本發(fā)明屬于藥物新用途領(lǐng)域，涉及一種假體周圍骨溶解的藥物，尤其涉及茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備假體周圍骨溶解藥物中的用途。

背景技術(shù)：

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)(total joint arthroplasty，TJA)是二十世紀(jì)最成功的骨科手術(shù)之一，能達(dá)到有效解決患者關(guān)節(jié)疼痛、重建關(guān)節(jié)功能、提高患者生活質(zhì)量的目的。2007年《Lancet》上曾發(fā)表述評文章，將TJA稱為“世紀(jì)性的手術(shù)”(The Operation of the Century)。目前，TJA已成為治療嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及股骨頭壞死終末期病變等的首選方法。據(jù)統(tǒng)計，在美國，每年大約有70萬患者接受TJA，預(yù)計到2030年每年接受TJA的患者可超過400萬。然而隨著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及假體使用年限的延長，假體后期松動問題日益突出。Ranawat等研究發(fā)現(xiàn)，TJA術(shù)后15-20年，10-15％的人工假體將失效，需要更換新的人工假體。Dobzyniak等統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在需行翻修手術(shù)的患者中，無菌性松動(aseptic loosening，AL)引起的占到了75％。目前，AL已成為制約人工假體使用壽命的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致假體翻修的主要原因。

無菌性松動的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，至今尚不完全清楚。人工假體周圍的微環(huán)境是一個動態(tài)變化的過程，多種致病因素都可以參與到AL的發(fā)生。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AL的致病因素基本可歸納為兩大類：一類為機(jī)械性因素，如假體設(shè)計、循環(huán)負(fù)荷、液體壓力、假體微動、應(yīng)力遮擋等；另一類為生物學(xué)因素，即由磨損顆粒引起的生物學(xué)反應(yīng)。雖然機(jī)械因素可以通過不同的方式對人工假體的穩(wěn)定產(chǎn)生影響，但磨損顆粒引起的假體周圍骨溶解被認(rèn)為是引起假體AL的主要原因。

破骨細(xì)胞活性改變是引起各種骨代謝疾病的主要原因，也是研究的熱點。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為磨損顆粒引起的破骨細(xì)胞活化是導(dǎo)致假體周圍骨溶解的首要因素。研究發(fā)現(xiàn)松動假體周圍組織中成熟的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多；體外研究也證實聚乙烯、鈦、PMMA等顆粒能促進(jìn)破骨細(xì)胞前期細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞。因此，抑制破骨細(xì)胞活化已成為藥物預(yù)防和治療假體周圍骨溶解和假體無菌性松動的首要研究方向。

茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯(theaflavin-3,3’-digallate，TF3)是一類具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，通過兒茶素苯并環(huán)化作用而形成；其分子式為C₄₃H₃₂O₂₀，分子量為868.70，CAS NO.33377-72-9，結(jié)構(gòu)式如下所示：

TF3是紅茶的主要活性成分，大量的研究證實TF3具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒以及降血脂等作用。目前TF3與磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解和假體無菌性松動的關(guān)系尚不明確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，開發(fā)茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯的新用途，且尋找預(yù)防和治療假體周圍骨溶解和假體無菌性松動的有效藥物，本發(fā)明提供了茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備假體周圍骨溶解藥物中的用途。

技術(shù)方案：茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備假體周圍骨溶解藥物中的用途。

所述假體周圍骨溶解為人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生的假體周圍骨溶解。

一種假體周圍骨溶解藥物，包含茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯。

優(yōu)選的，所述茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在藥物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％～99％，優(yōu)選10％～90％。其中，藥物中選用的輔料為茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在藥學(xué)上可接受的載體。

優(yōu)選的，所述藥物為適用于胃腸道的藥物制劑，劑型為片劑、膠囊劑或控釋、緩釋制劑。

本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的載體為組合物中制劑使用的輔料，可采用本領(lǐng)域常規(guī)的輔料，以不和本發(fā)明活性成分發(fā)生反應(yīng)或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提，所述制劑的制備方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法進(jìn)行制備。

本發(fā)明中，組合物的制備方法沒有限制，TF3直接做成制劑，或者分別或/和輔料混合后做成制劑，然后按照本領(lǐng)域常規(guī)的方式進(jìn)行包裝，與其它輔料混合制成制劑。本發(fā)明中的藥物組合物的給藥劑量根據(jù)給藥對象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓员ＷC該藥物組合物在哺乳動物體內(nèi)能夠達(dá)到有效的血藥濃度為前提。

