本發(fā)明涉及中藥化學及醫(yī)藥
技術領域：
，具體涉及從蒼術(AtractylodisRhizoma)中提取制備的蒼術酮(Atractylon)的醫(yī)藥新用途。
背景技術：
：急性肺損傷(acutelunginjury)在臨床十分常見，是由各種原因所導致的肺組織結構發(fā)生特征性病理改變而出現(xiàn)的臨床綜合征，病理上以肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷、廣泛性肺水腫、肺不張為主，肺內(nèi)分流增加、順應性下降，臨床可表現(xiàn)為急性進行性、發(fā)作性呼吸困難。急性肺損傷的發(fā)病機制尚不清楚，目前認為可能由以下兩個方面的原因引起：1、致病因素對肺細胞的直接損傷，例如肺部感染、肺挫傷、溺水、有毒物質(zhì)吸入等；2、各種原因導致的急性全身炎癥反應的間接結果，例如膿毒血癥、急性胰腺炎、肺部以外的嚴重損傷、休克等。目前尚無治療急性肺損傷的特效藥物和手段，臨床主要以支持治療為主，積極治療原發(fā)病，避免并發(fā)癥發(fā)生，適當輔助呼吸支持治療。由于全身和局部的炎癥反應是急性肺損傷發(fā)生和發(fā)展的重要機制，臨床常用糖皮質(zhì)激素控制炎癥反應，但大量研究顯示糖皮質(zhì)激素既不能預防急性肺損傷的發(fā)生，對早期治療也沒有特別的好處。因此，研究各種原因、特別是肺部感染所引起的急性肺損傷的辨治方法具有重要意義。蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北蒼術Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，主要分布在江蘇、河南、山西和陜西等地，作為許多中藥方劑的組成部分，自古以來廣泛應用于臨床。該藥具有抗病毒、抗炎、保肝和抗癌的作用，在中國古代權威的醫(yī)學典籍《本草綱目》和2015版《中國藥典》中，都指出其有幫助消化的作用。在民間醫(yī)學中，它被用來作為一種治療呼吸系統(tǒng)疾病和消化系統(tǒng)疾病的藥物長達幾個世紀之久。特別是在江蘇、浙江等沿海地區(qū)，它總是與其它天然藥用植物配伍(如防風、羌活)合煎后用于呼吸系統(tǒng)疾病。蒼術屬植物的化學成分主要有揮發(fā)油、苷、糖、黃酮及甾醇、營養(yǎng)物質(zhì)等。蒼術揮發(fā)油是由一系列倍半萜和聚乙烯炔類及少量酚類和倍半萜內(nèi)酯等組成，倍半萜主要成分為桉葉醇，茅術醇(Hinesol)和蒼術酮(Atractylon)等。倍半萜內(nèi)酯作為我們?nèi)粘Ｊ称匪缓囊淮箢惗喾宇惢衔?，由于其廣泛的藥理活性得到很多的關注。茅蒼術中提取的倍半萜內(nèi)酯能夠通過下調(diào)Runx2活化，抑制MMPs的表達和血管內(nèi)皮細胞中VEGF的分泌，從而干擾了腫瘤的生成(Phytomedicine，2015，22:1017-1026)。蒼術精油中分離的蒼術醇能夠抑制人類白血病HL-60細胞的生長，并通過JNK信號通路誘導細胞凋亡(JNatMed，2015，69:332-339)。蒼術內(nèi)酯I能夠在肺癌細胞中通過線粒體介導的細胞凋亡途徑發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用(Molecules，2013，18:13357-13368)。蒼術內(nèi)酯III可以在RBL-2H3細胞中顯著抑制IgE/Ag介導的細胞脫顆粒作用，而不影響細胞活力(ImmunopharmacolImmunotoxicol，2015，15:1-5]；其抗過敏活性依賴于對Akt、p38和JNK激酶磷酸化的抑制作用，以及IgE/Ag介導的[Ca2+]i的升高(JEthnopharmacol，2013，145:278-285)。然而，蒼術提取物及其活性成分對急性肺損傷的作用和機制，尚未見到相關報道。本發(fā)明通過相關實驗，研究了蒼術提取物及其活性成分蒼術酮（Atractylon，其化學結構式見（I））的保護作用。(I)目前尚無治療急性肺損傷的特效藥物和手段，臨床常用糖皮質(zhì)激素控制炎癥反應，但大量研究顯示其既不能預防急性肺損傷的發(fā)生，對早期治療也沒有特別的好處。因此，研發(fā)新的治療急性肺損傷的藥物和手段十分重要。