RANTES的分泌，而化合物III和化合物IV無此作用。
實(shí)驗例2組合物對COPD小鼠BALF中炎性細(xì)胞募集的抑制作用
(1)組合物對COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的抑制作用
中性粒細(xì)胞在COPD發(fā)病中具有重要作用，它可以釋放兩種絲氨酸蛋白酶，彈性蛋白酶和半胱氨酰蛋白酶-3，誘導(dǎo)動物產(chǎn)生人類肺氣腫樣的病理變化。中性粒細(xì)胞生命短暫，它循環(huán)招募到氣道以及穿越間隙腔的過程十分迅速。病理研究證明有些COPD患者支氣管組織內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加與氣流阻塞的程度有關(guān)。吸煙的COPD患者氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加，特別是那些伴有慢性支氣管炎的患者。影響COPD患者肺內(nèi)中性粒細(xì)胞募集的主要因素為IL-8趨化活性增強(qiáng)。本實(shí)驗?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的影響，結(jié)果見表3。
表3組合物對COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的影響
注：*P<0.05；#P<0.01，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可降低小鼠BALF中中性粒細(xì)胞的募集，而化合物III和化合物IV無此作用。
(2)組合物對COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的抑制作用
吸煙者和COPD患者肺內(nèi)巨噬細(xì)胞較正常人群水平增加，多聚集在肺泡、細(xì)支氣管和小氣道。肺泡壁巨噬細(xì)胞數(shù)目和輕中度肺氣腫以及COPD患者的小氣道疾病程度呈正相關(guān)。組織病變和損傷部位可見到COPD緩慢進(jìn)展和慢性病變與巨噬細(xì)胞長期增加平行。巨噬細(xì)胞可能通過釋放基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致彈性組織降解能力異常增高，誘發(fā)肺氣腫的發(fā)生。本實(shí)驗?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的影響，結(jié)果見表4。
表4組合物對COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的影響
注：*P<0.05，與模型對照組相比；#P<0.01，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可顯著降低小鼠BALF中巨噬細(xì)胞的募集，而化合物III和化合物IV無此顯著作用。
結(jié)論：組合物在10mg/kg下灌胃給藥，對香煙誘導(dǎo)的小鼠慢性阻塞性肺病過程中的炎性介質(zhì)的生成和趨化因子的分泌有顯著抑制作用，對炎性細(xì)胞的浸潤有顯著的抑制，對慢性阻塞性肺病有顯著的治療作用。而化合物III和化合物IV在10mg/kg下灌胃給藥，對香煙誘導(dǎo)的小鼠慢性阻塞性肺病過程中的炎性介質(zhì)的生成和趨化因子的分泌無顯著抑制作用，對炎性細(xì)胞的浸潤無顯著抑制，對慢性阻塞性肺病無任何治療作用。
實(shí)施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
實(shí)施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。