有益效果：(1)采用本發(fā)明所述藥物治療假體周圍骨溶解時，骨表面陷窩數(shù)、陷窩面積明顯減少，骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)明顯增加，骨溶解程度明顯減輕，骨膜增厚程度減輕，成熟破骨細(xì)胞數(shù)量減少；(2)本發(fā)明所述藥物能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化，且抑制作用呈濃度依賴性；(3)本發(fā)明所述藥物能明顯抑制ERK信號通路的活化；抑制ERK下游靶因子c-fos和NFATc1的表達(dá)，而對ERK上游調(diào)節(jié)激酶MEK1/2的活性無影響。

附圖說明

圖1為micro-CT掃描各實驗組小鼠顱骨的二維圖像及小鼠顱骨陷窩數(shù)、陷窩面積、骨密度(BMD)及骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)檢測值分析圖；其中A為四組實驗中小鼠顱骨micro-CT掃描圖，B為四組實驗中小鼠骨密度檢測值分析圖，C為四組實驗中小鼠骨體積分?jǐn)?shù)檢測值分析圖，D為四組實驗中小鼠顱骨陷窩數(shù)檢測值分析圖，E為四組實驗中小鼠顱骨陷窩面積檢測值分析圖。

圖2為各實驗組小鼠顱骨H&E、TRAP染色結(jié)果及顱骨骨溶解面積、骨膜厚度及破骨細(xì)胞數(shù)量檢測值分析圖；其中A為各實驗組小鼠顱骨H&E、TRAP染色結(jié)果圖，B為各實驗組小鼠顱骨骨溶解面積檢測值分析圖，C為各實驗組小鼠顱骨骨膜厚度檢測值分析圖，D為各實驗組小鼠顱骨破骨細(xì)胞數(shù)量檢測值分析圖。

圖3為BMM細(xì)胞活性檢測結(jié)果圖。

圖4為TF3對BMMs分化的作用結(jié)果圖；其中A為不同濃度的TF3與BMMs細(xì)胞共培養(yǎng)后TRAP染色結(jié)果，B為不同濃度的TF3與BMMs細(xì)胞共培養(yǎng)后顯微鏡下計數(shù)TRAP-陽性細(xì)胞數(shù)檢測值，C為不同處理時間的TF3與BMMs細(xì)胞共培養(yǎng)后TRAP染色結(jié)果，D為不同處理時間的TF3與BMMs細(xì)胞共培養(yǎng)后顯微鏡下計數(shù)TRAP-陽性細(xì)胞數(shù)檢測值。

圖5為骨吸收培養(yǎng)板及F-actin染色結(jié)果圖；其中A為不同濃度的TF3對破骨細(xì)胞F-actin環(huán)形成的影響，B為不同濃度的TF3對破骨細(xì)胞吸收面積的影響，C為TF3對破骨細(xì)胞F-actin環(huán)形成的劑量效應(yīng)。

圖6為破骨細(xì)胞活化相關(guān)基因RT-PCR檢測結(jié)果圖；其中A為不同濃度的TF3對相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果，B為不同加入時間，TF3對相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果

圖7為NF-κB、PI3K/AKT和MAPK通路關(guān)鍵蛋白Western blot檢測結(jié)果圖。

圖8為ERK及其上下游調(diào)節(jié)蛋白Western blot檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1 建立本發(fā)明所述藥物的應(yīng)用模型

1、主要藥品及試劑

茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯(TFDG)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA)、封片劑購自美國Sigma公司；RANKL、m-CSF購自美國R&D公司，切片石蠟購自德國Lecia公司，RT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。

2、主要儀器設(shè)備

Micro-CT(SkyScan 1176，比利時)、石蠟切片機(jī)(Leica 2135，德國)、烤片機(jī)(Leica 1120，德國)、石蠟包埋機(jī)(BMJ-Ⅱ，中國，常州)、正置顯微鏡Axio Imager.M1(Zeiss，德國)、酶標(biāo)儀(Biotec，美國)、高壓蒸汽消毒鍋(日本Sanyo公司)、酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)、PCR儀(TAKARATP800，日本TAKARA公司)。

3、實驗動物

健康C57BL/J6小鼠28只，雄性，體重20～25g，8～10周齡，清潔級，由蘇州大學(xué)動物實驗中心提供[動物許可證號：SYXK(蘇)2012-0045]。喂養(yǎng)條件如下：7只一籠，室溫18～20℃，濕度50～60％，通風(fēng)良好，自由攝食進(jìn)水。

4、細(xì)胞

RAW264.7(ATCC：TIB-71)是小鼠單核/巨噬細(xì)胞系，在RANKL的誘導(dǎo)下可分化為成熟的破骨細(xì)胞；小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMMs)來源于小鼠骨髓，其在RANKL和M-CSF誘導(dǎo)下可分化為成熟的破骨細(xì)胞。