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題，是提出蒼術酮的新醫(yī)藥用途，即在制備治療急性肺損傷藥物中的應用。本發(fā)明從蒼術中提取分離得到足夠量的蒼術酮(結構式（I）)，通過藥理實驗，證實下述結構式（I）表示的蒼術酮能夠用于治療急性肺損傷。(I)本發(fā)明所述蒼術酮的提取分離采用超臨界二氧化碳萃取和硅膠柱色譜法，主要包括如下步驟：(1)前處理步驟：將待提取的蒼術飲片去除雜質(zhì)后粉碎成粉末；(2)提取步驟：采用HA121的超臨界液體萃取儀(華安儀器廠，江蘇，中國)進行超臨界二氧化碳萃取。取蒼術飲片100g粉碎成粉末，置于萃取釜內(nèi)，在350bar壓力、溫度50℃動態(tài)提取時間持續(xù)60min，乙醇(99.9%)作為改性劑，流速為5ml/min。超臨界二氧化碳流速設定為15g/min，靜態(tài)萃取時間設定為30min。去除溶劑，得到的產(chǎn)物為5.8%。用于體外研究的超臨界二氧化碳萃取物溶于磷酸鹽緩沖液，濃度為1mg/ml。(3)純化步驟：將超臨界CO2萃取物(50g)用于硅膠柱，使用石油醚(沸點60~90℃)和乙酸乙酯(30:1→1:1，V/V)進行分離。首先制備色譜柱：稱取硅膠40克，將硅膠與洗脫劑按比例混合(20:1)，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，不能留有氣泡，然后加入石油醚將附著在管壁的硅膠洗下，使色譜柱面平整，平衡1小時后加入供試品進行洗脫。將萃取物溶于石油醚中，沿著色譜柱管壁緩慢加入，當液面下降至與柱表面相平時，即從色譜柱頂端緩慢加入洗脫劑石油醚。將洗脫劑石油醚沿管壁緩慢加入，打開底閥，緩慢滴加，控制流速為lmL/min，當流過色譜柱的一個空體積后即用標號的試劑瓶開始收集。得到化合物4(6毫克)，化合物3(2毫克)，化合物5(50毫克)，化合物6(4毫克)，化合物1(10毫克)和化合物2(13毫克)。采用紫外光譜、質(zhì)譜分析、1H和13C核磁共振光譜鑒定，上述化合物分別為蒼術內(nèi)酯I(10毫克)，蒼術內(nèi)酯III(13毫克)，蒼術醇(2毫克)、α-姜黃烯(6毫克)，蒼術酮(50毫克)、蒼術呋喃烴(4毫克)。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：本發(fā)明提供下述結構式(I)表示的蒼術酮在制備治療急性肺損傷藥物中的應用。(I)優(yōu)選的，所述蒼術酮具有抑制小鼠急性肺損傷的功能。優(yōu)選的，所述蒼術酮具有保護急性肺損傷小鼠死亡的功能。優(yōu)選的，所述蒼術酮具有對急性肺損傷小鼠肺組織TLR7信號通路的調(diào)控功能。優(yōu)選的，所述治療急性肺損傷藥物含有藥學上有效量的蒼術酮以及藥學上可接受的載體。按本領域常用的制藥工藝，所述藥物可以被制成任何一種藥學上可接受的劑型。優(yōu)選的，所述任何一種藥學上可接受的劑型包括混懸劑、乳劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射劑等。本發(fā)明經(jīng)藥理實驗驗證，蒼術酮能夠降低急性肺損傷小鼠的死亡率，延長小鼠平均生存時間；能夠顯著抑制急性肺損傷小鼠的肺指數(shù)，HE染色顯示與模型組相比較，治療組肺組織肺泡明顯，細胞相對較完整，炎性介質(zhì)滲出減少，肺細胞間隔增厚較輕，細支氣管上皮柱狀細胞脫落減少；說明蒼術酮治療后顯示肺組織學損傷得到了明顯改善，這些作用呈現(xiàn)劑量依賴性。對血清中干擾素-α、IL-1β、IL-6和TNF-α水平檢測發(fā)現(xiàn)，蒼術酮顯著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性細胞因子的水平(IL-6、TNF-α和IL-1β)?；驒z測結果發(fā)現(xiàn)TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表達顯著上調(diào)，這表明上述信號途徑被激活。Westernblot分析結果顯示，蒼術酮治療后，TLR7下游因子中最重要的炎癥蛋白NF-κBp65蛋白表達明顯增加。綜合這些結果表明，蒼術酮在治療急性肺損傷中的作用，依賴于TLR7信號通路的激活，誘導I型干擾素的生產(chǎn)和NF-κBp65的抑制。從本發(fā)明藥理及活性實驗結果來看，蒼術酮能夠明顯減輕急性肺損傷小鼠的肺部炎癥，減少動物的死亡；其作用與其激活TLR7誘導I型干擾素的生成、抑制NF-κB的激活密切相關。這些結果表明，蒼術酮可用于制備治療急性肺損傷的有效藥物，具有良好的應用前景和應用價值。附圖說明圖1是本發(fā)明試驗例4中蒼術酮對小鼠急性肺損傷的作用示意圖。圖2是本發(fā)明試驗例5中蒼術酮對急性肺損傷小鼠肺組織TLR7信號通路的調(diào)節(jié)作用示意圖，其中圖2(A)表示RFQ-PCR檢測TLR7、MyD88、TRAF6和IFN-βmRNA表達水平；圖2(B)表示W(wǎng)esternblot檢測NF-κBp65蛋白表達水平。其中，NC表示正常對照組，MC表示模型對照組，Ribabirin表示利巴韋林，Atractylon10表示蒼術酮10mg/kg治療組，Atractylon20表示蒼術酮20mg/kg治療組，Atractylon40表示蒼術酮40mg/kg治療組。檢測值采用內(nèi)參照(18SrRNA或者β-actin)進行校正。與模型組相比較，*P<0.05，**P<0.01。具體實施方式以下實施例及試驗例中采用的試藥、抗體、耗材、試劑盒及動物說明如下：1、試藥、抗體、耗材和試劑盒中藥蒼術購自華東藥業(yè)公司(上海)，由浙江中醫(yī)藥大學鑒定。標本(編號y20141022)存放在浙江醫(yī)學院藥學系。HA121超臨界液體萃取儀為江蘇華安儀器廠產(chǎn)品。血清IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自Biovol技術公司。Trizol裂解和提取試劑盒購自上海Biotechnology公司。cDNA合成試劑盒購自大連Takara公司。BCA試劑盒購自碧云天生物公司。NF-κBp65抗體和β-actin抗體購自康成生物。OdysseyIRDye680conjugated山羊抗兔IgG、OdysseyBlockingBuffer均產(chǎn)自美國Li-Cor公司。NonidetP40產(chǎn)于美國SIGMA-ALDRICH公司，PMSF購自美國Fluka公司。完全性蛋白酶抑制劑混合物為德國Roche公司產(chǎn)品；40%Acrylamide/bisSolution[N，N’-Methylenbis-acrylamid，Mix，Ratio37.5:1(2.6%C)]和Tween-20購自美國Bio-Rad公司。預染蛋白標準品產(chǎn)于加拿大Fermentas公司。硝酸纖維薄膜、甘氨酸、Tris、TEMED、EDTA、SDS為美國Amresco產(chǎn)品。異丙醇、溴酚藍購自上海試劑三廠。過硫酸銨、甲醇、濃鹽酸均為分析純，購自中國國藥集團化學試劑有限公司。Odyssey紅外掃描系統(tǒng)為Li-Cor公司產(chǎn)品。2、動物雄性SPF級ICR小鼠，體重(22±2)g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(浙)2014-0001。實施例1、超臨界二氧化碳萃取和硅膠柱色譜法分離蒼術酮采用HA121的超臨界液體萃取儀(華安儀器廠，江蘇，中國)進行超臨界二氧化碳萃取。取蒼術飲片100g粉碎成粉末，置于萃取釜內(nèi)，在350bar壓力、溫度50℃動態(tài)提取時間持續(xù)60min，乙醇(99.9%)作為改性劑，流速為5ml/min。超臨界二氧化碳流速設定為15g/min，靜態(tài)萃取時間設定為30min。去除溶劑，得到的產(chǎn)物為5.8%。用于體外研究的超臨界二氧化碳萃取物溶于磷酸鹽緩沖液，濃度為1mg/ml。將超臨界CO2萃取物(50g)用于硅膠柱，使用石油醚(沸點60~90℃)和乙酸乙酯(30:1→1:1，V/V)進行分離。首先制備色譜柱：稱取硅膠40克，將硅膠與洗脫劑按比例混合(20:1)，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，不能留有氣泡，然后加入石油醚將附著在管壁的硅膠洗下，使色譜柱面平整，平衡1小時后加入供試品進行洗脫。將萃取物溶于石油醚中，沿著色譜柱管壁緩慢加入，當液面下降至與柱表面相平時，即從色譜柱頂端緩慢加入洗脫劑石油醚。將洗脫劑石油醚沿管壁緩慢加入，打開底閥，緩慢滴加，控制流速為lmL/min，當流過色譜柱的一個空體積后即用標號的試劑瓶開始收集。