5、實驗方法

(1)Ti顆粒的處理

Ti顆粒直徑為3.32±2.39μm，其中90％的顆粒直徑小于3.6μm，50％的顆粒直徑小于1.6μm，10％的顆粒直徑小于1.0μm。在使用前，Ti顆粒應(yīng)消毒和去除內(nèi)毒素。我們將Ti顆粒置于烘箱內(nèi)，180℃烘烤6h后，硝酸(1M)浸泡4h，等滲鹽水反復(fù)沖洗，2000rpm離心5min；后將其浸泡于75％乙醇，室溫下振蕩1h，重復(fù)四次，無水乙醇浸泡過夜，等滲鹽水洗滌3次，2000rpm離心5min沉淀Ti顆粒；將Ti顆粒置于超凈工作臺中，紫外線照射條件下自然干燥后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)實驗動物分組

C57BL/J6小鼠28只，隨機(jī)分為以下4組：

Sham組：7只，操作與Vehilce組相同，僅將置入的鈦顆粒改為等量的生理鹽水，術(shù)后每天腹腔注射0.2mL生理鹽水，2周后處死；

Vehicle組：7只，在小鼠顱骨表面置入30mg鈦顆粒，術(shù)后每天腹腔注射0.2mL生理鹽水，2周后處死；

Low-TF3組：7只，為TF3低劑量治療組，在小鼠顱骨表面置入30mg鈦顆粒后，每2天腹腔注射TF(0.2mL，1mg/kg)，2周后處死；

High-TF3組：7只，為TF3高劑量治療組，：在小鼠顱骨表面置入30mg鈦顆粒后，每2天腹腔注射TF3(0.2mL，10mg/kg)，2周后處死。

(3)小鼠顱骨骨溶解模型的制備

采用小鼠顱骨骨溶解模型(Kaar SG,et al.Rapid repair of titanium particle-induced osteolysis is dramatically reduced in aged mice.J Orthop Res.2001；19:171-8.)模擬磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的病理過程。小鼠稱重后，以40g/L水合氯醛按40mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，采用小鼠固定板固定小鼠四肢和頭部，顱頂局部皮膚去毛后安爾碘消毒。在顱骨表面沿顱骨正中矢狀縫的體表投影位置作一長約1cm切口，暴露1cm×1cm的視野，不破壞骨膜。以小鼠顱骨矢狀縫和冠狀縫交匯處為中心，將消毒后的Ti顆粒均勻涂在顱骨表面(30mg/只)。以4-0手術(shù)線間斷縫合傷口。術(shù)后日光燈照射加溫復(fù)蘇小鼠，待小鼠完全蘇醒后再放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。術(shù)前每只小鼠經(jīng)皮下注射6-氯-α-甲基咔唑-2-乙酸4mg/kg；術(shù)后在飲用水中加入100mg/mL恩諾沙星，持續(xù)3天。

(4)標(biāo)本收集

給藥2周后，使用CO₂箱處死小鼠，整體分離小鼠顱骨及顱下腦組織，剔除顱底附著軟組織，10％多聚甲醛固定48h后行micro-CT掃描，再以10％多聚甲醛固定48h后，加入10％EDTA脫鈣，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。

實施例2 TF3對小鼠顱骨陷窩數(shù)、陷窩面積、骨密度及骨體積分?jǐn)?shù)的影響

使用比利時SkyScan公司生產(chǎn)的高分辨顯微CT SkyScan 1076對小鼠顱骨進(jìn)行掃描分析。掃描前將標(biāo)本從固定液中取出，晾干。將每個顱骨放置在micro-CT測試試管杯中，每次5只，每個顱骨間用泡沫塑料片隔開；顱骨要擺放整齊，避免碰到試管壁。掃描參數(shù)設(shè)置為：掃描分辨率18μm，旋轉(zhuǎn)角度180°，旋轉(zhuǎn)角度量增0.9°，電壓80kV，電流100μA，曝光時間100ms。掃描結(jié)束后，采用SkyScan 1076自帶軟件進(jìn)行顱骨三維重建。按照Wedemeyer建立的方法(Wedemeyer C,et al.Particle-induced osteolysis in three-dimensional micro-computed tomography.Calcif Tissue Int.2007；81(5):394-402.)，使用CT Analyzer分析軟件(CT An，SkyScan)在小鼠顱骨表面以冠狀縫和矢狀縫交匯處為中心選定一圓柱形感興趣區(qū)域(Region of interest，ROI；3×3×1mm)，分析以下參數(shù)：骨密度(Bone mineral density，BMD)，以mg/cc表示；骨體積分?jǐn)?shù)(Bone volume to tissue volume ratio，BV/TV；％)；ROI區(qū)域內(nèi)骨陷窩數(shù)(Number of pores within the ROI)及陷窩面積(area of porosity)。

結(jié)果如圖1所示，三維重建結(jié)果顯示Ti顆粒植入后小鼠顱骨變薄，蟲蝕樣破壞明顯；經(jīng)腹腔注射TF3治療后，顱骨表面的蟲蝕樣破壞明顯減輕，因此TF3能夠減輕Ti顆粒引起的骨破壞。統(tǒng)計結(jié)果表明，Vehicle組顱骨表面陷窩數(shù)及陷窩面積較對照組分別增加了3.3倍和2.5倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(**p<0.01)；TF3(1mg/kg和10mg/kg)治療后，小鼠顱骨表面陷窩數(shù)及陷窩面積明顯減少，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Vehicle組骨密度(BMD)和骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)顯著低于對照組，采用TF3(1mg/kg和10mg/kg)治療后，上述參數(shù)較Vehicle組分別增加了：BMD：63.7％，124.9％；BV/TV：83.1％，165.2％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*p<0.05,**p<0.01)。

實施例3 TF3對小鼠顱骨骨溶解面積、骨膜厚度及破骨細(xì)胞數(shù)量的影響

顱骨經(jīng)10％EDTA脫鈣后，常規(guī)石蠟包埋。取顱骨水平位，于顱骨矢狀縫處連續(xù)切片，片厚5μm。分別行HE和TRAP染色。

1、HE染色步驟

H&E染色是最常用的染色方法，本研究采用H&E染色觀察顱骨表面大體變化，分析炎性細(xì)胞浸潤及骨質(zhì)破壞程度。具體操作步驟如下：

(1)每個樣品選擇5張連續(xù)切片，放入烤箱(60℃)內(nèi)烘烤30min；

(2)石蠟切片經(jīng)二甲苯(15min×2次)脫蠟后，依次經(jīng)過無水乙醇，無水乙醇，95％乙醇，95％乙醇，90％乙醇、80％乙醇、75％乙醇各5min，去離子水沖洗；

(3)蘇木素染色3-5min，去離子水沖洗；

(4)1％鹽酸酒精分化20s，1％氨水返藍(lán)30秒，去離子水沖洗；

(5)l％伊紅溶液復(fù)染5min，自來水沖洗5min，去離子水沖洗1min；

(6)常規(guī)脫水、透明(75％乙醇5min，90％乙醇5min，95％乙醇5min，無水乙醇5min，二甲苯透明10min×2次)；

(7)用吸水紙擦去樣品周圍多余的二甲苯，在保持樣品濕潤的情況下滴加中性樹膠，加蓋玻片封片；

Axio imager.M1正置顯微鏡(Zeiss，德國)觀察顱骨的形態(tài)學(xué)變化，于10×條件下攝片，顱骨的ROI區(qū)域位于拍攝的中央。用顯微鏡計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Image-Proplus 6.0)，參照von Knoch M法(von Knoch M,et al.Decrease in particle-induced osteolysis in obese(ob/ob)mice.Biomaterials.2004；25:4675-81)，計算骨膜厚度(Periosteum thickness，PT；mm)以及骨溶解面積(Eroded surface；mm2)。

2、抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Staining，TRAP)

抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨細(xì)胞特有的一種酶，常被用來鑒定成熟的破骨細(xì)胞。采用Sigma公司的TRAP染色試劑盒(387A)染色后，成熟的破骨細(xì)胞呈紫紅色。具體染色方法如下：

(1)每個樣品選擇5張連續(xù)切片，放入烤箱(60℃)內(nèi)烘烤30min；

(2)石蠟切片經(jīng)二甲苯(15min×2次)脫蠟后，依次經(jīng)過無水乙醇，無水乙醇，95％乙醇，95％乙醇，90％乙醇、80％乙醇、75％乙醇各5min，雙蒸水沖洗；