得到化合物4(6毫克)，化合物3(2毫克)，化合物5(50毫克)，化合物6(4毫克)，化合物1(10毫克)和化合物2(13毫克)。采用紫外光譜、質(zhì)譜分析、1H和13C核磁共振光譜鑒定，上述化合物分別為蒼術內(nèi)酯I(10毫克)，蒼術內(nèi)酯III(13毫克)，蒼術醇(2毫克)、α-姜黃烯(6毫克)，蒼術酮(50毫克)、蒼術呋喃烴(4毫克)。實施例2、蒼術酮片劑的制備成分每片用量蒼術酮50mg糊精37.45mg微晶纖維素10.5mg淀粉17.5mg乳糖10.5mg硬脂酸鎂1.05mg按處方量將蒼術酮(按實施例1方法制得)加入糊精、微晶纖維素、淀粉、乳糖混勻，制成顆粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，即得(每片含蒼術酮0.05g)。成人推薦口服用量1-4片/次，每日2~3次。實施例3、蒼術酮膠囊的制備成分每粒用量蒼術酮50mg糊精37.45mg微晶纖維素10.5mg淀粉17.5mg乳糖10.5mg按處方量將蒼術酮(按實施例1方法制得)糊精、微晶纖維素、淀粉、乳糖混勻，制成顆粒后，填裝入0號硬膠囊殼，打光即制得(每粒膠囊含蒼術酮0.05g)。成人推薦口服用量1-4粒/次，每日2~3次。下面通過試驗例以蒼術酮的藥理和活性實驗及結果來進一步說明本發(fā)明。試驗例1、蒼術酮對小鼠急性肺損傷的抑制作用雄性ICR小鼠，分為正常對照組、急性肺損傷模型組，利巴韋林療組和藥物治療組(每組24只)。在造模2小時后，試驗組中蒼術酮或利巴韋林采用灌胃給藥，每日1次共5天。模型對照組小鼠，在相同的時間間隔給予生理鹽水。每日觀察所有小鼠的體重變化和存活情況。實驗結束后每組10只小鼠處死，用于計算肺指數(shù)。實驗結果見表1。表1、蒼術酮對小鼠急性肺損傷的抑制作用組別劑量(mg/kg)數(shù)量(n)肺指數(shù)(mg/g)抑制率(%)正常組-107.35±0.51**-模型組-1021.26±4.75-利巴韋林組501012.68±3.30**61.7蒼術酮組401010.90±3.76**74.5蒼術酮組201013.08±4.54**58.8蒼術酮組101017.43±4.16*27.5與模型組相比較，*P<0.05，**P<0.01。如表1所示，蒼術酮組對小鼠急性肺損傷有一定的抑制率，證明蒼術酮對小鼠急性肺損傷有明顯的抑制作用。試驗例2、蒼術酮對急性肺損傷小鼠死亡的保護作用雄性ICR小鼠，分為正常對照組、急性肺損傷模型組，利巴韋林療組和藥物治療組(每組20只)。在造模2小時后，試驗組中蒼術酮或利巴韋林采用灌胃給藥，每日1次共5天。模型對照組小鼠，在相同的時間間隔給予生理鹽水。每日觀察所有小鼠的存活情況。共觀察14天。實驗結果見表2。表2、蒼術酮對急性肺損傷小鼠死亡的保護作用組別劑量(mg/kg)存活數(shù)/總數(shù)生存率(%)MDD±S.D.壽命延長率(%)正常組-20/20100.014.0±0.0**-模型組-3/2015.07.9±2.8-利巴韋林組5010/2050.011.1±3.1**40.5蒼術酮組4014/2070.012.4±2.6**57.0蒼術酮組2011/2055.011.2±3.3**41.8蒼術酮組106/2030.09.3±3.6**17.7MDD，感染到死亡的平均天數(shù)。與模型相比較**P<0.01。如表2所示，蒼術酮組能夠降低急性肺損傷小鼠的死亡率，延長小鼠平均生存時間；證明蒼術酮對急性肺損傷小鼠死亡有明顯的保護作用。試驗例3、蒼術酮對急性肺損傷小鼠血清IFN-β、IL-6、TNF-α和IL-1β的影響雄性ICR小鼠，分為正常對照組、模型組，利巴韋林療組和藥物治療組(每組24只)。在感染2小時后，試驗組中蒼術酮或利巴韋林采用灌胃給藥，每日1次共5天。經(jīng)過5天的治療，測定動物體重后處死動物。采集血標本，離心3000×g共20分鐘分離血清，儲存于4℃待檢。血清IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。實驗結果見表3。表3、蒼術酮對急性肺損傷小鼠血清細胞因子的影響與模型組相比較，*P<0.05，**P<0.01。如表3所示，蒼術酮組顯著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性細胞因子的水平(IL-6、TNF-α和IL-1β)。