(3)用吸水紙擦干樣品周圍的水漬，將切片放入丙酮溶液中固定30s；

(4)雙蒸水沖洗2min；

(5)將玻片放入暗盒內(nèi)，加入新鮮配制的TRAP染液，染液需完全覆蓋切片，37℃水浴鍋避光孵育1h；

(6)雙蒸水沖洗2min×3次；

(7)蘇木素復(fù)染2min；

(8)自來水沖洗，晾干，中性樹膠封片。

Axio imager.M1正置顯微鏡(Zeiss，德國)觀察，于20×條件下攝片，顱骨的ROI區(qū)域位于拍攝的中央。由于在骨組織中鑒定成熟破骨細(xì)胞比較困難，我們采用Sawyer建立的方法(Sawyer A,et al.Quantification of tartrate resistant acid phosphatase distribution in mouse tibiae using image analysis.Biotech Histochem.2003；78:271-8.)，運用顯微鏡計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Image-Proplus 6.0)計算ROI區(qū)域內(nèi)成熟破骨細(xì)胞數(shù)量。

結(jié)果如圖2所示，H&E染色結(jié)果顯示Ti顆粒植入部分可見炎癥反應(yīng)明顯，有大量的巨噬樣細(xì)胞浸潤，骨連續(xù)性中斷，TF3治療組骨膜內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥反應(yīng)減輕，骨破壞程度得到改善，且抑制作用呈劑量依賴性。骨組織計量學(xué)結(jié)果顯示矢狀縫骨吸收面積在Vehicle組為(0.11±0.01)mm²，在Control組、L-TF3和H-TF3組分別為(0.02±0.002)mm²、(0.07±0.005)mm²和(0.03±0.004)mm²，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(**p<0.01)。Ti顆粒植入2周后，小鼠骨膜厚度變薄，Image Pro-Plus 6.0軟件測量結(jié)果顯示Vehicle組骨膜厚度(PT)為(0.10±0.03)mm，與Control組(0.28±0.04)mm比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(**p<0.01)；TF3治療后，PT分別降低為L-TF3組(0.19±0.03)mm，H-TF3組(0.13±0.02)mm，與Ti顆粒組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*p<0.05，**p<0.01)。

破骨細(xì)胞是介導(dǎo)磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的直接效應(yīng)細(xì)胞。TRAP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)Control組僅少量、散在點狀陽性改變，Vehicle組顱骨溶解側(cè)可見大片連續(xù)的紫紅色深染區(qū)域；L-TF3和H-TF3組僅在顱骨溶解邊緣有少量陽性區(qū)域(圖2)。骨組織計量學(xué)分析結(jié)果顯示Vehicle組TRAP陽性細(xì)胞為(57.67±5.56)個，與Control組(2.33±2.05)個比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(**p<0.01)；而L-TF3和H-TF3組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)分別為(35.67±4.92)個、(9.67±4.50)個，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(**p<0.01)。上述結(jié)果證實LiCl通過抑制破骨細(xì)胞形成減輕Ti顆粒引起的骨溶解。

實施例4 TF3對BMM細(xì)胞活性的影響

1、小鼠BMMs細(xì)胞的分離培養(yǎng)

選取4-6周齡的雌性C57BL/6小鼠(10只，2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，無菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，剪斷一側(cè)骨端，用注射器吸取含10％胎牛血清、1％青/鏈霉素，和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液，從另一端插入注射器沖洗3次，然后反復(fù)吹打骨髓細(xì)胞，經(jīng)200目的濾網(wǎng)過濾后，1000rpm離心6min，將收集的細(xì)胞置于含有10％胎牛血清、1％青/鏈霉素和10ng/mL M-CSF的DMEM培養(yǎng)。24h后取非貼壁細(xì)胞懸液，與單核細(xì)胞分離液按1：2體積比置于離心管中，2400rpm，離心15min；棄去上層培養(yǎng)液，取單個核細(xì)胞層，20mL PBS輕輕吹打洗滌2次。將細(xì)胞接種在含有10％胎牛血清、1％青/鏈霉素和10ng/mL M-CSF的DMEM中培養(yǎng)4h，棄掉未貼壁細(xì)胞。用含10％胎牛血清、1％青/鏈霉素、50ng/mL RANKL和30ng/mL M-CSF的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2、CCK-8法細(xì)胞增殖率

CCK-8試劑常用來進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽在1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲染料。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

取生長狀態(tài)良好的BMMs細(xì)胞，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度1.5×104/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(DMEM培養(yǎng)基，30ng/mL M-CSF，50ng/mL RANKL)，每組設(shè)3個復(fù)孔，24h后更換含有TF3(0.01-40μM)，30ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。每100μl培養(yǎng)基中加入10μl CCK-8，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置4h，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的OD。以上實驗重復(fù)3次，取其平均值。

結(jié)果如圖3所示，體外結(jié)果顯示TF3濃度<5μM時對BMM細(xì)胞的活性無影響。

實施例5 TF3對破骨細(xì)胞分化的影響

BMMs以1.0×104/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含有不同濃度的TF3培養(yǎng)4h，在加入含有RANKL(50ng/mL)，M-CSF(30ng/mL)和TF3的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)5d后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞大體狀態(tài)；TRAP染色參考Sigma公司的TRAP染色試劑盒(387A)說明書，封片后，顯微鏡下觀察、拍照，并計數(shù)細(xì)胞核≥3的TRAP染色陽性細(xì)胞。

結(jié)果如圖4所示，將TF3(0，0.01，0.1，1μM)加入到含有50ng/mL RNAKL和30ng/mL M-CSF的BMM培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)5d，TRAP染色結(jié)果顯示成熟破骨細(xì)胞數(shù)量從267.7±32.2/孔(0μM)減少到66.6±5.4/孔(1μM)。為了進(jìn)一步明確TF3在破骨細(xì)胞分化的哪個階段起作用，我們采用1μM的TF3，分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)的0，2，4d加入培養(yǎng)基，TRAP染色結(jié)果顯示TF3在0，2d時加入能明顯抑制破骨細(xì)胞分化，而在4d時加入對破骨細(xì)胞分化無影響。

實施例6 破骨細(xì)胞骨吸收能力

1、OAP板檢測破骨細(xì)胞骨吸收能力

BMMs細(xì)胞以1.5×10⁵個/孔接種于24孔骨吸收培養(yǎng)板(OAP，美國Corning公司)，加入含有不同濃度TF3和30ng/mL M-CSF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，再更換誘導(dǎo)含有RANKL(50ng/mL)，M-CSF(30ng/mL)和TF3的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)5d后，棄培養(yǎng)基。以PBS清洗3次，每次2min；再加入PBS，采用超聲波清洗2次，每次5min；自然晾干后，倒置顯微鏡下觀察并記錄每組骨吸收陷窩圖像。運用顯微鏡計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Image-Proplus 6.0)進(jìn)行分析，計算每組骨吸收陷窩面積比[骨吸收陷窩面積比(resorption area of well，％)＝骨吸收陷窩面積/培養(yǎng)孔面積]。

2、F-actin染色

細(xì)胞棄培養(yǎng)基后，以4％多聚甲醛固定10min，在加入含有0.1％Triton X-100的PBS滲透5min；再加入Acti-stain^TM488Fluorescent Phalloidin(Cytoskeleton Inc,USA)室溫避光反應(yīng)30min；PBS清洗3次，再加入DAPI復(fù)染10min；熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果如圖5所示，采用OAP板以及F-actin染色的方法檢測TF3對破骨細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞骨吸收面積從81.9％(0μM)降低到25.6％(1μM)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*p<0.05，**p<0.01)。F-actin染色結(jié)果顯示TF3能明顯抑制破骨細(xì)胞F-actin環(huán)的形成，且抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。

實施例7 TF3對相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用定量RT-PCR的方法，檢測不同干預(yù)條件下BMMs細(xì)胞中TRAP,NFATc1,c-Fos,CTSK和Oscar的表達(dá)變化。采用Trizol試劑(美國Gibco公司)提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。采用美國Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RT-PCR在TP800熒光定量PCR儀(日本TaKaRa公司)上進(jìn)行，引物由上海生工公司設(shè)計合成，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列如下：

TRAP forward 5’-CTGGAGTGCACGATGCCAGCGACA-3’，

TRAP reverse 5’-TCCGTGCTCGGCGATGGACCAGA-3’；

NFATc1forward 5’-CCGTTGCTTCCAGAAAATAACA-3’，

NFATc1reverse 5’-TGTGGGATGTGAACTCGGAA-3’；

c-Fos forward 5’-CCAGTCAAGAGCATCAGCAA-3’，

c-Fos reverse 5’-AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA-3’；

CTSK forward 5’-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3’，

CTSK reverse 5’-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3’；

Oscar forward 5’-CTGCTGGTAACGGATCAGCTCCCCAGA-3’，

Oscar reverse 5’-CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT-3’；

GAPDH forward 5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，

GAPDH reverse 5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’。

擴(kuò)增條件：95℃，5s；60℃，24s；40個循環(huán)。

結(jié)果如圖6所示，采用定量RT-PCR的方法檢測破骨細(xì)胞活化相關(guān)基因NFATc1、c-Fos、TRAP、CTSK和Oscar的表達(dá)，結(jié)果顯示RANKL加入后，上述基因mRNA的表達(dá)明顯增加，而TF3能抑制NFATc1、c-Fos、TRAP、CTSK和Oscar的表達(dá)，且抑制效應(yīng)與TF3的濃度和加入的時間有關(guān)。