試驗例4、蒼術酮對急性肺損傷小鼠肺組織病理的影響實驗結束處死動物后，將小鼠的全肺切除。每個肺的一部分被解剖和固定在10%中性福爾馬林緩沖溶液中。其余肺組織快速冷凍保存在-80℃用于生化檢測。固定組織常規(guī)處理，石蠟包埋，切成4μm切片，根據(jù)標準流程進行脫蠟和水化。所有的組織切片進行HE染色，結果見圖1。如圖1所示，HE染色顯示與模型對照組相比較，蒼術酮治療組肺組織肺泡明顯，細胞相對較完整，炎性介質(zhì)滲出減少，肺細胞間隔增厚較輕，細支氣管上皮柱狀細胞脫落減少；說明蒼術酮治療后顯示肺組織學損傷得到了明顯改善，這些作用呈現(xiàn)劑量依賴性。試驗例5、蒼術酮對急性肺損傷小鼠肺組織TLR7信號通路的調(diào)控小鼠肺組織采用Trizol試劑進行勻漿和提取總RNA(BiotechnologyCo.，Ltd.，上海，中國)。根據(jù)試劑盒提供的操作說明，合成cDNA(Takara公司，大連，中國)。本研究使用的特異性引物(TLR-7、MyD88、TRAF6、IFN-β和18sRNA)見表4。這些引物由上海生工公司(中國)合成。選擇真核細胞的18SrRNA作為研究對象的看家基因。擴增反應體系含有2μLcDNA、0.5μL正向和反向引物(終濃度每0.5μM)、12.5μL2×SYBRGreen，無核酸酶的水，反應體積為25μL。擴增反應的條件為：95℃1分鐘，然后40個循環(huán)，95℃變性10s，55℃退火25s，64℃延長25s，然后64℃延長25s采集熒光數(shù)據(jù)。使用2-ΔCt×106方法計算基因的相對表達水平。Westernblot檢測采用RIPA試劑分離肺組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠中蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，加Odysseyblockingbuffer封閉，加入1抗(NF-κBp65，工作濃度1:1000)，4℃下?lián)u床振蕩過夜，洗滌后加入2抗反應。洗滌后將膜置于Odyssey儀器上掃描、分析，使用內(nèi)參照β-actin校正目標蛋白表達量。試驗結果見圖2，如圖2（A）所示的基因檢測結果發(fā)現(xiàn)TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表達顯著上調(diào)，這表明上述信號途徑被激活。如圖2（B）所示的Westernblot分析結果顯示，蒼術酮治療后，TLR7下游因子中最重要的炎癥蛋白NF-κBp65蛋白表達明顯增加(P<0.01)。表4、RFQ-PCR檢測引物序列從本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，蒼術酮治療能夠降低急性肺損傷小鼠的死亡率，延長小鼠平均生存時間；能夠顯著抑制急性肺損傷小鼠的肺指數(shù)，HE染色顯示與模型組相比較，治療組肺組織肺泡明顯，細胞相對較完整，炎性介質(zhì)滲出減少，肺細胞間隔增厚較輕，細支氣管上皮柱狀細胞脫落減少；說明蒼術酮治療后顯示肺組織學損傷得到了明顯改善，這些作用呈現(xiàn)劑量依賴性。對血清中干擾素-α、IL-1β、IL-6和TNF-α水平檢測發(fā)現(xiàn)，蒼術酮顯著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性細胞因子的水平(IL-6、TNF-α和IL-1β)?；驒z測結果發(fā)現(xiàn)TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表達顯著上調(diào)，這表明上述信號途徑被激活。Westernblot分析結果顯示，蒼術酮治療后，TLR7下游因子中最重要的炎癥蛋白NF-κBp65蛋白表達明顯增加(P<0.01)。綜合這些結果表明，蒼術酮在治療急性肺損傷中的作用，依賴于TLR7信號通路的激活，誘導I型干擾素的生產(chǎn)和NF-κBp65的抑制。從本發(fā)明藥理及活性實驗結果來看，蒼術酮能夠明顯減輕了急性肺損傷小鼠的肺部炎癥，減少動物的死亡；其作用與其激活TLR7誘導I型干擾素的生成、抑制NF-κB的激活密切相關。這些結果表明，蒼術酮可用于制備治療急性肺損傷的有效藥物，具有良好的應用前景和應用價值。當前第1頁1 2 3