實施例8 TF3對相關(guān)蛋白的影響

采用Western blot檢測不同干預(yù)條件下AKT1、P-AKT1，p65、P-p65，IκBa、P-IκBa，ERK、P-ERK，JNK、P-ERK，p38、P-p38，MEK1/2、P-MEK1/2，c-fos和NFATc1的表達(dá)變化。

1、試劑配置

30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29g，N,N’-亞甲丙烯酰胺1g，溶于50mL ddH₂O中，加熱至37℃充分?jǐn)嚢枞芙?，補(bǔ)足總體積至100mL，微孔濾膜過濾除菌，嚴(yán)格控制pH值不大于7.0，置于棕色瓶，4℃避光保存；

2×SDS上樣緩沖液：含有100mM Tris-HCl(pH 6.8)，200mM DTT，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油，4℃保存；

1×電泳緩沖液：含25mM Tris-HCI(pH 8.8)，192mM甘氨酸，0.1％SDS，加ddH₂O稀釋至1000mL，4℃保存；

抗體稀釋液(PBST)：20×PBS 50mL加ddH₂O稀釋至1000mL，再加入1mL Tween-20；

轉(zhuǎn)膜緩沖液：取3.03g Tris堿，14.2g甘氨酸，加入150mL甲醇溶解，加ddH₂O水稀釋至1000mL，4℃保存；

封閉液：1.25g脫脂奶粉，1.25gBSA加PBST稀釋至50mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；

抗體洗脫緩沖液：Tris-HCl 62.5mol/L(pH 6.8)，SDS 2％，β-巰基乙醇100mol/L，4℃保存；

考馬斯亮藍(lán)染液：考馬斯亮藍(lán)-R250 1.0g，10％冰醋酸100mL，異丙醇250mL,加ddH₂O稀釋至1000mL，攪拌均勻，濾紙過濾，室溫保存；

考馬斯亮藍(lán)R-250脫色液：10％冰醋酸100mL，甲醇450mL,加ddH₂O稀釋至1000mL，攪拌均勻，室溫保存。

2、細(xì)胞總蛋白提取

(1)對照組與各干預(yù)組細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗3次，盡量將液體去除干凈；

(2)加入細(xì)胞裂解液(20mM Tris-HCL pH 7.5，150mM NaCl，1mM EGTA，1％Triton，2.5mM sodium pyrophosphate，1mMβ-glycerophosphate，1mM Na₃VO₄，1μg/mL leupeptin)，1mM PMSF，蛋白酶抑制劑，冰上孵育30分鐘；

(3)用刮棒刮下細(xì)胞，移入預(yù)冷的離心管中，14000rpm離心10min；

(4)吸取上清，BCA蛋白定量后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、配制12％的SDS-PAGE膠

(1)將玻璃板及樣品梳清洗干凈，無水乙醇擦拭，晾干，固定于制膠板上；

(2)在兩塊玻璃板之間加入分離膠溶液，留出灌注積層膠所需空間。然后在分離膠溶液上覆蓋一層1cm的無水乙醇層，注意不要引入氣泡；

(3)等分離膠聚合后，用吸水濾紙吸凈殘留液體；

(4)在分離膠上層灌注濃縮膠，立即插入樣品梳，注意保持樣品梳水平，避免引入氣泡；

(5)待聚合完全后，小心移出樣品梳，用去離子水清洗加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺，把凝膠固定于電泳裝置上，各加入電泳緩沖液；

分離膠配比(5mL)：1.6mL ddH₂O，2.0mL 30％丙烯酰胺溶液，1.3mL Tris-HCL(1.5mol/L,pH 8.8)，0.05mL 10％SDS，0.05mL 10％過硫酸胺，0.002mL TEMED；

濃縮膠配比(1mL)：0.68mL ddH₂O，0.17mL 30％丙烯酰胺溶液，0.13mL Tris-HCL(1.0mol/L,pH 6.8)，0.01mL 10％SDS，0.01mL 10％過硫酸胺，0.001mL TEMED；

(6)上樣：取相同質(zhì)量的各組樣本(體積×蛋白質(zhì)濃度)，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液，100℃煮沸5min，冰上5min，2000rpm離心30s。按照實驗設(shè)計的順序用微量加樣器依次將樣品小心加入上樣孔內(nèi)，注意不要溢出；

(7)電泳：加入1×電泳緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，起始電壓為80V，約30min后待樣品完全進(jìn)入分離膠時，將電壓調(diào)為160V，電泳約1.5h至溴酚藍(lán)染料前沿抵達(dá)分離膠末端時，即停止電泳；

(8)轉(zhuǎn)膜：準(zhǔn)備4張與膠同樣大小的濾紙和2張PVDF膜，PVDF膜置于無水乙醇中浸泡5min后，與轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊一起浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中。撬開玻璃板剝膠，去除濃縮膠，注意不要損傷分離膠，做好標(biāo)記，區(qū)分正、反面；將膠浸泡于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中15min。在轉(zhuǎn)膜儀的陽極和陰極之間，依次放置海綿、濾紙、膜、膠、濾紙、海綿，注意趕走各層氣泡。4℃條件下，恒流30mA轉(zhuǎn)移30min；

(9)封閉：將轉(zhuǎn)移好的PVDF膜置于新鮮配置的封閉液中，正面朝上，37℃搖床孵育2h；

(10)加一抗：吸去封閉液，加入用封閉液稀釋的一抗，4℃搖床孵育過夜；

(11)清洗PVDF膜：取出與一抗共同孵育的PVDF膜，用PBST清洗5次，每次5min；

(12)加二抗：用封閉液將LI-COR IRDyeTM800-標(biāo)記的二抗稀釋到推薦濃度，加入裝有PVDF膜(正面朝上)的密封袋中，室溫避光孵育30min；

(13)清洗：取出PVDF膜，用PBST洗5次，每次5min，搖床振蕩；

掃描圖像：采用Li-Cor Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)檢測，掃描的圖像保存。膜置于ddH₂O中，4℃保存。

結(jié)果如圖7、8所示，TF3(1μM)預(yù)處理4h再加入含有RANKL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)0、5、15、30或60min，Western blot檢測結(jié)果顯示NF-κB和PI3K/AKT信號通路活性無顯著變化，進(jìn)一步的結(jié)果發(fā)現(xiàn)TF3對MAPK通路中JNK和p38信號通路的影響也不顯著，但TF3能明顯抑制ERK信號通路的活化。RANKL加入15min后，P-ERK的表達(dá)明顯增加，而TF3處理組P-ERK的表達(dá)明顯減少(圖7)。

為了進(jìn)一步明確TF3對ERK信號通路的影響，我們采用不同濃度的TF3(0、0.01、0.1、1.0μM)干預(yù)RAW264.7細(xì)胞，結(jié)果顯示RANKL單獨處理組，P-ERK的表達(dá)明顯增加，而TF3能抑制P-ERK的表達(dá)，且抑制作用呈濃度依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TF3能夠抑制ERK下游靶因子c-fos和NFATc1的表達(dá)，而對ERK上游調(diào)節(jié)激酶MEK1/2的活性無影響(圖8)。

本發(fā)明統(tǒng)計分析步驟應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件(SPSS,Chicago,IL,USA)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計運算前所有數(shù)據(jù)先用Bartlett檢驗方法進(jìn)行方差齊性檢驗；若資料不符合方差分析的條件，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

經(jīng)上述實施例，得出以下結(jié)論：本實驗通過TF3干預(yù)小鼠顱骨骨溶解模型，結(jié)果表明TF3能減少磨損顆粒引起的小鼠顱骨表面陷窩數(shù)及陷窩面積，增加顱骨骨密度及骨體積分?jǐn)?shù)，減少骨質(zhì)破壞區(qū)域成熟破骨細(xì)胞數(shù)量；且高劑量的TF3作用更為明顯，可以明顯減少成熟破骨細(xì)胞數(shù)量，抑制磨損顆粒引起的骨溶解。本研究結(jié)果證明TF3對磨損顆粒引起的骨溶解有一定的治療作用，且高劑量的作用較為明顯。

破骨細(xì)胞過度活化是導(dǎo)致骨溶解的主要原因，因此可推測TF3對磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的治療作用可能與其抑制破骨細(xì)胞活化有關(guān)。在小鼠顱骨骨溶解模型中發(fā)現(xiàn)，TF3能明顯減少骨質(zhì)破壞區(qū)域成熟破骨細(xì)胞數(shù)量；體外研究結(jié)果顯示，TF3能抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化，且抑制作用與TF3的劑量及作用時間有關(guān)。MAPK、NF-κB或PI3K/AKT是調(diào)控破骨細(xì)胞活化的主要通路，且發(fā)現(xiàn)TF3對NF-κB、PI3K/AKT信號通路以及MAPK的JNK和p38信號通路的活性無影響，但能顯著抑制ERK信號通路的活化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TF3能夠抑制ERK下游靶因子c-fos和NFATc1的表達(dá)，而對ERK上游調(diào)節(jié)激酶MEK1/2的活性無影響。研究結(jié)果表明TF3通過干預(yù)ERK/c-fos/NFATc1信號通路抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化。